Содержание к диссертации
Введение
3. Литературный обзор
3.1. Общая характеристика факторов роста
3.2. Основной фактор роста фибробластов FGF-2
3.2.1. Общая характеристика FGF-2
3.2.2. Взаимодействие FGF-2 с рецепторами
3.2.3. Изоформы FGF-2
3.2.4. Структура FGF-2
3.2.5. Биологическая активность и функции FGF-2
3.3. Трансформирующий фактор роста pi (TGF-pl) и его рецептор типа II (ТріШ)
3.3.1. Суперсемейство белков TGF-P1
3.3.2. Структура TGF-pl
3.3.3. Рецепторы и механизмы внутриклеточных сигнальных путей TGF-P
3.3.4. Биологическая активность и функции TGF-pl
3.4. Экспрессия и ренатурация рекомбинантных белков
3.4.1. Слитные рекомбинантные белки
3.4.2. Экспрессия рекомбинантных белков
3.4.3. Расщепление слитных белков
3.4.4. Ренатурация рекомбинантных белков
4. Материалы и методы
4.1. Материалы
4.2. Методы
4.2.1. Конструирование плазмидной ДНК
4.2.2. Сайт-направленный мутагенез
4.2.3. PIPES-трансформация, приготовление компетентных клеток Е.соН штамма XL-1 Blue
4.2.4. Получение компетентных клеток Е.соН BL21(DE3)
4.2.5. Трансформация клеток Е.соН плазмидной ДНК
4.2.6. Выделение плазмидной ДНК
4.2.7. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
4.2.8. Определение концентрации белка в растворе
4.2.9. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле
4.2.10. Экспрессия белка FGF-2 и его мутантного варианта и белка TJ3RII
4.2.11. Очистка и расщепление белка FGF-2
4.2.12. Идентификация белков по N-концевой последовательности
4.2.13. Метод оценки жизнеспособности клеток с метилтиазолтетразолием (МТТ-тест)
4.2.14. Очистка, ренатурация и расщепление белка TpRII-ED
4.2.15. Очистка TpRII-ED с помощью метода обратнофазной HPLC хроматографии
4.2.16. MALDI-TOF масс-спектрометрия
4.2.17. Метод спектроскопии кругового дихроизма
4.2.18. !Н ЯМР-спектроскопия
4.2.19. Исследование связывания белка-рецептора TpRII-ED с лигандом TGF-J31 методом ELISA
5. Результаты и обсуждение
5.1. Синтез генов FGF-2 и TPRII-ED и клонирование их в экспрессионные векторы
5.2. Экспрессия слитного белка Trx/FGF2 в Е.соН
5.3. Очистка слитного белка Trx/FGF-2
5.4. Расщепление слитного белка Trx/FGF-2 энтеропептидазой и очистка целевого белка FGF-2
5.5. Исследование физико-химических свойств полученного рекомбинантного белка FGF-2
5.6. Введение C78S и C96S мутаций в ген FGF-2 и получение экспрессирующего вектора pET32a/FGF-2/C78S/C96S
5.7. Экспрессия и очистка мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S
5.8. Проверка биологической активности очищенного препарата FGF-2 и его мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S на культуре клеток
5.9. Преимущества разработанной методики получения и очистки рекомбинантного FGF-2
5.10. Экспрессия слитного белка Trx/TpRII-ED в E.coli
5.11. Очистка и расщепление слитного белка Trx/TpRII-ED энтеропептидазой и очистка целевого белка TpRII-ED
5.12. Исследование физико-химических свойств полученного рекомбинантного белка TpRII-ED
5.13. Исследование связывания белка-рецептора TpRII-ED с лигандом TGF-pl методом ELISA
5.14. Преимущества разработанной методики получения и очистки рекомбинантного белка-рецептора TpRII-ED
6. Выводы
7. Список литературы
- Основной фактор роста фибробластов FGF-2
- Конструирование плазмидной ДНК
- Синтез генов FGF-2 и TPRII-ED и клонирование их в экспрессионные векторы
- Экспрессия слитного белка Trx/TpRII-ED в E.coli
Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние 30 лет индустрия биотехнологии создала более 50 успешных фармацевтических продуктов, основанных на терапевтических рекомбинантных белковых препаратах, таких как инсулин, интерфероны, цитокины, гормоны, факторы роста, биоинженерные антитела, ферменты и ингибиторы ангиогенеза. Более 500 новых рекомбинантных белковых препаратов в настоящее время проходят клинические испытания. Экспрессия белков в E.coli и их последующее выделение и очистка является одним из самых популярных способов получения рекомбинантных белков. Причинами этого являются простота культивации, быстрый рост, большое разнообразие векторных систем, безопасность и экономическая выгодность процесса.
Фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) или основной фактор роста фибробластов (basic - bFGF) является членом большого семейства структурно похожих белков, которые влияют на рост, дифференцировку, миграцию и жизнеспособность (выживаемость) клеток различного происхождения. Белок FGF-2 стимулирует рост и развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез), а также нормальное заживление ран и рост тканей. Он может служить терапевтическим агентом для лечения ран различного происхождения, а при его введении в организм не наблюдается значительных побочных эффектов и общей токсичности. Белок FGF-2 эффективен как при лечении поверхностных ран и ожогов, так и при остром повреждении внутренних органов (в частности, легких и кишечника). Он способствует лечению незаживающих ран различного происхождения, в том числе ран, возникающих при радиационном поражении и при диабете. В настоящее время рекомбинантные препараты FGF-2 рассматриваются как хорошие средства для терапии ран различного происхождения. Разработка методов получения высокоочищенного, высокоактивного и стабильного препарата рекомбинантного FGF-2 человека без iV- или С- концевых тагов и с высокими выходами белка является важной задачей и открывает широкие возможности для успешного использования FGF-2 как в доклинических, так и клинических испытаниях для стимуляции различных регенерационных процессов.
Другой группой факторов роста терапевтического назначения является семейство трансформирующих факторов роста-Р (TGF-P), которое включает в себя пять изоформ -полипептидов: TGF-pi, TGF-P2, TGF-P3, TGF-P4 и TGF-P5. Эти многофункциональные белки регулируют рост и дифференцировку клеток, индуцируя синтез белков внеклеточного матрикса и модулируя иммунный ответ. В настоящее время TGF-pi рассматривается в качестве многообещающего терапевтического средства при терапии ран, лечении остеопороза, ишемических повреждений и аутоиммунных заболеваний. Однако многочисленные исследования показали, что существует ряд
фибропролиферативных нарушений, при которых избыточная экспрессия TGF-P играет ключевую роль. Суперэкспрессия TGF-pi наблюдается при гломерулонефрите, пульмонарном фиброзе, циррозе печени и при образовании келоидных рубцов. Это позволяет предположить, что молекулы-антагонисты TGF-P могут быть эффективны при лечении этих заболеваний. Высокий уровень TGF-P продуцируется также многими типами опухолей, включая меланому и рак груди, толстой кишки, пищевода, желудка, печени, легких, поджелудочной железы и простаты, а также при гематологических злокачественных заболеваниях. Нерегулируемая иммуноподавляющая активность TGF-P провоцирует развитие опухолей, в частности, на поздних стадиях болезни, когда опухоль начинает метастазировать. Накопленные доклинические и клинические данные указывают на то, что вещества, блокирующие сигнальные пути TGF-P, могут быть использованы для лечения фиброзных нарушений и раковых заболеваний.
Одной из успешных стратегий для блокирования сигнальных путей TGF-P является непосредственная нейтрализация отдельных изоформ TGF-P в крови. Нейтрализующие TGF-P реагенты могут быть разделены на две категории: нейтрализующие антитела и ловушки лиганда, такие, например, как его растворимые рецепторы. Сигналы TGF-P передаются посредством 2-х типов рецепторов: типа I и типа II (белки TpRI и TpRII). Исследования показали, что рекомбинантный растворимый внеклеточный домен рецептора TGF-P типа II (TpRII-ED, ED-extracelullar domain) обладает антифиброгенной и антиопухолевой активностью при метастазирующих опухолях, в результате нейтрализации высокого содержания TGF-pi и TGF-P3 в крови. Молекула TpRII-ED обогащена остатками цистеина, которые образуют 6 дисульфидных связей, что затрудняет ее ренатурацию в прокариотических клетках, в частности, при экспрессии рекомбинантного белка в штаммах Е.соИ. Разработка эффективных методов экспрессии и очистки высокоактивного препарата белка TpRII-ED в Е.соИ расширит возможности его применения в клинике для терапии рака и фиброзных нарушений. Препарат может быть использован также для диагностики активной и латентной форм TGF-P в плазме крови при различных заболеваниях, с помощью метода иммуноферментного анализа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Как альтернативный подход препарат рекомбинантного белка TpRII-ED может быть иммобилизован на сорбентах и использован для адсорбции TGF-P при его нежелательно высоком содержании в крови (метод гемоперфузии). Этот подход имеет преимущество, так как исключает нежелательные побочные эффекты, возникающие при введении белковых препаратов непосредственно в кровь.
Цель исследования.
Разработка новых эффективных подходов экспрессии в E.coli рекомбинантных белков терапевтического назначения основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и лиганд связывающего растворимого внеклеточного домена рецептора II типа TGF-P (TPRII-ED), разработка методов очистки этих препаратов и исследование их биологической активности.
Задачи исследования.
1. Получить эффективные экспрессирующие конструкции для продукции
рекомбинантных белков FGF-2 и T|3RII-ED в штаммах E.coli.
2. Разработать и оптимизировать методику очистки целевых рекомбинантных
белков FGF-2 и TpRII-ED.
3. Получить целевые белки в количествах, необходимых для проведения
исследований.
Исследовать физико-химические свойства полученных рекомбинантных белков FGF-2 и T|3RII-ED с помощью методов спектроскопии кругового дихроизма, ЯМР-спектроскопии и масс-спектроскопии.
Исследовать биологическую активность полученного рекомбинантного белка FGF-2 путем стимуляции роста фибробластов.
Исследовать лиганд-связывающие свойства рекомбинантного белка T|3RII-ED с помощью метода ELISA.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В данной диссертационной работе были разработаны новые эффективные подходы для экспрессии в E.coli и очистки рекомбинантных человеческих белков основного фактора роста (FGF-2), его мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S с улучшенной растворимостью и лиганд-связывающего внеклеточного домена рецептора II типа TGF-P (T|3RII-ED). Разработанные методики позволяют получить высокоочищенные и высокоактивные стабильные препараты, 100-120 MrFGF-2 и 140-150 мг TpRII-ED из 1 л культуры клеток, что на 2 порядка больше, чем в ранее описанных работах. Такой высокий выход целевых белков позволяет рассматривать полученные препараты FGF-2 и TpRII-ED как потенциальные терапевтические средства, пригодные для диагностических и клинических испытаний. Низкая стоимость полученных препаратов открывает широкие возможности для их последующего использования в терапевтических нуждах.
Апробация работы.
Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: Первый студенческий симпозиум по биоинженерии, 27-31 октября 2006 г., Москва, Россия; XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», 20-23 апреля 2007 г., Москва, Россия; V Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 16-20 марта 2009 г., Москва, Россия; XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 8-11 февраля 2010 г., Москва, Россия. II международный симпозиум «Биофарма-2010: от науки к промышленности», 17-20 мая 2010 г., Ереван, Армения.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи, 5 тезисов конференций и 1 заявка на патент РФ.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка, 4 таблицы. Список литературы включает 207 источников.
Основной фактор роста фибробластов FGF-2
Факторами роста называют вещества, способные к стимулированию клеточного роста, пролиферации и клеточного дифференцирования. Обычно фактор роста - это белок или стероидный гормон. Факторы роста очень важны для регулирования множества клеточных процессов и, как правило, действуют как сигнальные молекулы между клетками. В процессе этого они связываются с определенным типом рецепторов на поверхности их целевых клеток.
Факторы роста часто продвигают дифференцирование и созревание клеток. Например, факторы роста костной ткани (BMPs- bone morphogenetic proteins) стимулируют дифференцирование костных клеток, в то время как основной фактор роста фибробластов (FGF-2) и факторы роста сосудистого эндотелия (VEGF) стимулируют дифференцирование кровеносных сосудов (ангиогенез).
Понятие «фактор роста» иногда используется среди ученых попеременно с термином «цитокин». Исторически, ученые связывали цитокины с гематопоэтическими (формирование крови) клетками и клетками иммунной системы (например, лимфоциты, а также клетки тканей селезёнки, тимуса и лимфатических узлов).
Наличие факторов роста подразумевает оказание положительного эффекта на клеточное деление, в то время как термин цитокин относительно нейтральный и если он затрагивает пролиферацию молекул, то может выступать как фактор роста. Например, некоторые цитокины, такие как G-CSF (фактор роста колоний гранулоцитов) и GM-CSF (фактор роста колоний гранулоцитов-макрофагов), могут быть факторами роста, другие оказывают, напротив, ингибирующий эффект на рост или пролиферацию клеток. Некоторые цитокины, такие как лиганды семейства TNF (tumor necrosis factor) при связывании с рецепторами передают "смертельные" сигналы и заставляют целевые клетки подвергаться некрозу или апоптозу (запрограммированной клеточной смерти). Факторы роста -это белки, которые функционируют как стимуляторы роста (митогены) и / или ингибиторы роста, стимулируют миграцию клеток, действуют как хемотоксичные агенты, ингибируют миграцию клеток, ингибируют инвазию раковых клеток, регулируют различные клеточные функции, участвуют в апоптозе и ангиогенезе и стимулируют выживаемость клеток, не влияя на рост и дифференциацию.
Последовательность аминокислотных остатков позволяет объединять факторы роста в одну группу, что позволяет предположить, что они происходят от общего предкового белка. Семейство инсулинов включает соматомедины А и С, инсулин, инсулин-подобный фактор роста (IGF) и импортстимулирующий фактор (MSF). Второе семейство включает фактор роста сарком (SGF), трансформирующей фактор роста (TGF) и эпидермальный фактор роста (EGF). Кроме того, существуют факторы роста, например, фактор роста нервов (NGF), фактор роста фибробластов (FGF), и фактор роста тромбоцитов (PDGF), для которых не было найдено структурных гомологов.
В течение двух прошлых десятилетий факторы роста все более и более интенсивно использовались при лечении гематологических, онкологических и сердечно-сосудистых заболеваниях.
Основной фактор роста фибробластов (FGF-2 или bFGF) принадлежит к большому семейству ростовых факторов фибробластов (24 члена) (Bikfalvi и др., 1997; Nugent и др., 2000). Он во многом определяет пролиферацию, дифференцировку и функциональные свойства клеток как мезодермального, так и нейроэктодермального происхождения. Первый фактор роста фибробластов (FGF) был обнаружен как митоген в культуре фибробластов Balb/сЗТЗ (Gospodarowicz и др., 1975). В настоящее время обнаружено 24 членов семейства FGF в различных организмах - от нематод и дрозофилы до мышей и человека. 22 из них были идентифицированы у человека (Nugent и др., 2000; Finklestein и др., 2001). Белки данного семейства отличаются друг от друга по размеру (варьируется от 15 до 34 кДа), но все имеют одну общую аминокислотную последовательность, состоящую из 120-ти аминокислот (16-65 % гомологии). Факторы роста фибробластов выполняют целый спектр клеточных функций, как во время эмбрионального развития, так и во взрослом организме.
Все белки семейства FGF связывают гепарин и могут модулировать функции широкого спектра клеточных типов. Связывание гепарина и гепарансульфатов может также влиять на структуру FGF-2, облегчая образование димерных структур и олигомеров более высокого порядка (Nug ent и др., 2000; Conrad, 1998). Взаимодействие гепарина с FGF-2 защищает белок от теплового шока, денатурации при кислых рН и разрушения протеазами (Conrad, 1998). Как гепарин, так и гепарансульфаты, полисахариды, входящие в состав пептидогликанов клеточной поверхности, играют важную роль в рецепции FGF-2. Гепарин синтезируется только клетками соединительной ткани, в то время как гепарансульфаты широко распределены во всех тканях и органах млекопитающих. Гепарансульфаты связываются с ядерными белками, такими, как, например, гепарансульфатпротеогликаны (heparin sulfate proteoglycans - HSPG). Они обнаружены на поверхности клеток и внутриклеточном матриксе, где они взаимодействуют с FGF-2 и модулируют его распределение и функцию (Iozzo, 1998). В результате анализа данных кристаллической структуры FGF-2 в комплексе с гомогенным гепарин гексасахаридом были обнаружены специальные сайты, участвующие в процессе связывания гепарина и гепарансульфатов (Faham и др., 1996). Всего было обнаружено 2 таких участка: сайт 1 - Asn28, Argl21, Lysl26, Glnl35 и сайт 2 - Lys27, Asnl02, Lysl36 (Nugent и др., 2000).
Конструирование плазмидной ДНК
Факторами роста называют вещества, способные к стимулированию клеточного роста, пролиферации и клеточного дифференцирования. Обычно фактор роста - это белок или стероидный гормон. Факторы роста очень важны для регулирования множества клеточных процессов и, как правило, действуют как сигнальные молекулы между клетками. В процессе этого они связываются с определенным типом рецепторов на поверхности их целевых клеток.
Факторы роста часто продвигают дифференцирование и созревание клеток. Например, факторы роста костной ткани (BMPs- bone morphogenetic proteins) стимулируют дифференцирование костных клеток, в то время как основной фактор роста фибробластов (FGF-2) и факторы роста сосудистого эндотелия (VEGF) стимулируют дифференцирование кровеносных сосудов (ангиогенез).
Понятие «фактор роста» иногда используется среди ученых попеременно с термином «цитокин». Исторически, ученые связывали цитокины с гематопоэтическими (формирование крови) клетками и клетками иммунной системы (например, лимфоциты, а также клетки тканей селезёнки, тимуса и лимфатических узлов). Наличие факторов роста подразумевает оказание положительного эффекта на клеточное деление, в то время как термин цитокин относительно нейтральный и если он затрагивает пролиферацию молекул, то может выступать как фактор роста. Например, некоторые цитокины, такие как G-CSF (фактор роста колоний гранулоцитов) и GM-CSF (фактор роста колоний гранулоцитов-макрофагов), могут быть факторами роста, другие оказывают, напротив, ингибирующий эффект на рост или пролиферацию клеток. Некоторые цитокины, такие как лиганды семейства TNF (tumor necrosis factor) при связывании с рецепторами передают "смертельные" сигналы и заставляют целевые клетки подвергаться некрозу или апоптозу (запрограммированной клеточной смерти). Факторы роста -это белки, которые функционируют как стимуляторы роста (митогены) и / или ингибиторы роста, стимулируют миграцию клеток, действуют как хемотоксичные агенты, ингибируют миграцию клеток, ингибируют инвазию раковых клеток, регулируют различные клеточные функции, участвуют в апоптозе и ангиогенезе и стимулируют выживаемость клеток, не влияя на рост и дифференциацию.
Последовательность аминокислотных остатков позволяет объединять факторы роста в одну группу, что позволяет предположить, что они происходят от общего предкового белка. Семейство инсулинов включает соматомедины А и С, инсулин, инсулин-подобный фактор роста (IGF) и импортстимулирующий фактор (MSF). Второе семейство включает фактор роста сарком (SGF), трансформирующей фактор роста (TGF) и эпидермальный фактор роста (EGF). Кроме того, существуют факторы роста, например, фактор роста нервов (NGF), фактор роста фибробластов (FGF), и фактор роста тромбоцитов (PDGF), для которых не было найдено структурных гомологов.
В течение двух прошлых десятилетий факторы роста все более и более интенсивно использовались при лечении гематологических, онкологических и сердечно-сосудистых заболеваниях.
Основной фактор роста фибробластов (FGF-2 или bFGF) принадлежит к большому семейству ростовых факторов фибробластов (24 члена) (Bikfalvi и др., 1997; Nugent и др., 2000). Он во многом определяет пролиферацию, дифференцировку и функциональные свойства клеток как мезодермального, так и нейроэктодермального происхождения. Первый фактор роста фибробластов (FGF) был обнаружен как митоген в культуре фибробластов Balb/сЗТЗ (Gospodarowicz и др., 1975). В настоящее время обнаружено 24 членов семейства FGF в различных организмах - от нематод и дрозофилы до мышей и человека. 22 из них были идентифицированы у человека (Nugent и др., 2000; Finklestein и др., 2001). Белки данного семейства отличаются друг от друга по размеру (варьируется от 15 до 34 кДа), но все имеют одну общую аминокислотную последовательность, состоящую из 120-ти аминокислот (16-65 % гомологии). Факторы роста фибробластов выполняют целый спектр клеточных функций, как во время эмбрионального развития, так и во взрослом организме.
Все белки семейства FGF связывают гепарин и могут модулировать функции широкого спектра клеточных типов. Связывание гепарина и гепарансульфатов может также влиять на структуру FGF-2, облегчая образование димерных структур и олигомеров более высокого порядка (Nug ent и др., 2000; Conrad, 1998). Взаимодействие гепарина с FGF-2 защищает белок от теплового шока, денатурации при кислых рН и разрушения протеазами (Conrad, 1998). Как гепарин, так и гепарансульфаты, полисахариды, входящие в состав пептидогликанов клеточной поверхности, играют важную роль в рецепции FGF-2. Гепарин синтезируется только клетками соединительной ткани, в то время как гепарансульфаты широко распределены во всех тканях и органах млекопитающих. Гепарансульфаты связываются с ядерными белками, такими, как, например, гепарансульфатпротеогликаны (heparin sulfate proteoglycans - HSPG). Они обнаружены на поверхности клеток и внутриклеточном матриксе, где они взаимодействуют с FGF-2 и модулируют его распределение и функцию (Iozzo, 1998). В результате анализа данных кристаллической структуры FGF-2 в комплексе с гомогенным гепарин гексасахаридом были обнаружены специальные сайты, участвующие в процессе связывания гепарина и гепарансульфатов (Faham и др., 1996). Всего было обнаружено 2 таких участка: сайт 1 - Asn28, Argl21, Lysl26, Glnl35 и сайт 2 - Lys27, Asnl02, Lysl36 (Nugent и др., 2000).
Синтез генов FGF-2 и TPRII-ED и клонирование их в экспрессионные векторы
Молекула ТріШ представляет собой трансмембранный белок II типа, который содержит 567 аминокислотных остатков, из которых 1 -166 составляют внеклеточный или лиганд связывающий, 167-187 трансмембранный и 187-567 цитоплазматический домены. Последний обогащен сериновыми и треониновыми остатками и обладает серин/треонин - специфической протеинкиназной активностью. Внеклеточный лигаид-связываюпдий домен (TBRII-ED extracelullar domain), обогащен цистеинами и содержит 6 дисульфидных связей (Lin и др., 1992).
Разрешение кристаллической структуры показало, что внеклеточный домен TBRII (аминокислотные остатки 25-136) представляет собой молекулу белка, содержащую 11 В-слоев, способную связываться с димером трансформирующего фактора роста-р. Структура эктодомена TBRII состоит из двух антипараллельных листов. Шесть р-слоёв формируют большой лист, а три слоя - маленький (Рис. 12).
Структура рецептора TpRH имеет сгиб в виде трех пальцев, подобный сгибу некоторых нейротоксинов ядовитых змей. Такой сгиб характерен для белков, имеющих общий образец восьми цистеинов, создающих четыре дисульфидных связи. TpRII содержит четыре дисульфидные связи, консервативные среди надсемейства рецепторов белка TGF-P типа II и две дисульфидные связи, уникальные для TpRII человека (Boesen и др., 2002).
TpRII является важнейшим активным серин/треонин киназным рецептором на поверхности клетки (Lin и др., 1992; Не и др., 1993). Гомодимерные изоформы TGF-P или непосредственно связываются с TpRII или доходят до TpRII через дополнительный рецептор белка TGF-p типа ІП (TpRIII, бетагликан) (Blobe и др., 2000; Wang и др., 1991; Lopez-Casillas и др., 1993; Blobe и др., 2001). TpRII имеет очень высокое сродство и к TGF-pl и TGF-рЗ изоформам, тогда как его аффинность к TGF-p2 очень низка (Cheifetz и др., 1990; Sankar и др., 1995). TGF-P2 с высокой аффинностью может связываться с TpRII только в присутствии молекулы рецептора Ш типа (ТрШП). При этом не исключается существование другой формы рецептора TpRII, обладающей высокой специфичностью к TGF-p2 (Derynck, 1996).
После связывания лиганда TpRII формирует комплекс с TpRI и фосфорилирует непосредственно мембранный домен TpRI, чтобы активизировать его сериновую/треониновую киназу (Wrana и др., 1994). Далее происходит активация факторов транскрипции Smad2 и Smad3, которые фосфорилируются с помощью TPRI (Nakao и др., 1997). Фосфорилированные Smad2/Smad3 связываются с Smad4 и перемещаются к ядру, обеспечивая, таким образом, взаимодействие Smad4 с внутриядерными факторами транскрипции. Эти факторы, в свою очередь, отрегулируют транскрипцию генов, отзывчивых на воздействие TGF-p. В эндотелиальных клетках, после закрепления лиганда, TpRII может также сформировать комплекс с АЬК-1(активин рецептор-подобных киназ) и активизировать его, который в свою очередь, фосфорилирует один из Smad (Smad 1/5/8), чтобы добиться регулирования сигнального пути (Lux и др., 1999; Oh и др., 2000; Goumans и др., 2003).
Рекомбинантный белок TpRII был характеризован как одна из ключевых активных серина/треонина киназ (Lin и др., 1992). Было показано, что TpRII киназа регулируется сложным механизмом автофосфорилирования, по крайней мере трех сериновых остатков. Автофосфорилирование по 213-му остатку серина, находящейся в ближайшей мембранной области (вне киназного домена), необходимо для активации киназы, чтобы TpRII смог активизировать TpRL Автофосфорилирование по остатку серина 409 увеличено димеризацией рецептора и также существенно для активности киназы (Luo и др., 1997).
Фосфорилирование Ser409 необходимо для киназной передачи сигнала TpRII, тогда как фосфорилирование серина 416 ингибирует функцию рецептора. Мутация серина 416 на аланин приводит к гиперактивности рецептора, который гораздо лучше, чем дикий тип активизирует TpRI и последующий арест клеточного цикла. Соответственно, на одной молекуле рецептора ТріШ одновременно не могут фосфорилироватся Ser409 и Ser416. Эти результаты указывают на то, что регуляция автофосфорилирования ТРМІ запутанная и влияет на сигнальную трансдукцию TGF-p как позитивно, так и негативно (Luo и др., 1997).
Были сообщено также о способности TpRII к автофосфорилированию по остаткам тирозина 259, 336 и 424. Мутация этих трех остатков тирозина на фенилаланины инибирует деятельность киназы TpRII, предполагая роль для автофосфорилирования тирозина в регулировании деятельности киназы TpRII (Lawler и др., 1997).
Активизированный комплекс TpRI/TpRII, как показывали, усваивается в эндосомах, содержащих ранний эндосомальный белок ЕЕА-1 (early endosome antigen-1) (Murphy и др., 2004; Hayes и др., 2002). Было продемонстрировано, что интернализация TpRI/TpRII проходит и через клатрин-зависимые и через клатрин-независимые/кавеолин-1 липидные эндосомальные пути (Hayes и др., 2002; Mitchell и др., 2004) (Рис. 13).
Экспрессия слитного белка Trx/TpRII-ED в E.coli
Во множественных исследованиях было показано, что под контролем TGF-P сильно увеличивается ремонт поврежденных тканей. Применение TGF-P приводил к исцелению во множестве моделей ран, включая инцизионные и эксцизионные раны, а также раны от ударов и язв (О Капе и др., 1997). Было замечено, что единичная системная доза TGF-P, введенная подопытному животному перед нанесением травматического повреждения, улучшает заживление ткани (Beck и др., 1991). TGF-p также играет важную роль в ремонте костной ткани (Steinbrech и др., 2000). В мышечной модели добавление TGF-p в количестве меньшем, чем микрограмм вызвало закрытие раны черепа, которая иначе не заживала (Beck и др., 1991 II). В некоторых случаях TGF-P уже находит своё применение на практике. Усиление исцеления ран и исцеления повреждений при воспалительных кишечных заболеваниях кажется многообещающим.
Существует ряд фибропролиферативных нарушений, когда нерегулируемая экспрессия TGF-p играет ключевую роль. Суперэкспрессия TGF-p наблюдается при гломерулонефрите, пульмонарном фиброзе, циррозе печени и келоидах, что позволяет предположить, что молекулы-антагонисты TGF-p могут быть полезными при лечении этих заболеваний. Биологические эффекты устанавливаются через взаимодействие с рецепторами.
Широкое коммерческое использование TGF-P все еще ожидается. TGF-p может предотвратить перфузионные раны после ишемической болезни и может применяться при миокардиальных повреждениях и церебрально-васкулярной ишемии. Ингибирование TGF-p могло бы быть полезным для приостановления развития патологических состояний, связанных фиброзами, таких как цирроз печени, легочный фиброз, склеродерма, хронический панкреатит и нефрит. Уровень TGF-p может быть поднят кровоизлиянием или инфекцией, и может обеспечить полезные терапевтические цели. TGF-p и его антагонисты начали использоваться в клинических целях, как многофункциональные регуляторы клеточного роста и дифференцировки, индуцирующие синтез белков внеклеточного матрикса и подавляющие иммунную систему. Благодаря этим свойствам TGF-p способствует заживлению ран, оказывает положительное действие при лечении ишемических реперфузионных повреждений и аутоиммунных заболеваний.
Один из физиологических процессов, в которых трансформирующий фактор роста играет огромную роль - процесс регенерации. В настоящее время имеется значительное число работ, свидетельствующих о большой роли TGF-P в эпителизации кожи в процессе регенерации. Показано, что обработка TGF-P кожных ран улучшает их заживление, в том числе у старых животных и в условиях радиоактивного облучения (Faler и др., 2006). Кроме того, TGF-p в значительной степени ускоряет регенераторный процесс в костных и хрящевых тканях (Gold и др., 1997). Наряду с терапевтическими свойствами TGF-P обладает и негативным влиянием, которое проявляется в ряде тяжёлых заболеваний, таких как фибропролиферативные заболевания. Высокий уровень экспрессии этого фактора наблюдается при гломерулонефрите, лёгочном фиброзе, циррозе печени.
Функции семейства белков TGF-p в развитии болезней и, в частности, злокачественных опухолей - предмет подавляющего множества исследований в многочисленных лабораториях, что продолжает приводить к интересной возможности проникновения в суть разнообразных ролей этих секретируемых факторов и механизмов их действий (Wu и др., 2009; Massague, 2008). Сейчас ученым известно, что TGF-P является очень мощным ингибитором процесса пролиферации в нормальных клетках. Свидетельства указывают на потерю антипролиферативного живого отклика на TGF-p, который является особенностью многих опухолевых клеток (Hanahan и др., 2000; Kretschmer и др., 2003; Mourskaia и др., 2009). Это предполагает потенциальную роль TGF-P и существенных компонентов сигнального пути трансдукции TGF-P как подавителей опухолей (De Caestecker и др., 2000).
Патогенез и прогрессия многочисленных раковых образований были приписаны разрушению нормальной передаче сигналов через TGF-p. Однако, сигнализирующая роль TGF-P при канцерогенезе в значительной степени неизвестна, и окончательно не ясно. Понимание молекулярного механизма, лежащего в основе сигнального пути TGF-3/Smad может обеспечить новую цель для антираковой терапии. Поэтому в настоящий момент проводится множество исследований относительно деятельности TGF-p в опухолевых клетках (Лап и др., 2010).
В соответствии со своей многофункциональностью семейство TGF-p может играть неоднозначную роль в канцерогенезе. На ранних стадиях TGF-р действует как супрессор опухоли, в то время как на более поздних стадиях, когда клетки утрачивают чувствительность к ингибированию роста извне, трансформирующий фактор роста, наоборот, способствует канцерогенезу, стимулируя ангиогенез, иммуносупрессию и синтез белков внеклеточного матрикса, что способствует росту и метастазированию опухоли (Dennler и др., 2002).
Трансформирующий фактор роста при нормальных физиологических процессах ингибирует рост эпителиальных клеток. Однако, канцерогенез часто сопровождается потерей чувствительности клеток к TGF-P с одновременным усилением продукции этого фактора клетками. TGF-P, вырабатываемый эпителиальными клетками, выступает в качестве проонкогена по отношению к клеткам стромы (Ranganathan и др., 2007). В таких условиях очевидной тактикой борьбы с опухолью является усиление сигнальной активности TGF-p в эпителиальных клетках и ингибирование сигнальной активности этого фактора в стромальных клетках. Этот подход требует развития специфичной по отношению к типу клеток доставки TGF-р. В настоящее время в качестве векторов доставки широко применяют аденовирусы.
