Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 5
Индуцированные абзимы 5
Природные каталитические антитела 19
Антиидиотипические антитела 38
Заключение 55
Материалы и методы 57
Химические реактивы и материалы 57
Базовые методы 58
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli 59
Получение рекомбинантных клонов вируса AcMNPV 60
Аналитическая экспрессия гликопротеина gpl20 61
Препаративная экспрессия, выделение и очистка гликопротеина gpl20 62
Подготовка образца для масс-спектрометрии методом MALDI 62
Триптический гидролиз для масс-спектрометрического анализа 63
Масс-спектрометрия методом MALDI 63
Масс-спектрометрический анализ продуктов распада trx-gp 120I-III по методу SELDI 63
Синтетический антиген 64
Иммунизация мышей 64
Проточная цитофлуориметрия 65
Выделение и очистка антител 65
Иммуноферментный анализ 65
Получение флуоресцентных субстратов gpl20-<№TU, и БСА-ФИТЦ66 Анализ продуктов гидролиза gpl20 при помощи ДСН-ПААГ и иммуноблоттинга 68
Детекция гидролиза рибонуклеазы А антителом 6В8Е12 68
Результаты 70
Получение каталитических антител, расщепляющих поверхностный гликопротеин ВИЧ-1 gpl20 70
Получение слитных белков на основе фрагментов gpl20 для иммунизации и изучения свойств антител. Прокариотическая экспрессия 73
Экспрессия gpl20 в бакуловирусной системе 80
Каталитические свойства полученных антител 85
Установление сайт-специфичности протеолитических антител к gpl20 89
Антиидиотипическое протеолитическое антитело 6В8Е12 93
Обсуждение результатов 103
Выводы 106
Список литературы 107
Список сокращений 127
- Природные каталитические антитела
- Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli
- Масс-спектрометрический анализ продуктов распада trx-gp 120I-III по методу SELDI
- Получение слитных белков на основе фрагментов gpl20 для иммунизации и изучения свойств антител. Прокариотическая экспрессия
Введение к работе
Сложные химические превращения, регулирующие жизненно важные процессы, в большинстве своем являются каталитическими и происходят при участии высокоспецифичных и эффективных биокатализаторов - ферментов. В последние годы с помощью методов генетической инженерии и направленной химической модификации удалось создать ферменты с измененными свойствами. На этом поиск новых биокатализаторов не прекратился. В ряду каталитически активных молекул особое место занимают рибозимы - каталитические РРЖ, и абзимы - каталитические антитела.
Антитела представляют собой белковые молекулы, способные взаимодействовать с высокой специфичностью практически со всеми природными или синтетическими антигенами. Разнообразие антител, в отличие от ферментов, практически не лимитировано. По некоторым подсчетам оно составляет 10 вариантов, что обеспечивает очень широкий репертуар специфических «биополимерных матриц», способных распознавать как низко-, так и высокомолекулярные гаптены. В 1948 году Л. Полинг [1] предположил, что принципиальное различие между антителами и ферментами заключается в том, что первые наиболее специфично взаимодействуют с антигеном в его стабильной конформации (низкоэнергетическом состоянии), тогда как ферменты, наоборот, проявляют максимальную специфичность к высокоэнергетическому переходному состоянию реакции. Таким образом, антитела, узнающие переходное состояние реакции могут проявлять каталитическую активность. В 1969 году Дженкс предложил использовать стабильные аналоги переходных состояний реакций в качестве иммуногенов для получения каталитических антител [2].
Эта идея была экспериментально подтверждена [3] для поликлональных антител к соединениям пиридоксаль фосфата и тирозина в форме восстановленных оснований Шиффа. К сожалению, авторам не удалось
продемонстрировать существенного ускорения. Значительный прогресс в создании абзимов стал возможен после возникновения технологии получения моноклональных антител [4].
Количество реакций, катализируемых антителами, равно как и методик их получения, неуклонно растет. Современная абзимология опирается на синтез разнообразных аналогов переходных состояний реакций, введение кофакторов и каталитических групп в уже существующие антитела, сайт-направленный мутагенез. Большинство известных каталитических антител было получено данными методами, однако, развиваются и альтернативные подходы - получение антиидиотипических антител и реакционная иммунизация.
Метод получения антиидиотипических антител опирается на свойства иммунной системы образовывать антитела "внутреннего образа" и на идиотипическую гипотезу, высказанную в 1974 году Н. Ерни [5]. Первым удачным примером абзима, полученного данным методом, является моноклональное антитело 9А8, связывающее моноклональное антитело, которое в свою очередь связывает активный центр ацетилхолинэстеразы. Было показано, что антитело 9А8 проявляет свойства исходного антигена, то есть обладает ацетилхолинэстеразной активностью [6].
Метод реакционной иммунизации основан на использовании в качестве иммуногена необратимых ингибиторов ферментов. Такие ингибиторы могут образовать стабильный ковалентный комплекс с антителами, катализирующими соответствующую реакцию гидролиза. Этот метод был проверен при успешном отборе рекомбинантных мини-антител, содержащих реакционноспособный остаток цистеина [7] и использован для получения каталитических антител in vivo при иммунизации мышей диалкилфософонатом [8].
Как уже упоминалось, в настоящее время имеются широкие возможности для получения биокатализаторов de novo, основываясь на свойстве гипервариабильности суперсемейства иммуноглобулинов. С
помощью каталитических антител (абзимов) удалось осуществить биокаталитические превращения, для которых нет соответствующих ферментативных аналогов. Особого внимания в современной абзимологии, имеющей как чисто фундаментальные, так и прикладные задачи, заслуживают реакции, субстратами которых являются биополимеры. Проблеме создания протеаз на основе антител и посвящена настоящая диссертация.
Природные каталитические антитела
Относительная легкость получения гидролитических абзимов при помощи иммунизации аналогами переходного состояния естественным образом привела нескольких исследователей к мысли о возможности существования каталитических антител в природных условиях. Первым опубликованным исследованием в этой области явилась работа группы С. Паула, изучавшей биологическую роль вазоактивного интестинального пептида (ВИП) [62]. В крови некоторых пациентов, страдающих астмой, а также ряда здоровых людей, которые испытывали регулярные физические нагрузки, были обнаружены аутоантитела, связывающие ВИП с константами диссоциации порядка 10"7-10"9 М . В случае аутоантител, полученных от пациентов с астмой, наблюдалось более прочное связывание по сравнению с аутоантителами здоровых доноров.
Было показано, что очищенные антитела класса IgG, выделенные из различных сывороток, обладают неодинаковой специфичностью, однако все они гидролизуют пептид между 14-22 аминокислотными остатками. Исследованные аутоантитела не гидролизовали пептиды и белки, отличающиеся по последовательности от ВИП, что указывало на их заметную селективность. В последующей работе авторы разделили легкие и тяжелые цепи аутоантител и показали, что очищенная легкая цепь гидролизует ВИП с удельной активностью в 32 раза большей, чем интактные антитела [63]. Это позволило предположить, что каталитический центр ВИП-аутоантител ассоциирован с легкой цепью.
Для проверки этого утверждения кДНК, соответствующая каталитически активной легкой цепи антитела, была клонирована; полученная рекомбинантная легкая цепь проявляла каталитические свойства [64]. Молекулярное моделирование позволило предположить, что за катализ ответственны аминокислотные остатки, обеспечивающие активность сериновых протеиназ. Последующий сайт-направленный мутагенез протеолитической легкой цепи в целом подтвердил эту гипотезу: замена Ser27, His93 и Aspl на Ala, но не замены Ser26, His27 и Asp28 на Ala, приводили к уменьшению каталитической активности приблизительно в 100 раз и не влияли на связывание легкой цепи с ВИП [65-67]. Так как все три остатка, образующие активный центр антитела, кодированы соответствующим геном зародышевой линии, и кДНК легкой цепи ВИП-гидролизующего антитела кодирует только 4 аминокислотные замены, был проведен сайт-направленный мутагенез клонированной кДНК для получения продукта гена зародышевой линии [67]. Полученный белок обладал практически неизменными каталитическими свойствами, что позволило авторам выдвинуть предположение о том, что протеолитические антитела могут быть отнесены к системе врожденного иммунитета [67]. Последнее является справедливым, по всей видимости, и для белка Бенс-Джонса, возникающего в крови больных миеломой, представляющего собой легкую цепь антитела с неизвестной антигенной специфичностью и обладающего протеолитическими свойствами [68].
Таким образом, природное каталитическое антитело, расщепляющее ВИЛ, было описано в соответствии с современным уровнем исследований в энзимологии.
Практически одновременно с работой лаборатории С. Паула при исследовании сывороток крови пациентов с ревматоидным артритом, склеродермией, системной красной волчанкой (СКВ) были обнаружены анти-ДНК аутоантитела, способные после очистки гидролизовать ДНК [69]. Максимальной способностью гидролизовать ДНК обладали антитела из сывороток больных СКВ - заболеванием, при котором наблюдается наиболее высокий титр анти-ДНК аутоантител [70]. К настоящему моменту присутствие ДНК-гидролизующих антител было выявлено и при ряде других патологий - хроническом лимфолейкозе, пре-В-клеточном лимфолейкозе, остром миелолейкозе и СПИД III-IV стадий [71]; вирусных гепатитах [72]; рассеянном склерозе [73, 74] и тироидите Хашимото [75]. ДНК-гидролизующие антитела также были найдены у мышей линий SJL, MRL/lpr и [NZBxNZW]Fl, обладающих аутоиммунными нарушениями различной природы [76].
Реакция гидролиза ДНК, катализируемая очищенными аутоантителами, оказалась зависимой от присутствия ионов металлов (Mg2+, Мп2+, Са2+) и, соответственно, ингибировалась в присутствии ЭДТА [77]. При использовании в качестве субстрата реакции сверхспирализованной плазмидной ДНК было показано, что аутоантитела катализируют образование одноцепочечных разрывов. Кинетические исследования, проведенные с использованием метода линейного дихроизма, продемонстрировали, что Fab-фрагмент аутоантител обладал очень высокой каталитической эффективностью (Ккат/Км=3.2-1010 М мин"1), близкой к известной для нуклеаз [78].
Поскольку в последующих исследованиях было показано, что ДНК-гидролизующие антитела проявляют кросс-реактивность к ДНК-белковым комплексам [71], можно было предположить, что способность анти-ДНК антител к катализу гидролиза ДНК вызвана их аффинностью к искаженной конформации сахарофосфатного компонента ДНК, возникающей при образовании комплексов ДНК с соответствующими белками. В более строгой форме эта идея была подтверждена обнаружением кросс-реактивности ДНК-гидролизующих антител к компонентам так называемого ядерного матрикса, не содержащим ДНК [79].
Несмотря на отсутствие ясных данных о клональном разнообразии ДНК-гидролизующих антител, обнаружение и детальный молекулярный анализ моноклонального антитела BV 04-01, гидролизующего ДНК [80], позволил описать механизм действия ДНК-гидролизующих антител. При сопоставлении пространственной структуры кристалла комплекса Fab-фрагмента антитела BV 04-01 с олигонуклеотидом (dT)3, предпочтительных сайтов гидролиза одно- и двунитевых молекул ДНК и кинетических данных для рекомбинантных фрагментов BV 04-01, содержащих замену в легкой цепи Tyr32Phe и делецию His27, было показано, что антитело активирует расщепляемую фосфодиэфирную связь путем индукции конформационного изгиба.
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli
Для экспресии белков trx и trx-mbp были использованы следующие условия: подрост в течение 2 часов 45 минут при температуре 30С с последующим добавлением индуктора (ИПТГ) до концентрации 1 мМ и дальнейшая инкубация в течение 2-х часов при температуре 30 С. Для экспресии остальных белков, содержащих домен тиоредоксина в клетках штамма BL21(DE3) была использована концентрация индуктора 0,2 мМ. Для экспрессии белков gpl20I-III и gpl20I-III-mbp ИПТГ использовали с концентрации 1 мМ и вели индукцию 3 часа.
Экспрессию слитного белка trx-gp 120I-III в клетках штамма OrigamiB(DE3) вели при +17С в течение 24 ч без добавления индуктора.
Очистку белков trx и trx-mbp проводили при помощи металлохелатного сорбента Talon SuperFlow (BD Biosciences, Великобритания) по методике производителя сорбента.
Остальные белки, синтезированные в клетках штамма BL21(DE3) выделяли как тельца включения согласно [143], солюбилизировали 7 М раствором мочевины и проводили металлохелатную хроматографию по методикам производителя сорбента. Очищенные целевые белки для целей иммунизации преципитировали диализом против воды; для использования в ИФА диализовали против ФСР, содержащего 0,002% ДСН и стабилизировали добавлением дитиотрейтола до 5 мМ; для получения флюоресцентного субстрата и ДСН-ПААГ анализа продуктов гидролиза диализовали против ФСР, содержащего дополнительно 2 М мочевины и затем против ФСР.
Растворимую форму trx-gp 120I-III, полученную при экспрессии в клетках штамма Origami В (DE3), очищали при помощи металлохелатной хроматографии по методике производителя сорбента, последующего обессоливания и ионообменной хроматографии на колонке Mono Q (Amersham, США) при рН 9,0. Целевой белок элюировали линейным градиентом концентрации NAC1 в диапазоне 0-500 мМ, концентрировали и проводили замену буфера при помощи ультрафильтрации.
Получение рекомбинантных клонов вируса AcMNPV. При получении клонов рекомбинантного бакуловируса использовался набор МахВас 2.0 (Invitrogen, США). Для трансфекции, отбора клонов вируса, получения супернатантов с высоким титром вируса и аналитической экспрессии использовалась линия клеток Sf9, для препаративной экспрессии - High Five (Invitrogen, США). Клетки линии Sf9 культивировались в среде TNM-FH (Invitrogen, США) без добавления антибиотиков, клетки линии High Five - в бессывороточной среде High Five (Invitrogen, США). Котрансфекция проводилась в 40-мм чашках Петри, содержащих 1 млн. клеток с использованием липосом InsectinPlus (Invitrogen, США), соответствующей плазмидной ДНК, и линеаризованной по 3-м сайтам рестрикции ДНК бакуловируса Bac-N-Blue. Контрольная трансфекция проводилась без введения в состав липосом ДНК вируса. Через 4 дня после трансфекции к культуральной среде добавляли X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-Э-галактозид) для детекции активности репортерного гена [3-галактозидазы. Аликвоты культуральной среды из опытных чашек были использованы для дальнейшего отбора рекомбинантных вирусов. Очистку рекомбинантных вирусов проводили методом отбора отдельных окрашенных фаговых бляшек, образующихся в предварительно инфицированной культуре клеток Sf9 при инкубации в твердой среде на основе легкоплавкой агарозы с добавлением хромогенного субстрата X-Gal. Отбор клонов проводили с чашек с разведениями 10-3 и 10-4 на 5-ый - 7-ой день инкубации. Полученные фаговые бляшки были использованы для инфицирования клеток в лунках 12-луночных планшетов. Из супернатантов культуральной среды, отобранных из лунок через 72 часа, были выделены препараты вирусной ДНК и проверены путем ПЦР с использованием праймеров, соответствующих последовательностям вирусной ДНК и гена-вставки. Были отобраны клоны рекомбинантных вирусов, не содержащие контаминации диким типом бакуловируса. Среду из лунок, содержащих только рекомбинантный вирус, собрали и в дальнейшем использовали для создания стоковых растворов бакуловируса с высоким титром в соответствии с методиками производителя набора. Полученные стоковые растворы индивидуальных клонов рекомбинантных вирусов были оттитрованы путем подсчета отдельных фаговых бляшек, образующихся в предварительно инфицированной культуре клеток Sf9 при инкубации в твердой среде на основе легкоплавкой агарозы. Аналитическая экспрессия гликопротеина gpl20. Аналитическую экспрессию gpl20 проводили при высоком уровне заражения (5-Ю частиц/клетку). Для получения фракции растворимых клеточных белков культуральную среду из чашек Петри осторожно отбирали, монослой ( 106 клеток), промывали буфером ФСР, не нарушая прикрепления клеток к дну чашки, отделяли клетки смывом микропипеткой, центрифугировали и лизировали в растворе, содержащем 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА-Na, 150 мМ NaCl, 0.5% 3-[(3-холамидопропил)-диметимаммоний]-1-пропансульфоната течение 45 мин. на льду. Клеточный дебрис отделяли центрифугированием, супернатант смешивали с двукратным буфером образца для ДСН-ПААГ. Аликвоты культуральной среды отделяли от клеточного дебриса и посторонних включений центрифугированием и так же смешивали с двукратным буфером образца для ДСН-ПААГ. Для детекции gpl20 методом иммуноблоттинга использовали поликлональные антитела мыши к gpl20I-III в разведении 1:1000. Препаративная экспрессия, выделение и очистка гликопротеина gpl20. Препаративную экспрессию белков проводили в суспензионной культуре клеток линии High Five в среде High Five (Invitrogen, США). Культивирование проводили в колбе с мешалкой (spinner flask) при 27С в объеме среды 300 мл в течение шести дней после инфицирования в соотношении 5-Ю частиц/клетку. После окончания культивирования кондиционированную культуральную среду отделяли от клеток и клеточного дебриса последовательными центрифугированиями при 2000 об./мин. в течение 10 минут и, затем, 14000 об./мин. в течение 15 минут.
Целевой белок очищали путем отделения глобулиновой фракции кондиционированной среды сульфатом аммония при 55% насыщении и последующем осаждении gpl20 сульфатом аммония при 80% насыщении. Полученный осадок растворяли в буферном растворе, содержащем 20 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 500 мМ NaCl, 1 мМ MgC12, 1 мМ СаС12 и 1 мМ MnC12 , адсорбировали на колонке, содержащей иммобилизованный лектин Lens culinaris [ 145], промывали стартовым раствором до стабилизации базовой линии и элюировали gpl20 раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 150 мМ NaCl и 150 мМ a-D метилманнозида.
Масс-спектрометрический анализ продуктов распада trx-gp 120I-III по методу SELDI
Как отмечалось выше, возможность получать антиидиотипические антитела к области активных центров ферментов, воспроизводящих их каталитические свойства, была продемонстрирована на примерах ацетилхолинэстеразы и р-лактамазы. Полученные антиидиотипические антитела катализировали распад сложноэфирных и амидных связей, соответственно.
Для создания антиидиотипического антитела, обладающего протеолитической активностью, был выбрана бактериальная эндопротеиназа серинового типа субтилизин Карлсберг (ЕС 3.4.21.62).
Моноклональные антитела, нейтрализующие протеолитическую активность субтилизина Карлсберг и антиидиотипические антитела к одному из нейтрализующих антител были получены лабораторией А. Фрибуле, Технологический Университет г. Компьень, Франция. Антитела, нейтрализующие активность субтилизина, были отобраны в соответствии с ранее опубликованными принципами [179]. Был проведен скрининг -800 гибридомных клонов по критерию связывания субтилизина по ИФА. Антитела, связывающиеся с субтилизином, были хроматографически очищены и использованы для исследования способности ингибировать ферментативную активность субтилизина. Для этого очищенные антитела инкубировали с субтилизином и измеряли остаточную ферментативную активность. Было отобрано антитела 5-Н4, ингибировавшее субтилизин в наименьшей концентрации. При дальнейшей характеризации его свойств было продемонстрировано, что 90% ингибирование субтилизина достигается при молярном соотношении связывающих центров антитела и субтилизина 2:1, в то же время 50% ингибирование субтилизина было достигнуто при соотношении 1:2. Это свидетельствует об образовании плотного комплекса антитела и субтилизина в соотношении 1:1 и отсутствии комплексов состава 1:2, т.е. выраженной отрицательной кооперативности связывающих центров антител. Установление стехиометрии комплекса позволило определить кажущуюся константу ингибирования субтилизина антителом 5-Н4, составившую 2,2±1,4 нМ. При варьировании концентрации субстрата было показано, что ингибирование является конкурентным. При помощи конкурентного ИФА было показано, что концентрация субтилизина в растворе, приводящая к уменьшению связывания 5-Н4 с иммобилизованным субтилизином вдвое, составляет 3,3±1,4 нМ. Таким образом, было продемонстрировано, что антитело 5-Н4 связывает субтилизин Карлсберг с высокой аффинностью и при образовании комплекса полностью блокирует его ферментативную активность. Отобранное антитело 5-Н4 было использовано для иммунизации мышей и получения гибридомных клонов, секретирующих антиидиотипические антитела. На первом этапе селекции при помощи ИФА проводили отбор антител, связывающих Fab2 -фрагменты антитела 5-Н4. Было отобрано 40 клонов гибридом, секретирующих антитела, связывающиеся с 5-Н4. Для последующего отбора протеолитически активных антиидиотипических антител использовали хроматографически очищенные антитела. В лунках иммунологического планшета иммобилизовали антитела против иммуноглобулинов мыши, после чего вносили очищенные исследуемые антитела, инкубировали один час для селективной адсорбции моноклональных антител на поверхность лунок и удаляли возможные примеси промывками ФСР. В лунки планшета вносили раствор стандартных субстратов субтилизина - п-нитроанилидных (pNa) производных пептидов AAPF-pNa и GGL-pNa в концентрации 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно. Планшеты инкубировали в течение 24 ч и наблюдали уровень распада субстратов по возрастанию концентрации свободного п-нитроанилида. При помощи данного метода было отобрано несколько гибридомных клонов, проявляющих протеолитическую активность по отношению к обоим субстратам, т.е. обладающих сходной субстратной специфичностью с исходным ферментом - субтилизином Карлсберг. Для дальнейших исследований было выбрано антитело 6В8Е12, обладающее наибольшей удельной активностью, которое и явилось предметом изучения в данной диссертационной работе. Кинетические параметры гидролиза AAPFpNa и GGLpNa, приведенные в таб. 12 показывают, что аффинность антитела к субстратам несколько ниже, чем у субтилизина, а максимальная скорость катализируемой реакции много ниже. 25-кратное различие каталитических констант гидролиза четырех- и трехчленных пептидов субтилизином объясняется существованием в молекуле субтилизина двух выраженных сайтов связывания субстрата Р1 и Р4, образующих контакты с аминокислотами в позициях -1 и -4 относительно гидролизуемой связи [180]. Близкие значения каталитических констант для обоих субстратов в случае антитела 6В8Е12 могут быть объяснены отсутствием сайтов связывания субстрата, удаленных от активного центра. Гидролиз субстратов AAPFpNa и GGLpNa, катализируемый антителом 6В8Е12 ингибировался антителом 5-Н4. Необходимо отметить, что при помощи п-нитроанилидных производных пептидов был продемонстрирован катализ гидролиза амидных связей, но не эндопротеолитические свойства антитела 6В8Е12. Для проверки возможности катализа антителом распада пептидных связей в молекулах белков был использован БСА, избыточно меченый ФИТЦ [150].
Получение слитных белков на основе фрагментов gpl20 для иммунизации и изучения свойств антител. Прокариотическая экспрессия
В настоящей работе рассмотрены две альтернативные возможности индукции протеин-специфического антительного каталитического ответа. Была продемонстрирована возможность получения антиген-специфичных протеолитических антител при помощи иммунизации мышей субстратом реакции на фоне индуцированного аутоиммунного заболевания. Данный способ получения протеолитических антител был реализован на примере константных областей gpl20. Дальнейшее развитие этого подхода может привести к созданию моноклональных антител, расщепляющих gpl20 в кровотоке и таким образом сдерживающих инфекцию ВИЧ. Потенциальное медицинское использование протеолитических антител можно рассматривать скорее как разновидность вакцинации, чем в качестве лекарственной терапии.
Основной целью классической вакцинации патогенами или их фрагментами можно считать индукцию стерилизующего иммунного ответа, препятствующего будущему заражению, но не прямую элиминацию патогена. Введение в кровоток каталитических антител, таким образом, можно отнести к пассивной вакцинации и обозначить как "каталитическую вакцинацию". Каталитические антитела в целом являются низкоактивными, но весьма высокоспецифичными биокатализаторами [184]. Их каталитическая активность, направленная против определенных участков вирусных белков может усилить существующий антивирусный ответ и привести к нейтрализации вируса. Несмотря на низкую процессивность, присущую каталитическим антителам [61], было продемонстрировано, что их высокая субстратная специфичность и исключительная стабильность в кровотоке достаточны для инактивации антигенов [93]. Более того, в работе группы С. Паула было продемонстрировано, что антитела класса IgM, выделенные из сывороток крови некоторых людей, не инфицированных ВИЧ, способны расщеплять gpl20 in vitro [185]. Необходимо также отметить, что к настоящему моменту в литературе описано два способа получения протеолитических антител, расщепляющих белки ВИЧ-1. В работе группы Т. Уда была охарактеризована легкая цепь моноклонального антитела, расщепляющая поверхностный антиген ВИЧ gp41 [105], а в работе группы С. Паула при помощи реакционной иммунизации мышей конъюгатом фосфоната и gpl20 были получены антитела, расщепляющие gpl20 [186].
Другим подходом, использованным в данной работе, является получение антиидиотипического антитела 6В8Е12, копирующего область активного центра эндопротеазы. Использование в качестве исходного фермента субтилизина Карлсберг потенциально может привести к образованию антител, обладающих сходной с субтилизинами субстратной специфичностью. Существование у субтилизинов протяженной области связывания субстрата (до 8 аминокислот) с двумя наиболее выраженными сайтами связывания аминокислот субстрата в позициях -4 и -1 позволяет предположить, что антиидиотипическое антитело также может проявлять высокую селективность. Полученные для антиидиотипического антитела кинетические данные предположительно указывают на отсутствие у антитела эквивалента сайта S4, связывающего аминокислоту субстрата в положении -4. Тем не менее, антиидиотипическое антитело способно расщеплять белки по одному преимущественному сайту.
Следует отметить, что несмотря на невысокое сродство к пептидным субстратам и достаточно низкую величину каталитической константы, антиидиотипическое антитело сохраняет каталитическую активность при длительной инкубации в присутствии белковых субстратов, вследствие чего его удельная активность в отношении рибонуклеазы А ниже, чем у субтилизина всего лишь на 2 порядка. Поскольку в опытах in vitro антиидиотипическое антитело в концентрации 0,1 мг/мл полностью разрушало рибонуклеазу А, взятую в концентрации 140 нг/мл, в течение 15 ч, можно предположить, что протеолитические антитела со сходной каталитической эффективностью и достаточной субстратной специфичностью могут быть использованы для инактивации заданных белков в кровотоке in vivo.
Дальнейшие исследования антитела 6В8Е12, опирающиеся на проводимое в настоящий момент молекулярное клонирование вариабельных доменов его цепей, позволит установить его пространственную структуру и провести сравнительный анализ механизмов действия абзима и исходного фермента, что позволит существенно уточнить представления об "образе активного центра" фермента, передающегося в цепи идиотипических взаимодействий.
