Введение к работе
Актуальность проблемы. Киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) является ключевым Са2+-кальмодулин зависимым регулятором клеточной подвижности. Единственный известный субстрат этого фермента у эукариот - основной молекулярный мотор клетки миозин II типа. Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина КЛЦМ приводит к активации моторного домена миозина, что необходимо для осуществления различных видов двигательных реакций клеток и тканей, например, сокращения гладких мышц сосудов и висцеральных органов, локомоции фибробластов, хемотаксиса лейкоцитов и гладкомышечных клеток интимы артерий, цитокинеза, секреции, эндоцитоза, повышения проницаемости эпителиальных и эндотелиальных монослоев и др. Большинство из этих реакций нарушается при сердечно-сосудистых заболеваниях, и, как показывают исследования последних лет, конечной мишенью многих фармакологических препаратов, применяемых для лечения этих заболеваниях, являются именно процессы клеточной подвижности (Ширинский и Воротников, 2005). Очевидно, что для создания новых эффективных лекарственных веществ, воздействующих на двигательный статус клеток, необходимо понимание молекулярных основ клеточной подвижности и сигнальных каскадов, которые ее регулируют в норме и патологии.
В результате выяснения организации генетического локуса немышечной / гладкомышечной КЛЦМ у высших позвоночных было установлено, что помимо широко распространенной 108-130 кДа КЛЦМ он кодирует 210 кДа изоформу этого фермента (КЛЦМ210; Watterson et al., 1995; Birukov et al., 1998). КЛЦМ210 экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках, эпителии кишечника и эндотелиальных клетках сосудов, в лейкоцитах и других немышечных клетках. В нашей лаборатории было впервые показано, что КЛЦМ210 и КЛЦМ108 обладают сравнимой каталитической активностью, что хорошо согласуется с наличием в их структуре одинакового каталитического и регуляторного доменов (Kudryashov et al., 1999). В то же время КЛЦМ210 отличается от КЛЦМ108 наличием уникального аминотерминального домена, состоящего из более, чем 900 аминокислот. Анализ первичной структуры этого домена показывает отсутствие в нем типичных последовательностей каталитических доменов протеинкиназ и других ферментов и позволяет выделить в его составе шесть иммуноглобулиновых доменов и несколько повторяющихся мотивов. Известно, что иммуноглобулиновые домены ряда белков вовлечены в процессы белок-белкового узнавания, однако к началу данного исследования белки-мишени уникального домена КЛЦМ210 были не известны. В первичной структуре уникального домена КЛЦМ210 существует ряд потенциальных участков фосфорилирования различными протеинкиназами, и было экспериментально показано, что такое фосфорилирование действительно происходит в живой клетке (Dulyaninova and Bresnick, 2004). Поскольку фосфорилирование является распространенным способом изменения функциональной активности белков, эти данные дополнительно свидетельствовали в пользу наличия в области N-концевого домена КЛЦМ210 функционально активных участков. Вместе с тем точной идентификации участков фосфорилирования в ранних работах проведено не было, как не были выяснены и функциональные последствия этих посттрансляционных модификаций. В настоящем исследовании мы обратились к решению этих вопросов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы явилось исследование функциональных свойств высокомолекулярной киназы легких цепей миозина, ассоциированных с ее уникальным N-концевым доменом. В работе были поставлены следующие задачи:
-
Идентификация и характеристика белок-белковых взаимодействий N-концевого домена КЛЦМ210 in vitro и в культивируемых клетках.
-
Определение участков фосфорилирования N-концевого домена КЛЦМ210 цАМФ-зависимой протеинкиназой.
-
Изучение эффектов фосфорилирования N-концевого домена КЛЦМ210 на его взаимодействие с белками-мишенями.
Научная новизна работы. Впервые показано, что уникальный домен КЛЦМ210 может связываться с филаментами актина и микротрубочками in vitro и в культивируемых клетках. Проведено картирование новых участков связывания КЛЦМ210 с основными компонентами цитоскелета. Идентифицированы аминокислотные остатки, фосфорилируемые цАМФ зависимой протеинкиназой (ПКА) в структуре N-концевого домена КЛЦМ210, и продемонстрировано, что эти модификации снижают его сродство к компонентам цитоскелета. На основании полученных результатов и данных литературы предложена схема функциональной организации КЛЦМ210. Результаты работы углубляют современные представления о структурно-функциональных свойствах высокомолекулярной киназы легких цепей миозина и ее роли, как интегратора цитоскелета и организатора подвижности немышечных клеток.
Практическая значимость работы. Обобщенные результаты работы могут применяться в обучающих программах для студентов медико-биологических специальностей. Полученные в ходе работы молекулярно-генетические конструкции и рекомбинантные белки могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов регуляции подвижности немышечных клеток и разработки новых лекарственных веществ, воздействующих на клеточную подвижность.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены международных конференциях: «Biological Motility: New Trends in Research» (Pushchino, Russia, 2001), The XXXI European Muscle Conference (Lunteren, Netherlands, 2002), «Biological Motility» (Pushchino, Russia, 2004), HMM Meeting of International Research Scholars (Тallinn, Estonia, 2004), ННМ Meeting of International Research Scholars (Merida, Mexico, 2005), «Biological Motility: Basic Research and Practice» (Pushchino, Russia, 2006), «» (Pushchino, Russia, 2008).
Публикации. По данным работы опубликовано 2 статьи и 7 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста, включает 24 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Список литературы включает 137 источников.
