Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1 Проблема решения дефицита белка в России и мире 7
1.2 Ботанико-физиологическая характеристика подсолнечника 11
1.3 Биохимическая характеристика семян подсолнечника 15
1.4 Белковый комплекс семян подсолнечника 19
1.4.1 Фракционный состав белкового комплекса 24
1.4.2 Аминокислотный состав и относительная биологическая ценность белков, полученных из семян подсолнечника 28
1.4.3 Функциональные свойства белков из семян подсолнечника... 32
1.4.4 Белковые продукты из семян подсолнечника и их применение в пищевой промышленности 32
1.5 Фенольный комплекс семян подсолнечника 47
1.5.1 Характеристика фенольного комплекса семян подсолнечника 47
1.5.2 Способы удаления фенольных соединений из белков подсолнечника 58
1.6 Заключение. Задачи исследования 65
2. Экспериментальная часть 67
2.1 Характеристика объектов исследования 67
2.2 Характеристика методов исследования и общая схема исследования 70
2.3 Результаты исследований 81
2.3.1 Химический состав семян исследуемых сортов подсолнечника 81
2.3.2 Белковый комплекс семян исследуемых сортов подсолнечника 84
2.3.3 Оценка функциональных свойств белков из исследуемых семян 90
2.3.4 Фенольный комплекс семян исследуемых сортов 93
2.3.4.1 Влияние ферментативной модификации белков подсолнечника на изменение содержания хлорогеновой и кофейной кислот 98
2.3.4.2 Влияние химической модификации белков подсолнечника на изменение содержания хлорогеновой и кофейной кислот 102
2.3.5 Разработка способа получения белковых продуктов из подсолнечных семян, свободных от хлорогеновой кислоты, с улучшенными биохимическими и функциональными характеристиками 115
2.3.6 Реализация способа получения белковых продуктов и экономическая эффективность 124
3 Общие выводы и рекомендации 126
4 Литература 128
Приложение А
Приложение Б
Приложение В
- Ботанико-физиологическая характеристика подсолнечника
- Белковые продукты из семян подсолнечника и их применение в пищевой промышленности
- Характеристика методов исследования и общая схема исследования
- Влияние ферментативной модификации белков подсолнечника на изменение содержания хлорогеновой и кофейной кислот
Введение к работе
Актуальность темы исследования подтверждается включением её в Hill Минобразования РФ «Научные исследования высшей школы по приоритетным
6 направлениям науки и техники» (№ госрегистрации 1200004210) и тематику НИР кафедры биохимии и технической микробиологии КубГТУ «Совершенствование и интенсификация послеуборочной обработки, хранения пищевого сырья и комплексной технологии получения продуктов питания на его основе» (№ регистрации КубГТУ 2.4.01-05 ( 47)).
Анализ научной литературы и потребностей пищевой промышленности в пищевых белках позволил нам сформулировать проблему нашего исследования в области биохимической характеристики семян подсолнечника современной селекции и белковых продуктов, полученных из обезжиренных семян с минимальным содержанием фенольных соединений.
Ботанико-физиологическая характеристика подсолнечника
В настоящее время в мире остро ощущается проблема дефицита белка. Примерно половина человечества страдает от недостатка белка, играющего уникальную роль в жизнедеятельности человека. Мировое производство белка составляет около 60 г в сутки на душу населения, при потребности в среднем 100 г и при крайней неравномерности распределения в различных странах. Общее его производство в 1,5 раза, а животного - в 3 раза меньше необходимого. Общий дефицит белка на планете оценивается в 10 - 25 млн. т. в год [16]. По данным института питания АМН ежегодный дефицит протеина в нашей стране составляет 1,6 млн.т [4].
В мировом производстве белка растительный белок составляет около 80%. По биологической ценности растительные белки уступают животным, в основном за счёт усвояемости, перевариваемости и сбалансированности аминокислотного состава. Однако осуществляемые комбинации растительных белков обладают недостаточно высокой пищевой и биологической ценностью [74].
Семена зерновых и масличных культур составляют основу мировых запасов продовольствия. Однако значительную часть их используют лишь косвенно, скармливая животным, а те, в свою очередь, дают белковые продукты, потребляя свыше 70% усвояемого белка на потребности своего организма. Поскольку население земного шара продолжает расти, потребность не только в производстве, но и в непосредственном продовольственном использовании семян зерновых и масличных культур будет все время увеличиваться. Примерно 70% мировых запасов белка имеют растительное происхождение и 30% - животное [3].
Согласно данным [57], начиная с 1990 г. потребление населением России белка постоянно снижалось и к 1998 г. достигло критических отметок. Степень его среднедушевого дефицита составила 30% от минимальных рекомендуемых величин, в том числе более 40% по растительному белку. По данным авторов [57], значительная часть россиян страдает белковой недостаточностью -заболеванием, являющимся следствием нарушения равновесия между синтезом и распадом белка в организме. Алиментарной причиной его возникновения является дефицит в рационе питания белка [79], содержащего все незаменимые аминокислоты.
Принято считать, что основным способом уменьшения риска или предотвращения заболевания является высокобелковая диета. Однако такой подход весьма условен, так как количество белка, содержащегося в продукте, всегда превышает количество белка, усвоенное организмом. Фактическое недополучение белка в большинстве случаев является следствием потребления человеком продуктов, способных полностью удовлетворить общие потребности организма в энергии за счет углеводов и жиров. Иными словами, проблема заключается в преждевременном добелковом насыщении организма калориями.
К числу приоритетных направлений государственной политики в области здорового питания населения России относятся: совершенствование технологии переработки пищевого сырья с целью наиболее полной его утилизации; расширение производства пищевого белка и белковых препаратов, дефицит которых остро ощущается в настоящее время; максимальное сохранение пищевой ценности и качества производимых продуктов за счет применения современных технологий, исключающих загрязнение как самих продуктов, так и окружающей среды [45].
Одним из важнейших источников получения растительного белка являются масличные культуры. Важнейшей масличной культурой нашей страны является подсолнечник, при переработке которого получают растительные масла и белки пищевого и кормового назначения [22]. Площади, занимаемые подсолнечником в России, неуклонно растут. По данным [88], 1997 по 2000 г посевные площади увеличились с 3583 до 5530 га, а сбор урожая с 2831 до 4150 ц. Среди основных достоинств подсолнечника как масличной культуры следует выделить большое содержание высококачественного масла в семенах, возможность механизации возделывания и выращивания на неполивных землях.
Белки семян подсолнечника имеют высокую пищевую ценность. В тоже время присутствие в семенах и продуктах их переработки фенольных соединений, которые представляют собой большей частью о-дифенолы -продукты изменения коричной кислоты, способные окисляться и превращаться в хиноны при контакте с кислородом атмосферы. Хиноны, соединяясь с белками, образуют темноокрашенные продукты, которые не усваиваются организмом человека. Наибольшее практическое значение имеет присутствие в белках подсолнечника хлорогеновой кислоты и близкой к ней кофейной кислоты, существенно осложняющих получение высокобелковых пищевых продуктов, не темнеющих при последующей тепловой обработке.
Поэтому белковые продукты из семян подсолнечника используют преимущественно в качестве белкового компонента в производстве комбикормов для сельскохозяйственных животных, и лишь ограниченно для обогащения хлебобулочных и кондитерских изделий, а также мясных продуктов, окраска которых может быть тёмной.
Несмотря на это перспективным является получение изолированных белков из обезжиренных семян подсолнечника и шротов, которые могут быть использованы в качестве обогатителей многих пищевых продуктов незаменимыми аминокислотами [49,83].
К сожалению, биохимические характеристики семян новых типов подсолнечника, созданных в последние годы селекционерами России и имеющих высокие урожайность и сбор масла с гектара посева, меньшую продолжительность вегетационного периода, пригодность к индустриальным методам возделывания и некоторые другие, изучены в качестве перспективного источника пищевого белка недостаточно. Нуждаются в обстоятельном исследовании способы удаления из белков фенольных соединений подсолнечника, определяющие возможность и перспективность промышленного получения подсолнечного белка, свободного от фенольных соединений.
Известные в настоящее время способы очистки белков подсолнечника от фенольных соединений путем обработки н-бутанолом, изопропанолом, этанолом, сульфитами, перекисью водорода [61, 105, 111, 112] или малоэффективны, или нетехнологичны. Для них характерна высокая сложность последующего освобождения белков от применяемых реагентов. Не менее существенно снижение при такой обработке биологической ценности получаемых белков.
Белковые продукты из семян подсолнечника и их применение в пищевой промышленности
Белок выполняет в пищевых продуктах две основные функции. Способность белка выполнять пищевую или питательную функцию характеризует его биологическую ценность. Вторая функция - структурная. Она обеспечивает необходимую структуру, а также комплекс реологических и других физико-химических свойств перерабатываемых пищевых систем и готовых пищевых продуктов. Тем самым задаются консистенция, технологические и другие качества пищевых продуктов. Способность белка выполнять структурные функции, обеспечивая желаемые потребительские качества пищевого продукта, характеризуются широким комплексом физико-химических характеристик, объединяемых термином «функциональные свойства белка» [73].
Изучение функциональных свойств белков является ключевым научным направлением проблемы получения новых форм пищи, обеспечивая разработку рецептур многокомпонентных пищевых систем, выбор процессов и режимов их переработки в пищевые изделия.
К наиболее важным функциональным свойствам белка относят растворимость и набухание, способность стабилизировать дисперсные системы (пены, эмульсии и суспензии), образовывать гели, адгезионные и реологические свойства белковых систем, прядомость растворов белка и др.
Высокими функциональными свойствами характеризуются белки, хорошо растворимые в водных средах, способные образовывать высококонцентрированные растворы, суспензии и гели, а также эффективно стабилизирующие эмульсии и пены. Существенно, чтобы эти свойства могли проявляться при рН, температуре и составе систем, характерных для процессов переработки и выделения белка, а также для готовых пищевых продуктов. Растворимость белка более чем другие физико-химические характеристики чувствительна к изменению фракционного состава белка, степени его денатурации, деструкции и модификации. Повышение растворимости белка благоприятно для увеличения устойчивости стабилизируемых им эмульсий и пен, но неблагоприятно для тестообразующих свойств белковых суспензий и сорбции ими жиров. Растворимость белка чаще всего характеризуют коэффициентом (индексом) растворимого азота (КРА) или коэффициентом (индексом) диспергируемости белка (КДБ). В первом случае определяют количество азота (в % от общего), а во втором - количество белка (в % от общего), перешедшего в раствор при контролируемых условиях растворения [67]. Растворимость белков обычно исследуют в широком диапазоне рН, концентрации солей и характеризуют кривыми зависимостей растворимости (КДБ и КРА) от этих переменных, называемыми профилями растворимости белков.
Увеличение растворимости белка при добавлении небольших количеств солей обусловлено тем, что их ионы экранируют межмолекулярное электростатическое взаимодействие заряженных боковых групп белка. Подавление белок - белкового взаимодействия увеличивает растворимость белка. При высоких концентрациях хорошо растворимых солей наряду с относительно небольшим количеством заряженных групп белка в растворе присутствует несравненно большее количество ионов соли, гидратация которых водой может снижать гидратацию молекул белка, т. е. раствор соли становится плохим растворителем для белка. Иначе говоря, снижение активности воды в растворе при введении большого количества диссоциирующих солей отвечает повышению активности белка в растворе и соответственному снижению его растворимости [73].
Повышение концентрации солей в растворе отвечает также росту гидрофильности растворителя и усилению гидрофобного белок - белкового взаимодействия. Высаливание (осаждение белка из водных растворов при высоких концентрациях соли) наиболее эффективно при ИЭТ белка. Обратный эффект увеличения растворимости белка в присутствии солей называют высаливанием, или солевым растворением.
Поверхностно-активные свойства белков, их поведение на поверхностях раздела фаз вода-масло, вода-газ имеют большое практическое значение при получении пищевых эмульсий и пен. Белки как стабилизаторы пен и эмульгаторы широко используют при получении традиционных и новых форм пищи. Так, пищевые белоксодержащие эмульсии играют важную роль при производстве аналогов молочных и комбинированных мясных продуктов, салатных заправок, соусов и т.д. белковые пены используют при производстве кремов, мороженого, взбивных кондитерских изделий, выпеченных изделий и т.д. в соответствии с разнообразием способов получения пищевых эмульсий и пен способность белка стабилизировать эти дисперсные системы в литературе обозначают множеством терминов (пенообразующая и Эмульгирующая способность, взбиваемость, аэрируемость и т.п.) и оценивают различными методами [73].
Снижение поверхностного натяжения растворов белка обусловливает снижение затрат работы на получение того же объема пены из растворов с одинаковой вязкостью, т. е. отвечает повышению пенообразующей способности белка. Стабильность пен обычно повышается при увеличении концентрации белка и вязкости его растворов. Минимальная стабильность пен характерна для изоэлектрической точки белка (ИЭТ). Для пен характерна способность сорбировать большие количества твердых тонкодисперсных частиц (белков, углеводов, липидов), приводящая к повышению устойчивости и упругих характеристик пен. Это свойство имеет большое значение для регулирования состава, стабильности и реологических свойств пен в различных пищевых изделиях.
По данным [23], пенообразующая способность ниже у белковой муки по сравнению с изолятами белка подсолнечника, по-видимому, вследствие меньшего содержания белка, а также из-за присутствия углеводов и хлорогеновой кислоты. Пенообразующая способность муки лишь слабо зависит от рН, а пеностабилизирующая способность уменьшается с возрастанием данного показателя. Увеличение рН сопровождается ростом пенообразующей и пеностабилизирующей способности в области рН 6-7. оба показателя возрастают с увеличением концентрации белкового изолята, однако темп нарастания снижается с ростом концентрации, т.е. по мере приближения к пределу растворимости белка. Пенообразующая способность чувствительна к скорости, а пеностабилизирующая способность - к продолжительности перемешивания. Поваренная соль повышает пенообразующую и пеностабилизирующую способности. Сахароза снижает эти показатели.
Характеристика методов исследования и общая схема исследования
Пробоподготовка: образец после гидролиза отбирали мерной пипеткой (дозатором) в количестве 0,05 см в пробирку Зппспдорфа, добавляли 0,1 см 10%-го водного раствора карбоната натрия, и 0,3 см раствора фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте. Содержимое тщательно перемешивали и оставляли на 35 минут при комнатной температуре для прохождения реакции между фенилизотиоцианатом и аминокислотами. Затем содержимое высушивали досуха в потоке теплого воздуха, добавляли 0,5 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивали, центрифугировали при 6000 об"1 в течение 5 минут, переносили в прибор и пневматическим методом под давлением 30 миллибар в течение 5 секунд дозировали пробу в капилляр. Концентрацию аминокислот в пробе определяли методом абсолютной калибровки. Градуировку прибора проводили с использованием калибровочных растворов соответствующих аминокислот.
Распределение электрофоретических фракций белков исследовали методом капиллярного электрофореза на анализаторе «Капель - 103 Р» (производитель г. Санкт-Петербург). Метод капиллярного электрофореза представляет собой сложную комбинацию различных по природе и свойствам процессов, происходящих в капилляре при приложении электрического ПОЛЯ. При наложении электрического поля, направленного вдоль капилляра, в капилляре возникает движение носителей электрических зарядов (в том числе ионов) во взаимно противоположных направлениях. Так как в диффузной части двойного электрического слоя присутствует некоторая избыточная концентрация катионов, их движение увлекает за собой вследствие молекулярного сцепления и трения всю массу жидкости в капилляре. Возникает так называемые элсктроосмотичсский поток (ЭОП), направленный к катоду, который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. Наряду с этим под действием электрического поля в капилляре имеет место электрическая подвижность ионов, а также элсктрофорстичсская подвижность других заряженных частиц.
Катиоипыс компоненты пробы двигаются к катоду, обгоняя электроосмотический поток. Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости элсктромиграции, поэтому на выходе капилляра катионные компоненты появляются первыми и тем раньше, чем больше электрическая подвижность данного иона. Нейтральные компоненты пробы перемещаются только под действием ЭОП, и появляются на выходе, когда его достигает зона пробы.
Анионные компоненты, перемещаясь к аноду, двигаются со скоростями, меньшими, чем скорость ЭОП. Некоторые из них, медленно мигрируя в поле, появляются на выходе после выхода ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, выходят из капилляра в прианодное пространство.
Если время нахождения пробы в капилляре (которое регулируется толщиной капилляра, скоростью ЭОП или, в меньшей степени, напряжением) различно, то на выходе капилляра вблизи катода наблюдаются зоны распределения, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы. Таким образом, происходит разделение исходной смеси. Регистрируя на выходе из капилляра изменения концентраций компонентов фотометрическим детектором, получаем электрофореграмму, представляющую собой набор последовательных пиков, возвышающихся над базовой линией и служащую основой для качественного и количественного анализа смеси. Первыми выходят самые тяжелые белковые фракции. Образцы к анализу готовили следующим образом: навеску 0,05г заливали 0,25см водного раствора 6М мочевины, перемешивали и оставляли на 12 часов. Центрифугировали, разбавляли водой в 2 раза и устанавливали в прибор для анализа. Фракционный состав белкового комплекса семян подсолнечника определяли по методу Осборна [62]. Фракционирование белков заключается в последовательном экстрагировании соответствующих групп белков из исследуемого материала дистиллированной водой, 10%-ным раствором NaCl и 0,2%-ным раствором NaOH. , Массовую долю сырой золы определяли по методике (ГОСТ 10847 - 74), предусматривающей сжигание образца в муфельной печи. Количественное определение содержания общего фосфора определяли по ГОСТ Р 51473-99. Качественный и количественный состав фенольного комплекса определяли методом капиллярного электрофореза на анализаторе «Капель - 103Р». Образцы к анализу готовили следующим образом: навеску 0,5г заливали 4,5см3 50%-ного этилового спирта, перемешивали и оставляли на 8 часов (при периодическом перемешивании). Верхний спиртовый слой еще раз разбавляли в 2 раза 50% этиловым спиртом, центрифугировали и устанавливали в прибор для анализа. Содержание хлорогеновой и кофейной кислот определяли по методике ВНИИЖ [63]. Количественное определение хлорогеновой кислоты основано на экстракции её из обезжиренного подсолнечного ядра семян или шрота 80%-ным раствором этилового спирта, хроматографировании спиртовых растворов для отделения хлорогеновой кислоты от сопутствующих ей других фенольных соединений, элюировании её водой из хроматограммы и измерении оптической плотности водных растворов в ультрафиолетовой области. Обезжиренный материал измельчали до прохода через сито с отверстиями 0,25 мм. Для извлечения хлорогеновой и кофейной кислот к навеске исследуемого образца добавляли 80%-ный водный раствор этилового спирта и настаивали 20-30 мин при непрерывном перемешивании. Экстракт отделяли ( центрифугированием. Экстракцию проводили восемь - девять раз. Затем объединенные экстракты упаривали на ротационно-вакуумном испарителе при температуре не более 50С. Упаренный экстракт количественно переносили в мерную колбу на 50 мл и объем раствора доводили до метки 80%-ным этиловым спиртом.
Влияние ферментативной модификации белков подсолнечника на изменение содержания хлорогеновой и кофейной кислот
Среди химических методов модификации функциональных свойств белков особое внимание уделяется методам, основанным на обработке субстратов растворами органических кислот, в частности, сукцинированию, ацилированию и цитрированию.
Сукцинирование белков путем обработки их янтарной кислотой приводит к повышению отрицательного заряда белковой молекулы благодаря присоединению сукцинильной группы — остатка янтарной кислоты - к катионным аминогруппам остатков лизина, а также к остаткам серина и треонина:
Сукцинирование вызывает электростатическое отталкивание одноименно заряженных карбоксильных групп и структура молекулы белка изменяется -11S глобулины распадаются на субъединицы [121]. При дальнейшем сукцинировании, согласно данным указанного автора, возможно развертывание глобулярной структуры мономера, что приведет к возрастанию вязкости раствора белка — помимо аминогрупп, в связывании ангидрида янтарной кислоты будут участвовать гидроксильные группы белка. По аналогичной схеме происходит модификация белков ацетилированием и цитрированием. При ацетилировании происходит замещение нейтральными ацетильными группами аминогрупп остатков лизина, а также гидроксильных 1 групп остатков серина, треонина и тирозина. В результате нейтрализации катионных аминогрупп возрастает отрицательный заряд молекулы и электростатической отталкивание приводит к диссоциации 11S глобулина на субъединицы, но этот эффект существенно слабее по сравнению с сукцинированием, хотя гидрофобность белков также заметно возрастает. Все рассмотренные виды модификации - ферментативная эндопротеиназами прорастающих семян, сукцинирование, ацетилирование и цитрирование - приводят к изменению функциональных свойств белков. Проведенные нами предварительные исследования модификации белков подсолнечных семян показали, что в результате изменения структуры белковых молекул под влиянием янтарной, уксусной и лимонной кислот возрастает эффективность извлечения фенольных соединений. Можно предполагать, что структурная модификация белков повысила доступность фенольных соединений, ранее экранированных в четвертичной и третичной структурах белковых молекул, что позволило перевести в раствор хлорогеновую кислоту. При проведении химической модификации белков сукцинированием, ацетилированием и цитрированием и последующего извлечения из белков хлорогеновой и кофейной кислот навески обезжиренных белков семян подсолнечника обрабатывали 2%-ными растворами исследуемых кислот. Опытным путем были выбраны следующие параметры обработки каждой из исследуемых кислот: температура 20С, гидромодуль был принят 1:10, продолжительности обработки 20 мин, рН водного раствора 4,5. Твердый осадок от водного раствора кислоты отделяли центрифугированием при 2000 об/мин. Данные операции с каждой кислотой и каждым белком повторяли трижды, после чего твердый осадок промывали дистиллированной водой до полного удаления кислоты. После высушивания при 20С полученного белкового продукта определяли содержание в нем массовых долей хлорогеновой и кофейной кислот. Полученные данные представлены в таблице 2.10. При сравнении результатов анализов, выполненных в сравнимых условиях, установлено, что при модификации сукцинированием водный раствор янтарной кислоты наиболее эффективен для удаления хлорогеновой и кофейной кислот из белков семян подсолнечника (рисунок 2.9). В белковых продуктах, подвергшихся сукцинированию, активной полифенолоксидазы обнаружено не было. Это дает основание утверждать, что данный фермент полностью удаляется водным раствором янтарной кислоты при рН 4,5 и водой. Как известно, максимальное проявление активности полифенолоксидазы проявляется в нейтральной среде, в связи с чем проведение структурной модификации в кислой среде обеспечивает минимальную активность данного фермента и предотвращает ферментативное окисление фенольных веществ в ходе процесса модификации. Как видно из таблицы 2.10 и рисунка 2.9, остаточное содержание хлорогеновой кислоты при сукцинировании уменьшается в 3,4 раза, по сравнению с белком, модифицированным обработкой раствором лимонной кислоты, и в 4,3 раза - чем модифицированным ацетилированием. Как показали проведенные нами предварительные испытания, обработка обезжиренной белковой муки раствором янтарной кислоты при разработанных режимах может привести к еще более полному удалению фенольных соединений и по сравнению с другими способами модификации гарантировать получение светлых белковых концентратов. Для получения белковых концентратов из семян подсолнечника, максимально свободных от фенольных соединений, важно не только выбрать наиболее эффективный модификатор - экстрагент, но и определить наиболее эффективные параметры проведения процесса.
