Введение к работе
Актуальность проблемы. Запасание энергии в дыхательной цепи :эробных бактерий осуществляется за счет электрогенного переноса ионов юдорода из цитоплазмы в периплазматическое пространство. Создаваемая при ітом на цитоплазкатической мембране протонодвижущая сила используется клеткой для энергообеспечения основных типов работы: химической (синтез ^ТФ), осмотической (накопление различных веществ), механической (вращение кгутика).
Дыхательные цепи прокариотов в силу сравнительной простоты их .троения и доступности молекулярно—биологическим подходам служат более гдобным объектом изучения трансмембранной транслокации Н+, чем дыхательные цепи митохондрий.
Цитохром bd является одной из двух терминальных убихинолоксидаз дыхательной цепи Escherichia coli, катализирующих четырехэлектронное юсстановление кислорода до воды.
Фермент не имеет гомологии с другими известными на сегодняшний день эксидазами, такими как цитохром с оксидаза и хинолоксидаза типа Ьо. Более того, в отличие от других оксидаз дыхательных цепей организмов, комплекс bd ае содержит меди и, хотя образует Д(р, не функционирует как трансмембранный протонный насос.
Фермент представляет собой гетеродимер с тремя редокс — центрами:
НИЗКОСПИНОВЫМ ГЄМОМ bss8 и ДВУМЯ ВЫСОКОСПИНОВЫМИ ГеМаМИ — Ьд95 и d.
Функция цитохрома b5sfl, как полагают, заключается непосредственно в окислении убихинола. Гем d связывает кислород и, по всей вероятности, принимает участие в кислородоредуктазной реакции, в то время как роль гема bsgs остается неясной. Ряд авторов полагает, что, будучи высокоспиновым, гем Ьзэ5 участвует в восстановлении кислорода, образуя вместе с гемом d двухъядерный кислородоредуктазный центр, аналогичный гем/Си кислородоредуктазному центру оксидаз аа3— и Ьо—типа. По мнению других исследователей, функция гема bSgs состоит з переносе электрона с гема bSS8 на гем d.
Для того, чтобы получить информацию об устройстве активного центра и механизме работы гемопротеидов, в том числе различных оксидаз, часто прибегают к изучению связывания экзогенных лигандов гемовыми группами. В настоящей работе мы исследовали взаимодействие мембранного и растворимого цитохрома bd в различных состояниях окисления с перекисью водорода, окисью углерода, NO и цианидом.
Перекись водорода как лиганд цитохрома d особенно интересна, ибо есть указания на возникновение перекисного аддукта гема d в ходе восстановления кислорода.
Цитохром bd обладает очень высоким сродством к кислороду, так что в аэробных условиях большая часть фермента находится в так называемой оксигенированной форме (bsss3+ ^5953+ d2+ — 02).
Вместе с тем при изучении комплекса bd часто требуется получить полностью окисленную форму фермента. Во многих прежних работах, чтобы обеспечить окисленное состояние цитохрома bd, к ферменту добавляли такие окислители, как феррицианид или персульфат. Однако впоследствии стало ясно, что эти традиционные окислители не вызывают распада оксикомплекса. В этой связи возникла необходимость поиска методов окисления цитохрома d.
Целью настоящей работы было изучение особенностей устройства кислородоредуктазного центра цитохрома bd. В частности, было важно установить, способен ли высокоспиновый гем bsg5 связывать внешние лиганды. Требовалось определить число перекисных интермедиатов, возникающих при взаимодействии Н202 с ферментом. Кроме того, нужно было исследовать влияние мембранного окружения цитохрома bd на его способность к связыванию лигандов. В задачу работы также входила разработка метода получения полностью окисленной формы выделенного фермента.
Научная новизна работы. Разработан удобный метод получения полностью окисленной формы цитохрома bd из E.coli и исследовано взаимодействие окисленного фермента с экзогенными лигандами.
Существенно новым результатом работы является то, что при реакции Н202 с цитохромом bd наблюдается возникновение только одного спектрально различимого продукта, а не двух, как считалось ранее.
Показано, что перекись водорода взаимодействует исключительно с гемом d, приводя к образованию оксоферрильного комплекса. Кажущаяся величина Кд продукта взаимодействия Н202 с цитохромом d составляет 30 — 40 мкМ. Исследована кинетика взаимодействия Н202 с окисленным ферментом и определена константа скорости этой реакции, которая оказалась равной 600 М-'с-'.
Обнаружено, что в сравнительно низких концентрациях СО и KCN реагируют с гемом d выделенного фермента. При высоких концентрациях эти лиганды связываются также с 10—20% гема типа Ь. Методом МКД установлено, что эта часть принадлежит низкоспиновому гему bsss- Не получено каких—либо данных о взаимодействии с экзогенными лигандами высокоспинового гема bsgi.
Впервые показано, что липидное окружение цитохрома bd влияет на способность последнего связывать лиганды. Комплекс bd, содержащийся в нативных мембранах, либо встроенный в азолектиновые липосомы, проявляет устойчивость к связыванию внешних лигандов: в этом случае с ними может взаимодействовать исключительно гем d. Выделение и очистка фермента, равно как и простая солюбилизация мембран детергентом приводит к тому, что помимо гема d присоединять лиганды начинает и гем bssa-
Практическое значение работы. Полученные результаты существенно дополняют современные знания о свойствах и механизме функционирования ^итохромного комплекса bd из E.coli и могут найти применение в исследованиях ,'емонротеинов дыхательной или фотосинтетической редокс — цепегї. На основе цитохрома bd можно разработать биосенсоры 02 и СО. Информация о структуре и функционировании активного центра фермента будет способствовать поиску путей регуляции патогенной микрофлоры в кишечнике. Разработанный метод перевода оксигенированного цитохрома bd в полностью окисленное состояние может быть использован для окисления других гидрофобных редокс —ферментов, не взаимодействующих с традиционными акцепторами электронов типа феррицианида или персульфата.
Апробаиия работы. Диссертационная работа была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики и новых физических методов НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 1993, 1994, 1995). Результаты также представляли на 23 — иг конференции FEBS (Базель, 1995) и семинаре отдела биохимии Иллинойского университета в Урбане (1994, 1995).
/Тубілцкаццц. По материалам исследований опубликованы 4 печатные работы.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 34 рисунками.
