Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы транспортные системы центральной нервной системы
Транспорт через гематоэнцефалический и гематоликворный барьеры
Создание гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к BSAT1, получение
Пассивная диффузия
Транспор с помощью носителя (транспортер-опосредованный перенос)
Эндоцитоз
Активный транспорт
Функциональная экспрессия транспортеров на сайтах гематоэнцефалического барьера
Семейство АВС-транспортеров
Р-гликопротеин Белок BCRP / Bcrp
Белки множественной лекарственной устойчивости (MRPs / Mrps) Суперсемейство SLC транспортеров
Транспортеры органических анионов OATs / Oats Транспортеры органических катионов OСTs / Oсts
Транспортеры органических анионных полипептидов OATPs / Oatps BSAT1 (blood-brain barrier-specific anion transporter 1)
ГЛАВА 2. Материалы и методы
Характеристика исследуемого материала
Культура клеток миеломы мышей линии Balb/C Sр2/0-Ag14 Культура клеток глиомы С6 крысы
Животные Культуры клеток
Получение первичной культуры церебральных эндотелиоцитов крысы
Получение первичной культуры астроцитов неонатального мозга крысы
Получение первичной культуры эндотелиоцитов пуповины человека (HUVEC)
Подготовка субстрата для культивирования эндотелиальных клеток
Совместное культивирование эндотелиоцитов с астроцитами
моноклональных антител и их характеристика
Получение препарата рекомбинантного антигена BSAT1 Получение моноклональных антител к BSAT1 и их характеристика
Проведение иммунизации
Процедура слияния 11 11
Подготовка клеток фидерного слоя
Процедура клонирования гибридом
Замораживание и хранение гибридом
Получение асцитов и очистка моноклональных антител
Определение класса иммуноглобулинов моноклональных антител
Методы иммунохимического анализа
Иммуноферментный анализ
Иммуноморфологический анализ
Иммунофлюоресцентный анализ
Иммуноцитохимический анализ
Методы количественного определения белка
Иммуногистохимический анализ Конъюгация антител с флуорофором Конъюгация антител
Приготовление наногелей, конъюгированных с анти-BSAT1-антителами Исследование когнитивных функций у крыс
Тест распознавания нового объекта
Тест спонтанного чередования
Тест пассивного избегания
Приподнятый крестообразный лабиринт
Тестирование в лабиринте Морриса
Моделирование интракраниальной глиомы
Статистическая обработка полученных результатов
Результаты собственных исследований
ГЛАВА 3. Получение моноклональных антител к рекомбинантному экстраклеточному домену специфического транспортера органических анионов церебральных эндотелиоци-тов и изучение их иммунохимических свойств
ГЛАВА 4. Иммуноморфологический анализ органной, тканевой и клеточной локализации BSAT
ГЛАВА 5. Изучение влияния анти-BSAT1-антител на когнитивные функции беременных крыс и их потомства
ГЛАВА 6. Исследование распределения меченных I125 и AlexaFluor 660 анти-BSAT1-антител in vivo и оценка перспектив применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем экспериментальную глиому 101
Выводы
Список литературы
- Транспор с помощью носителя (транспортер-опосредованный перенос)
- Получение первичной культуры церебральных эндотелиоцитов крысы
- Процедура клонирования гибридом
- Статистическая обработка полученных результатов
Транспор с помощью носителя (транспортер-опосредованный перенос)
АВС гены классифицируются либо как полный транспортер, либо как половина транспортера с полным транспортером, демонстрирующим прототип двух трансмембранных доменов и двух нуклеотид-связывающих домена. Половина транспортеров содержат только один трансмембранный домен и один нуклеотид-связывающий домен, которые, предположительно, гомо- или гетеродимеризуются для повышения функциональности [132].
Все ABC члены суперсемейства обладают тремя высококонсервативными мотивами, известными как мотивы Walke rA, Walker B и ABC signature C motif (т.е., ALSGGQ) [125, 335]. Точная роль последовательностей ABC signature C неизвеста, хотя высказано предположение, что этот домен может участвовать в распознавании субстрата или гидролиза АТФ [175]. Гидролиз АТФ для АВС транспортеров требуется в качестве источника биологической энергии для транспорта веществ в одном направлении через мембраны против градиента концентрации [65, 328]. Члены подсемейства ABCA играют роль в трафике фосфолипидов (т.е. холестерин) через плазматические мембраны. Потеря функций этими транспортерами может привести к развитию дислипидемии. Например, потеря функций в результате мутации в ABCA1, играющем ключевую роль в реверсивном транспорте холестерина, приводит к развитию болезни Танжера [64, 251]. Болезнь Танжера - аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся тяжелой недостаточностью липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А, а также накоплением сложных эфиров холестерина во всем теле [64, 227].
При некоторых офтальмологических заболеваниях, включая болезнь Штар-гардта, рецессивный пигментный ретинит и рецессивная конусная дистрофия, обнаружены варианты мутаций гена ABCA4, который локализован в центральных фоторецепторах. ABCB подсемейство состоит из 11 членов, которые отвечают за транспорт различных растворенных веществ, таких как лекарственные препараты, пептиды, фосфатидилхолин и железо [64].
Одним из наиболее хорошо изученных членов ABCB подсемейства является Pgp, основной участник фенотипа MDR, который участвует в клеточном эффлюксе ле карственных препаратов. Другие члены ABCB подсемейства – белок-транспортер экспорта солей желчных кислот, более известный как BSEP транспортер (ABCB11) и транспортеры, ассоциированные с процессингом антигена 1 и антигена 2 (TAP1 и TAP2, также известные как ABCB2 и ABCB3, соответственно). Мутации в ABCB генах были обнаружены при различных заболеваниях, включая прогрессирующийсе-мейный внутрипеченочный холестаз, анкилозирующий спондилит, инсулин-зависимый сахарный диабет и целиакию [64]. Существуют 13 членов ABCC подсемейства, функции которых заключаются в ионном транспорте и сигнальной транс-дукции [64]. Повреждение и / или потеря функций этих транспортеров происходит в результате различных патофизиологических состояний, включая гиперинсулинемиче-скую гипокликемию (ABCC8) [88, 98] и синдром Дубина-Джонсона (ABCC2) [305]. Кроме того, муковисцидоз в результате нарушения функции хлорид-ионных каналов при мутации гена CFTR transporter (ABCC7) [57]. MRP/Mrp изоформы также являются членами ABCC подсемейства и связаны с развитием фенотипа MDR [64]. ABCC семейство также включает рецепторы сульфонилмочевины (СУР) 1 и 2 типов, а также урезанный белок, который не является медиатором транспортеров (ABCC13) [64]. ABCD подсемейство состоит из 4 генов (ABCD1-4), которые кодируют половину транспортеров, найдены исключительно в пероксисомах. Члены семейства ABCD, как считается, участвуют в перевозке коэнзима-А длиноцепочечных жирных кислот [307]. Мутация ABCD1 гена приводит к сцепленному с Х-хромосомой заболеванию – адренолейкодистрофии, которая характеризуется прогрессирующей демиелинизаци-ей, нарастанием когнитивных нарушений, потерей зрения, слуха, двигательными нарушениями [43]. В отличие от других ABC подсемейств, ABCE и ABCF подсемейства содержат гены, содержащие нуклеотид-связывающие домены, но не кодируют трансмембранные домены. Белок OABP является единственным известным членом ABCE подсемейства, отвечающим за распознавание олигоаденилата, который продуцируется при вирусных инфекциях [292]. Функция ABCF1-3 не была в полной мере охарактеризована, однако, было установлено, что hABCF1 может являться частью ри-босомального комплекса [64]. ABCG подсемейство человека состоит из шести транспортеров, которые включают в себя ABCG2, также известном как BCRP / Bcrp. BCRP / Bcrp играет важную роль в создании MDR фенотипа и является, как известно, транспортером некоторых лекарственных препаратов. Другие члены ABCG подсе-18
мейства включают ABCG1, ABCG5, и ABCG8, участвующих в перевозке стеринов, таких как холестерин [289]. В ЦНС наиболее изученными членами суперсемейства АВС являются P-gp, изоформы MRP / Mrp и BCRP / Bcrp (рисунок 1.4.), поскольку известно, что они играют важную роль в ограничении поступления лекарственных препаратов в ткань мозга, тем самым снижая эффективность фармакотерапии при лечении неврологических заболеваний [238, 328].
Получение первичной культуры церебральных эндотелиоцитов крысы
Транспортеры органических анионов OATs / Oats OATs / Oats являются членами суперсемейства 22 SLC (SLC22A) [164]. В настоящее время к членам семейства OATs / Oats относятсятся OATs / Oats 1-6 и ре нальный специфический транспортер (RST) [4, 7, 11, 14, 18, 34, 44, 163, 184, 202, 215, 271]. OAT классифицируются в соответствии от потребности в энергии: Na+ зависимые, Na+-независимые и АТФ-зависимые [168, 261]. Эти транспортеры опосре дуют прохождение органических анионов через биологические мембраны. Субстра тами OATs / Oats являются различные эндогенные и экзогенные молекулы, такие как простагландины, гормоны, анионные метаболиты нейромедиаторов, а также лекар ственные препараты и связанные с ними метаболиты [41, 78, 159, 217, 238]. Субстра ты OATs / Oats, как правило, обладают отрицательным зарядом при физиологических рН и в связи с этим требуют специальной транспортной системы длч пересечения
биологических мембран. Прототипом OATs / Oats субстрата является p aminohippurate (РАН), органический анион с низкой молекулярной массой. OATs / Oats имеет широкий субстратный профиль и способен транспортировать небольшие амфифильные органические анионные соединения различной химической структуры, незаряженные молекулы и некоторые органические катионы [78, 238].
Мембранная топология OATs / Oats включает в себя 12 трансмембранных -спиралей и несколько гликизилированных и PKC участков, которые расположены на внеклеточных петлях, соединяющих 6 и 7 спирали [78, 261]. OATs / Oats экспресси-рован, прежде всего в эпителиальных тканях (почки, печень), но также представлен в мозге в сосудистом сплетении и в микроциркуляторном русле головного мозга [34, 44, 163, 203, 271, 329].
OAT1 / Oat1 слабо экспрессирован в ткани мозга [38, 91, 170, 219, 240]. Белок OAT2 синтезируется в печени и мозге; однако, мРНК Oat2 была обнаружена только в сосудистом сплетении крыс [39, 54, 163, 262]. В отличие от этого, OAT3 / Oat3 является наиболее представленной в ткани мозга изоформой OAT / Oat. Oat3 является транспортером РАН, сульфата эстрона, таурохолата, охратоксина, бензилпеницилли-на, циметидина, ранитидина [164, 209, 284]. Исследования показали, что Oat3 играет важнейшую роль в транспорте анионных нейромедиаторных метаболитов адреналина, норадреналина, дофамина, серотонина [163]. Oat3 локализуется на апикальной мембране эпителиальных клеток сосудистого сплетения, где он выступает посредником проникновения субстратов в сосудистое сплетение и из СМЖ [284]. Oat3, как известно, локализован в базолатеральной мембране и может присутствовать на апикальной мембране эндотелиальных клеток капилляров головного мозга крыс [145]. Экспрессия Oat3 на апикальной и базолатеральной мембранах делает возможной транспорт лекарственных веществ Oat3 субстратов как из крови в мозг, так и из мозга в кровь. Таким образом, эта семейство транспортеров может быть потенциальной мишенью для увеличения доставки лекарственных препаратов в ЦНС. Известно, что белок OAT4 / Oat4 может экспрессироваться в ГЭБ и BCSF барьере, но точная локализации до настоящего момента не была подтверждена. мРНК Oat4 обнаружен в эпителиальных клетках сосудистого сплетения [325]. Экспрессия OAT4 также была выявлена в клетках эндотелия микрососудов мозга человека, но только на уровне мРНК [161]. Oat4-обусловленный транспорт характеризуется как двунаправленный и натрий-независимый. Исследования показали, что Oat4 участвует в транспорте про-стагландинов [146]. Другие субстраты относятся к сульфату эстрона и охратоксина А [17, 44]. В настоящее время нет никаких свидетельств того, что существует экспрессия OAT5 / Oat5 и / или OAT6 / Oat6 в ткани мозга [202, 329].
Транспортеры органических катионов OСTs / Oсts Органические катионы имеют временный или постоянный положительный заряд и, следовательно, не способны в какой-либо заметной степени проникать через биологические мембраны. Такие вещества требуют определенные транспортные механизмы, позволяющие им проходить через биологические мембраны и накапливается внутри клетки [152, 202, 261]. Выявленные транспортеры органических катионов (OCTs) являются членами суперсемейства SLC22A [141] и подразделяются на две группы в соответствии с их возможностями к транспортировке. Олигоспецифические транспортеры органических катионов облегчают транспорт одного основного субстрата и / или его аналога. Эта категория OCTs включает Na+ кo-транспортеры нейромедиаторов, высокоаффинных транспортеров тиамина (витамина В1) и транспортеров холин (предшественника ацетилхолина) [331]. Полиспецифические OCTs транспортируют органические катионы с различной химической структурой [73, 151, 152]. Системы OCTs дополнительно характеризуются либо как потенциал-чувствительные органические катионные транспортеры (OCTs), либо как H+ градиент-зависимые оригинальные органические транспортеры (OCTNs). OCTs включают в себя транспортные системы OCT / Oct1-3, а OCTN / Octn транспортные системы включают в себя OCTN1-3 человека и Octn1-3 грызунов [104, 110, 111]. Таким образом, OCTs / Octs участвуют в притоке в клетки катионных субстратов [110, 300], а OCTNs / Octns являются посредниками клеточного эффлюкса различных катионных веществ [56, 300].
Члены семейства OCT / Oct в своей структуре имеют 12 -спиральных трансмембранных домена с внутриклеточными N и C-терминалями. Кроме того, предположительно мембраны включает в себя большую внеклеточную петлю между TM1 и TM2, который содержит несколько N-гликозилированных участков и небольшую межклеточную петлю, соединяющею TM6 и ТМ7. C-конец содержит несколько последовательных участков киназо-зависимого фосфорилирования [56, 151, 222]. OCT / Oct1-3, в основном, локализуются на базолатеральной мембране поляризованных клеток, в том числе на клетках эндотелия микрососудов и эпителиальных клетках сосудистого сплетения. мРНК OCT1 и белок экспрессируются в эндотелиальных клетках мозга человека (cmec/D3), где OCT1 выступает посредником транспорта ла-мотриджина, противоэпилептического препарата [67]. В отличие от OCT1/Oct1, OCT2/Oct2 представлен в ЦНС на различных структура, таких как нейроны, сосудистое сплетение и корковые астроциты. В нейронах OCT2 опосредствует транспорт нейромедиаторов, таких как серотонин, дофамин и норадреналин [40, 113, 272]. OCT3/Oct3 экспрессируется в различных тканях организма, включая мозг [112, 142, 321]. В ЦНС, экспрессия мРНК Oct3 выше, чем Oct1 и Oct2 [323]. Oct3 был обнаружен у грызунов в нейронах и сосудистом сплетении [142, 156, 257], где он выступает посредником транспорта тетраэтиламминия (ТЕА), дофамина, серотонина и амфетаминов [323]. В дополнение к транспорту эндогенных органических катионов, OCTs/Octs могут играть определенную роль в распределении препаратов в ЦНС. Например, в исследованиях in vitro с применением иммортализованных эндотелиаль-ных клеток капилляров головного мозга (TR-BBB13) выявлена роль транспортера органических катионов в поглощении оксикодона клетками [220].
Процедура клонирования гибридом
Очищенные плазмидные ДНК, содержащие вставки без ошибок, обрабатывали соответствующими рестриктазами, подвергали разделению в геле с помощью электрофореза, вырезанные фрагменты экстрагировали из геля с помощью набора «SVGel&PCRClean-UpSystem» (Promega). Очищенные таким образом фрагменты кДНК лигировали с расщепленными по тем же сайтам плазмидными ДНК pQE30 (BamHI + Hindlll) pCBDQ (Bglll + Hindlll), лигазной смесью трансформировали клетки E.coliSG13009 (Qiagen) и высевали на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл карбенициллина, 25 мкг/мл канамицина. Полученные колонии подвергали скринингу с помощью ПЦР на предмет присутствия вставки в правильной ориентации и положительные клоны использовали для дальнейшей работы.
Продукция BSAT134Q и BSAT134CBD в бактериях, выделение, очистка и анализ с помощью электрофореза в ПААГ
Положительные клоны культивировали при перемешивании в жидкой среде LB при +37 С, содержащей 50 мкг/мл карбенициллина, 25 мкг/мл канамицина до достижения оптической плотности (600 нм) 0,7-0,9; затем добавляли ИПТГ до концентрации 1 мМ и инкубировали в тех же условиях еще 4 часа. Затем клетки осаждали при 3000g 20 мин, замораживали и хранили при -70 С.
Выделение белков осуществляли в денатурирующих условиях на Ni-NTA-агарозе, согласно протоколу, рекомендованному фирмой Qiagen. Клетки, выращенные в объеме 50-200 мл культуры, размораживали при комнатной температуре 10 мин, ресуспендировали в 5 мл раствора «В» (8М мочевина, 0,1 М Na-фосфат, 0,01 М Трис-HCl, рН 8,0) на 1 г сырого веса и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Лизат центрифугировали (15000 об/мин, 15 мин при 5, ротор JA-20), собирали супернатант, к которому добавляли 2 мл 50% Ni-NТА-агарозы, инкубировали 45-60 мин, периодически встряхивая. Затем суспензию переносили в колонку, промывали 15 мл раствора В, 20-30 мл раствора С (раствор В, рН 6,3), после чего элюировали 2-3 мл элюирующего раствора (В, содержащий 250 мМ имидазола). Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд и, в зависимости от его выхода, проводили повторную элюцию. Полученные препараты белков анализировали электрофорезом в ПААГ. Получение гибридных клеток, продуцирующих моноклональные анти-BSATl-антитела.
Для проведения цикла иммунизации для последующего слияния и получения гибридом, а также для получения асцитической жидкости отбирали самок мышей линии Balb/C в возрасте 6-7 недель с весом 25-30 г.
Иммунизацию самок мышей линии Balb/С полученным препаратом рекомбинантного BSAT1 проводили по следующей схеме:
Высокоочищенный препарат рекомбинантного BSAT1 в количестве20 мкг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) (в соотношении 1:1) вводили подкожно в область околошейных лимфатических узлов, подушечки лап, а также лимфатических узлов брюшной цепочки.
Иммунизацию повторяли на 9 и 18 сутки тем же препаратом антигена в том же количестве, подкожно в область околошейных лимфатических узлов, подушечки лап, а также лимфатических узлов брюшной цепочки.
На 27 сутки вводили 10 мкг высокоочищенного препарата антигена в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (в соотношении 1:1) в область лимфатических узлов брюшной цепочки, околошейных лимфатических узлов, подушечки лап.
Высокоочищенный препарат антигена в количестве 20 мкг в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (в соотношении 1:1) вводили подкожно в область околошейных лимфатических узлов, подушечки лап, а также лимфатических узлов брюшной цепочки.
Повторное введение высокоочищенного препарата антигена в количестве 10 мкг повторяли на 9 сутки в том же количестве, подкожно в область околошейных лимфатических узлов, подушечки лап, а также лимфатических узлов брюшной цепочки.
Через 4 дня после проведения последней инъекции проводили забор крови из хвостовой вены и определяли уровень анти-BSATl-АТ с помощью иммуноферментного анализа. При обнаружении адекватного титра антител за 3 - 4 дня до извлечения селезенки последнее введение препарата BSAT1 в количестве 25 мкг осуществляли внутривенно (в 0,01 М Na-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, рН 7,3).
Плазмоцитомные клетки. Перед слиянием миеломные клетки линии Sp2/0-Ag14 культивируют в среде с добавлением 8-азагуанина для удаления ревертантных клеток, содержащих «нормальный» уровень ГГФРТ и, которые, подобно гибридным, способны расти в среде НАТ.
После проведения селекционного удаления ревертантных клеток с применением 8-азагуанина, проводили трехкратную отмывку клеток Sp2/0-Ag14 центрифугированием (1000 g, 4 минуты) в среде RPMI-1640. Процедура слияния. Проведение процедуры слияния осуществляли в стерильных условиях. Иммунизированную мышь забивали путем декапитации, и выделяли селезенку, которую затем помещали в чашку Петри, с охлажденной культуральной средой RPMI-1640. Селезенку измельчали скальпелем на кусочки размером 2-3 мм, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе со средой RPMI-1640. Образовавшийся гомогенат центрифугировали (1000 g, 4 минуты), осажденные клетки ресуспендировали в 5 мл холодной среды RPMI-1640. После этого клетки осаждали центрифугированием (1000 g, 10 минут; 5804 R «Eppendorf», Германия), определяли их количество и оценивали жизнеспособность.
Подготовленные плазмоцитомные клетки смешивали с клетками селезенки (соотношение клетки линии Sp2/0-Ag14 : клетки селезенки составляло 2 : 1, соответственно). Полученную смесь однократно отмывали в ростовой среде RPMI-1640 и осуществляли процедуру слияния.
К смеси клеток при постоянном перемешивании в течение 60 секунд по каплям добавляли 1,0 мл раствора «PEG/DMSO Hybri-Max», («Sigma», USA, № Р 7306). После чего клетки инкубировали в течение 90 секунд. К полученной суспензии в течение 5 минут по каплям добавляли 10 мл среды DMEM без сыворотки, затем в течение 2 минут – 10 мл этой же среды, затем по каплям доводили общий объем до 50,0 мл этой же средой. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 30 мл ростовой среды DMEM с добавлением 20 % FCS.
Статистическая обработка полученных результатов
Достоверно более высокое, по сравнению с контрольными иммуноглобулинами, накопление моноклональных анти-BSAT1-АТ наблюдалось в ткани глиальной опухоли (0,261 ± 0,064 % введенной дозы / г для анти-BSAT1-АТ и 0,095 ± 0,014 % введенной дозы / г для IgG мыши). Необходимо отметить, что аналогичное накопление анти-BSAT1-АТ по сравнению с IgG мыши наблюдалось в яичниках (0,259 ± 0,025 и 0,106 ± 0,007 % введенной дозы / г, соответственно). Полученные результаты полностью согласуются с предварительно полученными данными по анализу органной локализации анти-BSAT1-АТ.
Направленный транспорт контейнерных систем на основе моноклональ-ных анти-BSAT1-АТ в экспериментальную глиому 101/8.
Накопление специфических анти-BSAT1-АТ в области глиомы, превышающее более чем в 20 раз накопление неспецифических IgG мыши, дает основания предпо 136 ложить, что моноклональные антитела к BSAT1 могут быть использованы в качестве вектора при создании систем направленного транспорта в область глиом.
Хорошо известно, что эффективность фармакологических препаратов центрального типа действия определяется по возможности проникновения лекарственного вещества их системного кровотока в ткань мозга. Этот фактор зависит о преодоления гематоэнцефалического барьера, одними из основных клеточных компонентов которого являются эндотелиоциты капилляров мозга. В связи с особенностями морфологического строения этого типа клеток – наличия плотных межклеточных контактов и отсутствие межклеточных пор, подавляющее большинство химических веществ практически не способно проникать через барьер. В связи с этим, проводились поиски различных веществ, способным проникнуть за пределы ГЭБ [21, 31, 90, 134, 138, 252]. На сегодняшний день в качестве контейнера для доставки множества биологически активных веществ и различных диагностических и лекарственных препаратов используются наноконтейнерные препараты различных видов – липосомы, наноча-стицы, ноногели. Наноконтейнерные препараты довольно широко используются в клинической практике, в частности, в противоопухолевой терапии в связи с тем, что способствуют снижению токсичности лекарственного препарата с одновременным повышением его терапевтического эффекта.
В связи с развитием методов диагностики и химиотерапии были созданы препараты направленного типа действия, обладающие пролонгированными фармакоки-нетическими свойствами и способностью контролируемого высвобождения препаратов в очаге опухоли. В настоящее время одним из классических подходов к пролонгированию циркуляции лекарственных препаратов в крови, уменьшению системной токсичности и улучшению биодоступности, является заключение их в наноконтейне-ры. В мировой литературе приводится множество научных исследований, посвященных разработке препаратов напраравленного типа действия – липосом, мицелл, нано-гелей и наночастиц [224]. При проведении конъюгации наноконтейнерных препаратов с моноклональными антителами к антигенам клеток опухолевой ткани и периту-моральной зоны, такие наноконтейнеры приобретаю векторные свойства. В качестве перспективного антигена с целью доставки лекарственных и диагностических препаратов к клетам глиомы можно рассмотривать и цереброспецифический анионный транспортер (BSAT1).
Как было показано при предыдущих исследованиях, моноклональные анти-BSAT1-АТ при системном введении обладают способностью специфически накапливаться в очаге глиомы и, тем самым, повышать селективность наноконтейнерного препарата к клеткам опухоли.
В связи с этим, на следующем этапе исследования проводилось изучение терапевтической эффективности химиопрепарата цисплатин, заключенного в нанокон-тейнер на моделях глиомы С6 и глиомы 101/8.
В качестве векторного наноконтейнера применяли векторные наногели, любезно синтезируемые к.х.н. Нуколовой Н.В. и соавт. [21, 216].
Наногели представляют собой набухшую пространственную структурную сеть полимеров, которая способна сохранять форму и стабилизирована в результате межмолекулярных взаимодействий или химических связей (ковалентные сшивки). Нано-гели позволяют конструировать системы доставки лекарственных средств с контролируемым «спусковым механизмом» высвобождения лекарств из наноконтейнера в ответ на изменения окружающей среды. Кроме того, наногели могут быть модифицированы различными векторными группами, которые способствуют избирательной направленной доставке БАВ в определенные органы или клетки-мишени. Способ приготовления биодеградируемых биогелей описан в главе 2.
Для проведения исследований по терапевтическому эффекту векторных нано-гелей, мы использовали крыс с экспериментальной глиомой 101/8.
Глиома крысы 101/8 была получена в 1967 г. путем имплантации твердой пилюли диметилбензантрацена в мозжечок самки крысы Вистар [342]. Клетки глиомы 101/8 поддерживались в коллекции НИИ МЧ РАМН с помощью интрацеребральных пассажей, часть клеток находилась в глубокой заморозке в жидком азоте. При экспериментальном моделировании опухоль имеет признаки глиобластомы (high grade gli-oma) и по своим характеристикам (высокая пролиферативная активность, выраженная васкуляризация и некротизация ткани, склонность к инвазии) близка к глиобластоме человека и является наиболее адекватной моделью для проведения экспериментальной химиотерапии [278]. Таким образом, глиобластома 101/8 с одной стороны, является альтернативной моделью мультиформной глиобластомы человека [342], а, с другой стороны, данная глиобластома, несмотря на более злокачественный, чем у глиомы С6 рост и меньшую продолжительность жизни животных, более чувствительна к лечению платина-содержащими цитостатиками. Вследствие этого данная экспериментальная модель и была выбрана в качестве модели для испытаний наноконтейнерных форм цисплатина.
На первом этапе эксперимента, до проведения исследований in vivo, проводили исследование цитотоксичности (рисунок 6.6.) полученных наногелей в условиях in vitro на культуре клеток глиобластомы 101/8 с помощью MTS реагента («Invitrogen», США).
Для определения цитотоксичности в монослой клеток глиобластомы 101/8 в убывающей концентрации, начиная от 1 мг/мл, вносили растворы наногеля. Оценку жизнеспособности клеток проводили через 48 часов после внесения препарата на планшетном анализаторе Enspire (Perkin Elmer).
При проведении MTS-тест было показано, что LD50 для свободного цисплати-на составляет 62 мкг/мл. Процедура введения цисплатина в наноконтейнер позволяет повысить LD50 в 2,5 раза. Последующая конъюгация наноконтейнеров с монокло-нальными анти-BSAT1-АТ увеличивало специфическую цитоксичность по отношению к глиомным клеткам в 1,5 раза.
На следующем этапе исследования проводили анализ специфического захвата векторных наноконтейнеров клетками глиобластомы 101/8 в условиях in vitro. Для этого, проводили мечение наногелей с помощью сукцинимидного эфира красителя AlexaFluor 488 («Invitrogen», США) и оценивали динамику захвата наногелей с помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа. Перед внесением векторных наногелей, клетки глиобластомы 101/8 метили с помощью ацидофильного флюоресцентного лизотреккера («Promega», США). Таким образом, было продемонстрировано, что при внесении векторных наногелей в концентрации 1 – 20 мкг/мл по общему белку происходит проникновение их внутрь клеток глиобластомы 101/8.
