Введение к работе
Актуальность темы. Малые белки теплового шока (sHsp) - это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высококонсервативного участка, который получил название кристаллинового домена. Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. Практически все sHsp формируют крупные олигомерные комплексы, различающиеся по своей структуре и количеству мономеров [Haslbeck, 2002]. Показано наличие зависимости шапероноподобной активности sHsp от их четвертичной структуры [Shashidharamurthy et al, 2005; Lelj-Garolla and Mauk, 2006]. Кроме того, эти белки могут подвегаться фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, что также отражается как на их олигомерной структуре, так и на шапероноподобной активности [Haslbeck, 2002; Gusev et al, 2002; Rogalla et al, 1999].
В настоящее время у человека описано 10 классов малых белков теплового шока. Из них наиболее подробно изучены осА- и осВ-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspBl). Как Hsp27, так и осВ-кристаллин экспрессируются в большом количестве в мышечной ткани, и их содержание увеличивается в ответ на различные повреждающие воздействия. Весьма вероятно, что одна из функций этих белков - это взаимодействие с актином и миозином (главными белками сократительного аппарата мышц) при неблагоприятных условиях. Изучению взаимодействия sHsp с актином было посвящено довольно много работ; в частности, было показано, что эти белки не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не влияют на процесс тепловой денатурации актина, но при этом эффективно предотвращают его тепловую агрегацию, образуя небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином [Pivovarova et al, 2005; Pivovarova et al, 2007]. Значительно меньше было известно о взаимодействии sHsp с миозином. К моменту начала наших исследований этому вопросу была посвящена всего одна работа [Melkani et al, 2006], в которой было показано, что в условиях, имитирующих тепловой шок (инкубация при 43 С), осВ-кристаллин не только предотвращает агрегацию скелетномышечного миозина, но также частично подавляет инактивацию его АТРазы. Исходя из полученных результатов, авторы указанной работы заключили, что в условиях теплового шока sHsp могут взаимодействовать с головками миозина и предотвращать их тепловую денатурацию (приводящую к агрегации и инактивации АТРазы) [Melkani et al, 2006]. Подобные заключения, однако, представлялись нам весьма странными, особенно в свете результатов исследований взаимодействия sHsp с актином. Вследствие этого, одной из целей данной
работы стало подробное исследование влияния sHsp на процессы тепловой денатурации и агрегации миозиновой головки. Важно отметить, что сам процесс тепловой агрегации миозиновой головки ранее почти не исследовался (особенно в условиях физиологической ионной силы), поэтому другой не менее важной целью настоящей работы было детальное исследование этого процесса.
Головки миозина могут быть изолированы путем ограниченного протеолиза молекул скелетномышечного миозина. Изолированная головка (называемая субфрагментом 1 миозина (S1)) состоит из двух главных структурных доменов - моторного (или каталитического, содержащего активный центр АТРазы и участки связывания с актином) и регуляторного. Последний (в случае S1, полученного путем химотрипсинолиза в отсутствие двухвалентных катионов) представляет собой длинную а-спираль, с которой нековалентно ассоциирована «существенная» (или «щелочная») легкая цепь. Эта легкая цепь существует в виде двух изоформ: А1 и А2. Основное отличие А1 от А2 - это наличие у нее дополнительной N-концевой последовательности из 41 остатка. Поэтому препарат S1, получаемый из миозина скелетных мышц, представляет собой смесь двух изоформ, содержащих только одну из этих легких цепей: S1(A1) или S1(A2).
Исследованию тепловой денатурации S1 посвящено довольно много работ. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) было установлено, что она полностью необратима; применение подхода «последовательного отжига» позволило выявить три тепловых перехода [Шныров и др., 1989; Levitsky et ah, 1990; 1991; 1992]. Были также сделаны попытки идентификации этих калориметрических переходов, т. е. выявления их соответствия определенным структурным доменам SI [Levitsky, 1994]. Стоит, однако, отметить, что метод «последовательного отжига» недостаточно строг и дает лишь приблизительную информацию о механизме тепловой денатурации белка. Кроме того, большинство работ было выполнено на смешанном препарате S1 (без его разделения на изоформы). В то же время детальное понимание процесса тепловой агрегации белка невозможно без знания детального механизма его денатурации. Стоит отметить, что относительно недавно в нашей лаборатории был предложен новый, физически более строгий метод анализа данных ДСК для необратимо денатурирующих белков. В результате еще одной целью данной работы было подробное исследование механизма тепловой денатурации изолированных изоформ S1 и возможный пересмотр полученных ранее результатов.
Цель и задачи работы. Итак, целью данной работы стало подробное изучение тепловой денатурации и агрегации S1 и влияния sHsp на эти процессы в условиях, приближенных к условиям теплового шока. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1). Методом ДСК провести подробные исследования тепловой денатурации препаратов S1(A1) и S1(A2) при двух значениях ионной силы: ~20 мМ и -120 мМ.
Провести математический анализ полученных данных с целью нахождения калориметрических доменов (т. е. участков молекулы, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга).
2). Исследовать тепловые изменения собственной триптофановой флуоресценциии S1 и тепловую инактивацию его АТРазы. Сопоставляя полученные результаты с данными ДСК, попытаться провести идентификацию калориметрических доменов S1, т. е. выявить их соответствие определенным структурным доменам S1.
3). Методами турбидометрии и динамического лазерного светорассеяния (DLS) исследовать механизм тепловой агрегации изоформ S1 при двух значениях ионной силы: ~20мМи~120мМ.
4). Изучить влияние малого белка теплового шока Hsp27-3D (Hsp27 с тремя имитирующими фосфорилирование заменами: S15D, S78D, S82D) на тепловую денатурацию S1, инактивацию его АТРазы, а также на агрегацию S1 в условиях,
имитирующих тепловой шок (43 С), при значениях ионной силы, близких к физиологическим (-120 мМ).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. На основании результатов проведенных исследований пересмотрен механизм
тепловой денатурации S1. Показано наличие двух калориметрических доменов в его
молекуле, причем менее термостабильный калориметрический домен идентифицирован
как регуляторный домен миозиновой головки, а более термостабильный - как моторный
домен.
Показано, что при значениях ионной силы, близких к физиологическим, изоформы S1 не различаются по характеру тепловой агрегации. Процесс агрегации при этом лимитируется денатурацией моторного домена. При инкубации в условиях низкой ионной силы (~20 мМ) S1(A1) агрегирует значительно быстрее, чем S1(A2). Предполагается, что в этих условиях агрегация S1(A1) по крайней мере частично обусловлена межмолекулярными взаимодействиями N-концевого сегмента легкой цепи А1.
Показано, что малые белки теплового шока не оказывают влияния ни на тепловую денатурацию S1, ни на инактивацию его АТРазы. При этом sHsp способны эффективно подавлять тепловую агрегацию S1 за счет образования устойчивых комплексов с частично или полностью денатурированными молекулами S1.
Научная новизна. Впервые детально исследован механизм тепловой денатурации и агрегации изоформ S1 с применением методов химической кинетики. Установлено наличие в молекуле S1 двух калориметрических доменов, причем более термостабильный домен денатурирует в две стадии. Существенные различия между изоформами S1 в кинетических параметрах денатурации выявлены только для первого калориметрического домена независимо от условий ионной силы. Проведена идентификация
калориметрических доменов и установлено, что менее термостабильный домен соответствует регуляторному домену миозиновой головки, а более термостабильный -моторному домену.
Показано, что в условиях высокой ионной силы (120-130 мМ) тепловая агрегация протекает одинаково у обеих изоформ S1, не зависит от концентрации белка и лимитируется необратимой денатурацией моторного домена. Более того, в этих условиях механизм тепловой агрегации S1 коренным образом отличается от такового для всех ранее исследованных белков: рост агрегатов осуществляется не за счет слипания стартовых агрегатов, а за счет последовательного налипания на эти агрегаты отдельных молекул S1, моторный домен которых частично денатурирован. Напротив, в условиях низкой ионной силы (20 мМ Hepes) обнаружена существенная разница в агрегации между двумя изоформами S1. Необратимая агрегация S1(A2) является следствием тепловой денатурации этой изоформы S1 и мало зависит от концентрации белка, а в случае S1(A1) отсутствуют какие-либо корреляции между тепловой денатурацией и агрегацией этой изоформы S1 и наблюдается выраженная концентрационная зависимость агрегации. Кроме того, показано, что в условиях низкой ионной силы спонтанная агрегация S1(A1) происходит даже при +4С. В последнем случае агрегация является полностью обратимой: образующиеся агрегаты легко разрушаются при повышении ионной силы раствора. На основании этих данных сделан вывод, что при низкой ионной силе агрегация S1(A1) не является прямым следствием тепловой денатурации белка и по крайней мере отчасти обусловлена взаимодействиями дополнительного N-концевого сегмента легкой цепи А1 с другими молекулами S1.
Показано, что в условиях ионной силы, близких к физиологическим, sHsp не влияют ни на тепловую денатурацию S1, ни на инактивацию его АТРазы, однако эффективно защищают его от тепловой агрегации, образуя устойчивые комплексы с частично или полностью денатурированным молекулами S1. В зависимости от весового соотношения sHsp/ SI рост агрегатов либо замедляется, либо подавляется вовсе.
Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации и агрегации сложных мультидоменных белков и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Отсутствие концентрационной зависимости и разницы между изоформами в кинетике роста агрегатов в условиях высокой ионной силы делают S1 особенно удобным объектом для исследования шапероноподобной активности малых белков теплового шока и других агентов, подавляющих тепловую агрегацию белков. Во-первых, отпадает необходимость разделения препарата S1 на изоформы, а во-вторых, эффект шаперона будет зависеть только от молярного (или весового) соотношения шаперон/S 1.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XVII
Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов
2010» (г. Москва, 2010), на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2008; 2010) и на 35-м Международном конгрессе FEBS (г. Ґетеборг, Швеция, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (3 статьи в рецензируемых журналах и 6 тезисов).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (2
главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( источников).
Диссертация изложена на страницах, содержит: 29 рисунков и 1 таблицу.
