Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы
1.1. Свободнорадикальное окисление и органическая жизнь 11
1.1.1. Физические основы реакционной способности кислорода и основные виды активных форм кислорода в живой клетке 11
1.1.2. Основные источники и механизмы образования АФК в клетке 14
1.2. Свободнорадикальное окисление белков 19
1.2.1. Механизмы физико-химических реакций свободнорадикального окисления белков в живых организмах 19
1.2.2. Окислительная модификация белка и протеолиз 21
1.2.3. Окислительная модификация белка и старение 24
1.2.4. Окислительная модификация белка при патологии 25
1.3. Многообразие антиоксидантных систем в аэробных организмах 28
1.4. Свободнорадикальное окисление в мозге 33
1.4.1. Особенности кислородного метаболизма мозга 33
1.4.2. Роль СРО и белков в головном мозге 34
1.4.3. Антиоксидантные системы мозга 36
1.4.4. Онтогенетические и структурные особенности белкового метаболизма
в головном мозге 37
1.5. Пренатальный стресс 39
1.5.1. Изменения в поведении, вызванные пренатальным стрессом 41
1.5.2. Изменения гормонального статуса и медиаторных систем, вызванные пренатальным стрессом 43
2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы и методы 47
2.1.1. Определение продуктов окислительной модификации белков 47
2.1.2. Определение активности цитозолыюй Zn-Cu-супероксиддисмутазы 50
2.1.3. Выделение обогащенных фракций нейронов и нейроглии 52
2.1.4. Постановка опыта 54
2.1.5. Статистические методы 55
2.2. Результаты исследования 56
2.2.1. Окислительная модификация белков в некоторых отделах головного мозга контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза 56
2.2.1.1. Спонтанная окислительная модификация белков 56
2.2.1.1.1. Стриатум 56
2.2.1.1.2. Гиппокамп 57
2.2.1.1.3. Гипоталамус 60
2.2.1.2. Стимулированная реактивом Фентона окислительная модификация белков...62
2.2.1.2.1. Стриатум 62
2.2.1.2.2. Гиппокамп 64
2.2.1.2.3. Гипоталамус 66
2.2.2. Окислительная модификация белков в нейронах и нейроглии коры больших полушарий головного мозга контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза 68
2.2.2.1. Спонтанная окислительная модификация белков 68
2.2.2.1.1.Нейроны 68
2.2.2.1.2. Нейроглия 70
2.2.2.2.Стимулированная реактивом Фентона окислительная модификация белков...72
2.2.2.2.1. Нейроны 72
2.2.2.2.2.Нейроглия 74
2.2.3. Окислительная модификация белков в сыворотке крови контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза 76
2.2.3.1 Спонтанная окислительная модификация белков в сыворотке крови 76
2.2.3.2. Стимулированная реактивом Фентона окислительная модификация белков в сыворотке крови 78
2.2.4.Активность цитозолыюй супероксиддисмутазы в некоторых отделах головного мозга, клеточных фракциях коры больших полушарий и в крови контрольных и пренатально стрессированных крыс в разные сроки постнатального онтогенеза 80
2.2.4.1. Стриатум 80
2.2.4.2. Гиппокамп 81
2.2.4.3. Гипоталамус 82
2.2.4.4. Нейроны и нейроглия коры больших полушарий 83
2.2.4.5. Сыворотка крови 86
3. Обсуждение результатов 88
Выводы 100
Список литературы 102
- Физические основы реакционной способности кислорода и основные виды активных форм кислорода в живой клетке
- Изменения гормонального статуса и медиаторных систем, вызванные пренатальным стрессом
- Определение продуктов окислительной модификации белков
- Стимулированная реактивом Фентона окислительная модификация белков в сыворотке крови
Введение к работе
Актуальность темы
Психоэмоциональный стресс является одним из негативных последствий технического прогресса. Особую важность представляет изучение влияния стресса на организм, находящийся в состоянии беременности, в связи с тем, что негативные последствия выявляются у последующих поколений. Обнаружено, что пренатальное стрессирование животных изменяет гормональную индукцию у развивающегося эмбриона в период формирования структур головного мозга, отвечающих за регуляцию адаптивного поведения (Ордян, Пивина, Ракицкая и др., 2000; Шаляпина, Зайченко, Ордян и др., 2001). К таким структурам относят стриатум, гиппокамп и гипоталамус. В результате изменяется приспособительное поведение и снижаются адаптивные способности у взрослых потомков, что свидетельствует о фундаментальной перестройке функций ЦНС.
Как известно, формирование нервной системы у незрелорождающихся животных и человека завершается спустя длительное время после рождения (Дмитриева, 1981). Наиболее ответственный период в постнатальном онтогенезе - это период миелинизации, который завершается совершенствованием ЦНС. Любое изменение этого процесса неблагоприятно скажется на формировании миелиновых оболочек, что отразится на электрофизиологических процессах в мозге, и соответственно, повлечет за собой изменения функциональной активности ЦНС.
Известно, что все процессы, протекающие в ЦНС, связаны с модификацией клеточных мембран (Меньшов, Шишкина, Бурлакова и др., 1996). Окислительная модификация биомолекул мембран является одним из наиболее быстрых путей изменения их физико-химических параметров, что способствует приспособлению их молекулярной организации к изменившимся условиям среды и повышает жизнеспособность клеток (Burdon, 1996).
Исследования клеточных и молекулярных механизмов регуляции функциональной активности головного мозга показали, что в их основе лежат процессы свободнорадикального окисления (Гуляева, Левшина, Обидин, 1989). Реакции свободнорадикалыюго окисления - это реакции взаимодействия органических молекул с продуктами аэробного дыхания - активными формами кислорода, которые очень реакционноспособны. Сведения, относящиеся к процессу свободнорадикалыюго окисления белков крайне малочисленны. В последнее десятилетие установлено, что посттрансляционная модификация белка является начальной реакцией клетки на изменение условий ее функционирования (Дубинина, Шугалей, 1993; Stadtman, 1992). В
7 связи с участием белков нервной ткани в таких специфических процессах, как передача нервного импульса, образование синапсов, участие в процессах обучения и памяти становится очевидным влияние посттрансляционных модификаций белков, связанных с быстрым изменением конформации. Одновременно с этим, модификации белка, облегчающие его протеолитический распад, служат сигналами для изменения метаболизма клетки, что также участвует в срочной адаптации клетки к изменившимся условиям. Таким образом, изучение процессов свободнорадикального окисления белков становится в настоящее время актуальной областью исследований в биологии и практической медицине. Процессы свободнорадикального окисления в организме находятся под строгим контролем антиоксидантной системы (Владимиров, 1998). Особенностью метаболизма мозга являются интенсивные аэробные окислительные процессы и в ЦНС существует точно сбалансированная система «свободнорадикальное окисление - антиоксиданты». Патологическим для ЦНС является не само свободнорадикальное окисление, а нарушение его регуляции антиоксидантной системой.
Нервная ткань является наиболее чувствительной к такому дисбалансу в силу своих биохимических и функциональных особенностей. Несмотря на очевидную значимость посттрансляционной окислительной модификации белков в ЦНС, нами не найдено работ, исследующих роль окислительной модификации белка (ОМБ) в нормальном функционировании ЦНС и влияния пренатального стресса на этот процесс.
Цель и задачи исследования
Целью нашей работы было исследование в онтогенезе ОМБ и активности первичного звена антиоксидантной системы - цитозолыюй супероксиддисмутазы (СОД) в норме и после пренатального стресса в структурах мозга крыс, связанных с регуляцией адаптивного поведения.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1. Установить возрастную динамику показателей спонтанной и индуцированной
ОМБ у крыс в период постнатальной дифференцировки мозга и во взрослом состоянии в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе.
2. Определить эти же показатели в двух функционально различных клеточных
популяциях коры больших полушарий (нейронах и нейроглие) в онтогенезе.
3. Изучить возрастную динамику активности цитозолыюй СОД в стриатуме,
гиппокампе, гипоталамусе, нейронах и нейроглие коры больших полушарий.
4. Выявить действие пренатального стресса на изменение возрастной динамики
спонтанной и индуцированной ОМБ в указанных структурах.
5. Изучить влияние пренатального стресса на активность цитозольной СОД в
указанных структурах в течение постнаталыюго онтогенеза.
6. Для понимания общеорганизменных закономерностей становления равновесия
системы «оксиданты-антиоксиданты» и влияния на нее пренатального стресса исследовать процессы ОМБ и активность СОД в сыворотке крови в норме и после пренатального стресса
Основные положения, выносимые на защиту
В стриатуме гиппокампе и гипоталамусе интенсивно протекают процессы свободнорадикального окисления белков. Максимальная скорость свободнорадикального окисления белков отмечается на тридцатый день постнатального онтогенеза. Пренатальный стресс изменяет свободнорадикальное окисление белков. Наиболее выражены эти изменения в период интенсивной миелинизации, которые сохраняются во взрослом состоянии.
Максимальный уровень свободнорадикального окисления белков в нейронах и нейроглие коры головного мозга достигается к 30 дням постнатального онтогенеза и снижается во взрослом состоянии. В нейронах и нейроглие пренатально стрессированных животных уровень свободнорадикального окисления белков значительно снижен по сравнению с нормой. Свободнорадикальное окисление белков является важной составляющей системы становления метаболизма и созревания нервной системы.
Активность СОД в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе, а также в нейронах и нейроглие коры головного мозга возрастает к тридцатому дню постнаталыюго развития и снижается во взрослом состоянии в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе. После пренатального стресса происходит увеличение активности СОД во всех исследованных отделах и снижение ее в нейронах коры головного мозга. В клетках нейроглии активность СОД не отличается от нормы.
Изменение уровня свободнорадикального окисления белков и активности СОД в сыворотке крови пренатально стрессированных животных по сравнению с нормой свидетельствует о том, что пренатальный стресс оказывает влияние на развитие всего организма. Данные, полученные в сыворотке крови, могут быть отражением процессов, происходящих в ЦНС после экстремальных воздействий.
9 Научная новизна
Впервые установлено, что в отделах головного мозга, связанных с нейроэндокринной регуляцией адаптивного поведения, интенсивно протекают процессы свободнорадикалыюго окисления белков. При этом динамика накопления продуктов спонтанной ОМБ в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе сходна. Активность цитозольной СОД в процессе постнатального онтогенеза во всех исследованных отделах возрастает к 30 дню и снижается во взрослом состоянии.
Впервые исследовано влияние пренатального стресса на ОМБ в постнатальном онтогенезе. Обнаружено, что после пренатального стресса наблюдаются сходные изменения динамики накопления продуктов спонтанной ОМБ в исследованных отделах. Наиболее выражены эти изменения в период постнатальной дифференцировки нервной системы - в возрасте 10 и 20 дней. В этот период происходит интенсивная миелинизация головного мозга и завершается формирование связей гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы.
Впервые изучены процессы свободнорадикалыюго окисления белков и изменения активности СОД в системе нейрон-нейроглия в процессе постнатального онтогенеза в норме и после пренатального стресса. Динамика процессов свободнорадикалыюго окисления белков в нейронах коры больших полушарий коррелирует с возрастными изменениями свободнорадикалыюго окисления белков в исследованных отделах. Для глиальных клеток характерна более низкая интенсивность свободнорадикального окисления белков по сравнению с нейронами. Пренатальный стресс значительно снижает процессы свободнорадикалыюго окисления белков в нейронах и нейроглие.
Впервые установлено, что система свободнорадикалыюго окисления белков является компонентом метаболической системы ЦНС. Изменение ее активности коррелирует с процессами становления ЦНС и реагирует на такое внешнее воздействие, как пренатальный стресс.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты, представленные в диссертации, являются приоритетными и имеют большое научно-практическое значение, так как дают целостную картину роли процессов ОМБ и компонентов антиоксидантной системы в обеспечение гомеостаза организма. Данные о процессах ОМБ в головном мозге в онтогенезе свидетельствует об участии этой посттрансляционной модификации белков в становлении ЦНС
Полученные данные вносят вклад в понимание патогенетических механизмов пренатального стресса, связанных с дискоординацией в сроках становления функций ЦНС, которые обуславливаются процессами свободнорадикального окисления.
Результаты сопоставления ОМБ в головном мозге и сыворотке крови, продемонстрировавшие корреляцию процессов свободнорадикального окисления в головном мозге и сыворотке крови после пренатального стресса, могут быть использованы при разработке профилактических мероприятий, направленных на нормализацию биохимических процессов в головном мозге после пренатального стресса.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на конференции «Нейроэндокринология» 2003, 2005 (СПб, 2003, 2005), IV Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2005), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (СПб, 2005), I Съезде физиологов СНГ(Дагомыс, 2005).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ: 4 статьи и 5 тезисов. Работа
поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга для молодых ученых за 2002,2003 гг.
Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, включающих 8 рисунков и 17 таблиц. Список литературы включает 245 работ.
Физические основы реакционной способности кислорода и основные виды активных форм кислорода в живой клетке
Процессы биологического окисления являются одними из наиболее распространенных видов химических реакций, протекающих в жизни аэробных организмов и обеспечивающих их жизнедеятельность. Особенностью таких реакций является их окислительно-восстановительный характер, когда в ходе реакции сопряженно протекает окисление одного из реагирующих агентов и восстановление другого. Сущностью этих реакций является перенос электронов с окисляемого субстрата на восстанавливаемый или от восстановленного вещества к окислителю (Барабой и др., 1992).
В реакциях биологического окисления в качестве окисляемого субстрата выступают сложные органические соединения (углеводы, белки, липиды, нуклеиновые кислоты), а в роли окислителя и акцептора электронов - молекулярный кислород.
Молекулярный кислород появился в земной атмосфере около 2,5 109 лет назад в результате фотосинтетической деятельности сине-зеленых водорослей. Он является основным и незаменимым химическим компонентом для жизни подавляющего большинства организмов на Земле, однако, наряду с этим он обладает явно выраженной токсичностью. Поэтому, жизнь этих организмов возможна только благодаря многоплановым механизмам защиты. При этом избытка противокислородной защиты в клетке не существует, и млекопитающие гибнут при помещении их в атмосферу с концентрацией кислорода всего лишь в 5 или 10 раз выше, чем в обычном воздухе (Пескин, 1998). Вообще в природе нет свободно живущих организмов, которые могут длительное время находится под действием кислорода в концентрации более высокой, чем в воздухе (Фридович, 1979).
В чем причина токсичности кислорода для жизни, и каким образом аэробные организмы решают задачу существования в условиях земной атмосферы? Ответу на этот вопрос посвящена первая часть обзора литературы.
Молекулярный кислород в основном состоянии содержит два неспаренных электрона, располагающихся на разрыхляющих р - и у - орбиталях. Они имеют параллельные спины, что придает молекуле парамагнитные свойства. Это обстоятельство накладывает энергетический запрет на непосредственное взаимодействие со спаренными электронами. Необычное основное состояние молекулы кислорода объясняет его высокую устойчивость и кинетическую инертность в различных химических реакциях, несмотря на то, что все реакции присоединения кислорода экзотермичны.
Причина кинетической инертности кислорода заключается в том, что большинство органических соединений - как субстраты, так и продукты окисления - являются по своей электронной структуре диамагнитными синглетными соединениями, т.е. содержащими на своих орбиталях только спаренные электроны. Условием для вступления триплетного кислорода в реакцию с синглетным соединением и образованием в результате синглетных продуктов является обращение спина электрона. Инверсия спина электрона - процесс медленный по сравнению со временем жизни комплексов, образующихся в момент соударения реагирующих частиц. Поэтому не существует прямых реакций между триплетными и синглетными соединениями.
Для того чтобы кислород из химически инертного триплетного состояния перешел в реакционно-способное, необходимо его активировать. Превращение триплетного кислорода в синглетный вследствие перехода одного из электронов, локализованного на разрыхляющей орбитали, на другую орбиталь, т.е. формированием диамагнитного кислорода с выраженными электрондонорными свойствами происходит в живых клетках в фотохимических реакциях, связанных с возбуждением пигментов (хлорофиллов, порфиринов, ретиналя, флавинов(Арчаков, 1989).
Как побочный продукт, синглетный кислород обнаружен в ряде процессов: в самопризвольной, некатализируемой реакции дисмутации супероксидных ионов, реакции разложения перекиси, перекисного окисления липидов в микросомах, биосинтезе простагландинов (Фридович, 1979). Но основным путем активации кислорода в клетке является его восстановление в активных центрах ферментов - оксидаз и оксигеназ.
При оксидазном четырехэлектронном восстановлении кислорода в молекуле Ог (0=0) разрываются обе связи, присоединения кислорода к окисляемому субстрату не происходит, а каждый из атомов кислорода восстанавливается до воды. При оксигеназном окислении происходит образование связи между кислородом и субстратом. При монооксигеназном окислении происходит присоединение одного атома кислорода. По такому пути функционируют системы микросомалыюго окисления ксенобиотиков. При диоксигеназном окислении происходит присоединение двух атомов кислорода с разрывом одной связи (-0-0-S) с образованием пероксидных соединений. (Хавинсон, 2003, Владимиров, 1998). На рис.1 представлена схема электронного строения р-орбитали молекулы кислорода и ее изменения при превращении в активные метаболиты.
Характерным признаком свободных радикалов является наличие одного или более неспаренных электронов на молекулярной или внешней (валентной) атомной орбите. Наличие неспаренного электрона определяет высокую химическую активность свободного радикала, который, стремясь приобрести недостающий электрон, вступает в различные химические реакции. Перенос одного электрона на молекулу кислорода сопровождается образованием супероксидного радикала, который является по редокс-потенциалу в водном окружении (О2/О2" = -ЗбЗмВ) восстановителем. В неводной гидрофобной среде или в координационой сфере металла редокс-потенциал этой пары резко возрастает, превращая супероксидный ион в сильный окислитель.
Образование супероксида происходит при работе митохондриальной и точную химическую природу АФК не представляется возможным в силу их нестабильности и легкости перехода одной формы в другую. Только синглетный кислород может прямым, некатализируемым путем самопроизвольно превращаться в химически инертный триплетный, причем эта реакция сопровождается люминесценцией. Супероксидный радикал в реакции дисмутации превращается в Н2О2 и синглетный кислород в случае спонтанной реакции или триплетный в случае, если процесс был ферментативным. Реакция, получившая название реакции Габера-Вейса описывает процессы образования ЮН из супероксидного иона в присутствии металлов переменной валентности: Н2О2 в реакции Феитона распадается в присутствии ионов металлов переменной валентности в восстановленном состоянии также с образованием ЮН: Н202 +Fe2+ - Fe3+ +ОН + ОН
В целом, в нормальных условиях около 5% поглощаемого организмом кислорода превращается в активные формы(Кулинский, Колесниченко,1993), которые различаются по времени их жизни. Перекись водорода (время полужизни 10-100 с) и супероксидный ион (время полужизни - менее 1 10 ) являются относительно стабильными и могут диффундировать на значительные расстояния и проходить через клеточные и внутриклеточные мембраны. Синглетный кислород имеет время полужизни t=2 10"6 с, ОН -7 10 10 с. Таким образом, ОН является самым реакционноспособным и вступает в окислительные реакции в месте своего образования.
Наряду с перечисленными, в клетке также происходят ферментативные и неферментативные реакции, в результате которых образуются такие свободно-радикальные продукты как гипохлорит, оксид азота и пероксинитрит.
Изменения гормонального статуса и медиаторных систем, вызванные пренатальным стрессом
Как уже упоминалось, большинство авторов, исследовавших последствия пренатального стресса, отмечают изменения в работе ГГАС. Weinstock (2002) отмечает, что пренатально стрессированные крысы характеризуются большим выбросом CRF в лимбической системе в ответ на стимуляцию. Это может быть причиной депрессивно-подобного поведения у пренатально стрессированных животных. Lesage и др. (2002) исследовали ограничения в потреблении пищи у беременных крыс на развитие ГГА оси у потомства. При исследовании взрослых 4-месячных пренатально стрессированных самцов выяснилось, что пренатальный стресс уменьшает вес тела и содержание кортикостероид-связывающего глобулина, но увеличивает экспрессию гена рецептора минералкортикоидов в области СА1 гиппокампа. Все это вместе с увеличением базального уровня кортикостерона приводит к увеличению связывания кортикостерона с клетками-мишенями. Secki (2002) и Mattews (2002) упоминают о раннем программировании ГГАС введением синтетических глюкокортикоидов матери или пренатальным стрессом. Koenig и др. 2002 предполагают связь между выбросом глюкокортикоидов матери, нарушением развития мозга плода и последующим заболеванием шизофренией.
В работе Kanitz et al. (2003) показано, что наряду с увеличением количества глюкокортикоидных рецепторов в гиппокампе наблюдается снижение этих рецепторов в гипоталамусе в первый постнатальный день. Эти авторы не обнаружили изменения минералкортикоидных рецепторов в гиппокампе. Kaiser и др. (2003) отмечают увеличение количества рецепторов к половым стероидам (андроген-рецептор и б-рецептор эстрогена) в структурах лимбического круга у пренатально стрессированных самок морских свинок. Leonhardt и др. (2002) отмечают, что пренатальный стресс (недоедание) вызывает у потомства увеличение экспрессии генов рецепторов как минералкортикоидов, так и глюкокортикоидов в гиппокампе. Другие авторы (Stone et al., 2001) связывают фактор риска развития шизофрении после пренатального стресса с воздействием кортикостерона на ГАМК системы в гиппокампе плода. Ими показано, что кортикостерон оказывает воздействие на процессы транскрипции и трансляции мРНК ГАМК-рецепторов гиппокампа.
При исследовании медиаторных систем исследователями отмечается нарушение функционирования большинства медиаторов в ЦНС вследствие нарушения рецепторного аппарата. Так, Kinnunen и др. (2003) при исследовании НМДА-рецепторного комплекса фронтальной коры пренатально стрессированных крыс выявили значительные изменения по сравнению с контролем, причем эти изменения были аналогичны выявленным у больных шизофренией и больных с биполярными расстройствами психики. Авторы делают вывод, что пренатальный стресс в критические периоды развития ЦНС репрограммирует ответ ГГАС на острый стресс и изменяет экспрессию генов, что может нарушать синаптическую функцию.
Salchner и др. (2003) исследовали экспрессию FOS-генов, как показателя нейрональной активации у 24-месячных пренатально-стрессированных крыс после плавания. Обнаружено увеличение экспрессии после плавания в гиппокампе, амигдале, септуме и locus cereleus. Авторы приходят к выводу о влиянии пренаталыюго стресса на структуры, связанные с автономной и нейроэндокринной регуляцией. Takahashi и др. (1992) показали, что пренатальный стресс уменьшает содержание норадреналина во фронтальной коре, при этом содержание метаболитов норадреналина увеличивается. Авторы заключают, что пренатальный стресс увеличивает оборот норадреналина. Аналогичные наблюдения сделаны для дофамина.
При исследовании влияния пренатальной инфекции на функции мозга выявлено значение образования гидроксильных радикалов и функционирования глутаматных рецепторов (Cambonie et al., 2004). Другие исследователи (Berdger et al., 2002) также отмечают, что пренатальный стресс изменяет количество медиаторных рецепторов ЦНС. Количество дофаминовых Дг рецепторов, НМДА- рецепторов во фронтальной коре, СА-поля гиппокампа и nucleus accumbens (NA) возрастает у пренатально стрессированных крыс по сравнению с контролем. Группа III метаботропных глутаматных рецепторов увеличивается во фронтальной коре пренатально стрессированных крыс, но во всех других обследованных областях мозга содержание этих рецепторов снижается. Эти результаты доказывают, что формирование и развитие кортикостриальных и кортиколимбических путей может быть изменено под воздействием пренатального стресса. Именно этот факт может лежать в основе предрасположенности пренатально стрессированных особей к патологиям ЦНС.
При исследовании алкоголизации плода обнаружено изменение активности транскрипционных факторов, связанных со свободнорадикальным балансом - NFkb и АРІ. В первый постнатальный день выявлено уменьшение транскрипционной активности этих белков. Уровень глутатиона и каталазной активности при этом не изменялся (Acquaah-Mensah et al., 2002). Под воздействием пренатального стресса изменяются процессы белкового синтеза в гиппокампе (Jobe, 2003). Изменяется число клеток гранулярного слоя гиппокампа, связывающих БДУ, уровень экспрессии белков нейроналыюй клеточной адгезии, синаптофизина, экспрессии BDNF. Однако клеточная пролиферация не изменилась.
Отмечается уменьшение апоптотических клеток в гиппокампе (22-ой и 27-ой день постнатального развития) пренатально стрессированных крыс, что сопровождалось снижением с возрастом активности каспазы 3. Воздействие стресса на пренатально стрессированных животных приводит к увеличению активности каспазыЗ по сравнению с контролем (Ladefoged et al., 2004).
Таким образом, можно сделать вывод, что в результате пренатального стресса нарушаются многочисленные молекулярно-клеточные механизмы, связанные с механизмами внутриклеточной и межклеточной трансдукции. Часть этих нарушений является, вероятно, следствием компенсаторных искажений, но так или иначе, все это приводит к нарушениям в функционировании ЦНС и высших функций мозга.
Несмотря на обилие данных о роли АФК и ОМБ в патогенезе заболеваний и старения, на настоящий момент исследователями практически не рассматривалась роль ОМБ в норме, хотя некоторыми авторами и подчеркивается важность функции АФК как сигнальных молекул, причем не только NO, но и супероксида и гидроксилыюго радикала (Пескин, 1998, Скулачев, 1997), а также продуктов взаимодействия АФК с белками, липидами и ДНК (Burdon, 1996; Halliwell, 1998, 2004). Процессы ОМБ в нормальном онтогенезе мозга вообще не изучались до настоящего времени, хотя их непосредственное участие в таких процессах как синтез белка, протеолиз, активация БТШ и транскрипционных факторами можно считать доказанной. Фрагментарны и противоречивы сведения об антиоксидантных системах мозга. Также следует отметить полное отсутствие работ по роли и АФК и ОМБ в патогенезе пренатального стресса. При этом на основании уже имеющихся в литературе данных можно заключить, что функция ОМБ в системах быстрого реагирования, в сигналинге ЦНС, связанном с адаптацией, не подлежит сомнению. Таким образом, очевидна необходимость в изучении процессов ОМБ в ходе онтогенеза нервной системы. Кроме того, понимание роли процессов ОМБ в патогенезе нарушений, вызванных пренатальным стрессом, может дать ключ к пониманию патогенетических механизмов развития отдаленных последствий этого явления.
Определение продуктов окислительной модификации белков
Для выделения нейронов и нейроглии использовали метод Селинджера и др. (1971) в модификации Флерова (1979). Принцип метода заключается в получении клеточной суспензии с последующим выделением и очисткой нейрональной и нейроглиальной фракций ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы и фиколла. При этом клеточную суспензию получали путем дезинтеграции ткани при пропускании ее через нейлоновые и металлические сита с последовательно уменьшающимся размером пор. Для облегчения дезинтеграции ткань предварительно обрабатывали раствором поливинилпирролидона (ПВП). Реактивы 1. Для обработки ткани коры а) для первой обработки: 50 мл 7,5% ПВП, 1% БСА на ЮмМ СаСЬ, б) для второй обработки: 50 мл 7,5% ПВП, 5% фиколл на 1%БСА, в) для суспендирования нейронов: 0,25М сахароза на воде. 2. Для приготовления градиентов а) растворы сахарозы на 1% БСА следующих концентраций: 1,0М; 1,2М; 1,65М; 1,75М б) растворы сахарозы на воде: 1,0М; 1,75М в) 30% фиколл на 1% БСА. Градиенты готовили за 1-2 часа до начала работы и хранили при -4С. Ход выделения. Для получения необходимого количества нейронов и нейроглии в пробу брали 2-3 г коры (4-6 животных). Ткань измельчали бритвой на холоду (+3С), суспендировали в 10-кратном объеме гипотонического раствора, содержащего 7,5% ПВП, ЮмМ СаСЬ и 1% БСА. Полученную клеточную суспензию оставляли в растворе ПВП на льду на 10-15 минут, а затем фильтровали через нейлоновые сита с диаметром пор 258 и 82мк и металлическое сито с диаметром пор 58мк. Для этого использовали специальный держатель, который подсоединяли к водоструйному насосу и помещали в стакан со льдом. Через каждое сито пробу пропускали по 3 раза, что необходимо делать для наилучшей дезинтеграции.
Полученную тканевую суспензию наносили на первый градиент, состоящий из 6 мл 1,75М сахарозы и 6 мл 1,0М сахарозы на 1% БСА. Пробы центрифугировали в течение 30 минут при 20 000. об./ мин. в центрифуге VAC25, (g-18 000), используя ротор SWOUT 50x3. В результате центрифугирования на 1,0 М сахарозе задерживаются обрывки клеточного дебриса и миелин, которые отбрасывали. Осадок, полученный после центрифугирования, содержал нейроны с незначительными примесями капилляров и голых ядер. В интерфазе между 1,75М сахарозой и 1,0М сахарозой образовывался плотный слой, состоящий из глии, нейронов и капилляров, который подвергали дальнейшей очистке.
С этой целью полученный плотный слой подвергали вторичной обработке раствором ПВП. Для этого его переносили в пробирки с 15 мл раствора, содержащего 7,5% ПВП, 5% фиколл и 1%БСА, суспендировали и трижды фильтровали через металлическое сито (58мк). Полученную клеточную суспензию наносили на второй градиент, содержащий 6мл 1,65М сахарозы , 6 мл 1,2М сахарозы и 3 мл 30% фиколла, приготовленных на 1%БСА. Пробы центрифугировали в течение 30 минут при 20 тыс. обУмин. После центрифугирования получался осадок и два слоя. Верхний слой на границе сахарозы и фиколла, содержащий мелкий дебрис и миелин, отбрасывали. Средний слой, так называемый «сырой глиальный», состоял из нейроглии с небольшой примесью нейронов и клеточного дебриса. Его отсасывали и переносили в центрифужные пробирки, которые затем центрифугировали 10 минут при 10 000. обУмин. в центрифуге К-24. Поскольку ранее было выяснено, что на данном этапе выделяется максимальное количество глиальных клеток, а количество примесей невелико, дополнительную очистку глиальной фракции не проводили, поскольку это связано с затратами времени, что может неблагоприятно отразится на содержании продуктов перекисного окисления белков.
Осадок, полученный на этой стадии выделения, содержал значительные количества нейронов. Его очищали от глии и капилляров с целью получения дополнительного количества нейронального материала. Для этого осадок суспендировали в 15мл 0,25Мсахрозы, пропускали через металлическое сито и наслаивали на градиент, содержащий по 6 мл 1,75 М и 6 мл 1,0М сахарозы, приготовленных на НгО. В результате центрифугирования при 20 000. обімин в течение 30 минут получали осадок, состоящий в основном из тел нейронов, при этом большая часть капилляров и нейроглии задерживалась в интерфазе между 1,0М и 1,75М сахарозы. Осадок нейронов объединяли с нейрональной фракцией, которая была получена после первого центрифугирования. Объединенный осадок нейронов и глиальную фракцию отмывали от сахарозы высокой плотности физиологическим раствором и, после центрифугирования в течение 10 минут при 7 тыс. обУмин в центрифуге К24 (3 500g), использовали для определения содержания продуктов перекисного окисления белков и активности СОД.
Опыты проводили на крысах линии Wistar. Все крысы были приучены к хэндлингу в течение предварительного акклиматизационного периода продолжительностью 1 месяц. Для получения потомства молодых самок (п=40) содержали по 5 особей в клетке при t"C 18 -22С, световом режиме 12:12, свободном доступе к воде и сухому корму. В каждую клетку подсаживали по 2 самца той же линии. У самок, начиная со следующего дня после подсадки, ежедневно брали мазок из влагалища для определения фазы эстрального цикла и наличия сперматозоидов. Нулевым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищном мазке. Всех беременных крыс разбивали на две группы -контрольную и опытную. Опытную группу (п=20) подвергали иммобилизационному стрессу в узких пластиковых пеналах (20x7x6 см) по Ічасу в течение 4х дней - с 16 по 19 день беременности. Самки второй группы (п=20) оставались интактными. За 1-2 дня до родов самок рассаживали в индивидуальные клетки. День рождения крысят считали нулевым днем жизни.
Всего было исследовано 450 контрольных и пренатально стрессированных животных. Возраст исследуемых крыс был выбран с учетом критических периодов в постнатальном развитии нервной системы. Как известно, у незрелорождающихся животных функциональное созревание нервной системы происходит уже после рождения. У крысят на 13-15 день открываются уши, глаза. Включение всех сенсорных систем ведет к бурному формированию новых функциональных систем и связей. Этот период связан с важными биохимическими преобразованиями в нервной системе, обусловленными процессами миелинизащш нервных волокон. 10-дневные крысята еще незрячие, процесс миелинизации только начинается. Пик интенсивной миелинизации отмечается на 15-20 дни. К 30 дням процессы дифференцировки в основном заканчиваются, масса головного мозга составляет 90% от массы мозга взрослого животного. К 100 дням заканчивается созревание и интеграция всех систем организма, в том числе нервной, эндокринной и половой. В связи с этим для исследования брали животных в возрасте 10, 20, 30 и 100 дней. В группах 10 и 20 дней у взятых животных половые различия в исследованных показателях отсутствовали и при исследованиях использовали и самцов, и самок. В возрасте 30 и 100 дней у самок было обнаружено влияние астрального цикла на процессы свободнорадикального окисления, поэтому в этом возрасте исследовали только самцов.
В одном эксперименте использовали одновременно до 25 животных контрольной и опытной групп. Крыс декапитировали, собирали кровь в центрифужные пробирки. Пробирки с кровью хранили на холоду, а затем центрифугировали при 200g в течение 10 мин., сыворотку отбирали и использовали ее для определения содержание продуктов ОМБ и активности СОД. Одновременно быстро извлекали на холоду головной мозг и выделяли отделы мозга: гиппокамп, стриатум (полосатое тело), гипоталамус и кору больших полушарий. Ткань гиппокампа, стриатума и гипоталамуса взвешивали и гомогенизировали в Na-K-фосфатном буфере, концентрация и объем которого зависели от цели исследования - определения продуктов ОМБ или активности СОД.
Стимулированная реактивом Фентона окислительная модификация белков в сыворотке крови
В настоящее время детально изучены строение, надмолекулярные структуры и функции наиболее важных компонентов клетки (белков, липидов, нуклеиновых кислот), взаимосвязь генетического кодирования и биосинтеза белков, исследуются механизмы клеточной дифференцировки и программируемой клеточной смерти. На фоне многообразных теоретических достижений накоплен огромный объем биохимических исследований и клинических наблюдений, свидетельствующий о существовании феномена внутренних резервов организма для преодоления неблагоприятных внешних воздействий и выхода из патологических состояний. Существование этого феномена базируется на явлении гомеостаза всех уровней - клетки, органа и организма. Живая система обладает свойством изменятся под воздействием внешних условий, но при этом сохранять постоянство своей внутренней среды и основных функций. Такая саморегуляция в биологических системах обеспечивается эндогенными, в том числе и генетическими, корректировками программы существования в соответствие с полученной информацией об изменениях внешней среды. Изучение преобразований этих изменений в сигналы, восприятие этих сипіалов и формирование адекватных реакций организма становятся в настоящее время одним из приоритетных направлений в науке.
Высокая скорость свободнорадикальных реакций, их вездесущность и возможность, тем не менее, строго регулироваться на всех уровнях живой системы дает основания предполагать, что именно с ними могут быть связаны первые этапы в восприятии изменений внешней среды и преобразование этих изменений в сигналы. Свободнорадикальные трансформации белков, липидов и нуклеиновых кислот могут служить в качестве переходного сигнала от внешней среды к системам саморегуляции оргаїіизма. При этом, если свободнорадикальное окисление липидов, как правило, есть результат внешнего воздействия на мембрану клетки, то свободнорадикальное окисление белков и нуклеиновых кислот в большей степени является отражением функционирования внутриклеточных систем. Как известно, абсолютное большинство сигнальных систем клетки связано с белками. Поэтому свободнорадикальное окисление белков можно рассматривать как систему внутриклеточного опосредования, модуляции и передачи информации как от внешней среды к внутриклеточным системам, так и от клетки в окружающую среду.
Становление таких систем регуляции как нервная и эндокринная является чрезвычайно важным этапом в образовании системы саморегуляции организма. Сейчас известно, что эти процессы протекают взаимосвязано и обладают значительным влиянием друг на друга. Это влияние осуществляется через множество колец положительной и отрицательной обратной связи. На первых этапах онтогенетического развития доминирующая роль принадлежит гуморальным факторам, однако по мере дифференцировки формирующиеся нервные пути начинают воздействовать на процессы в нервной системе.
Как известно, дифференцировка нервной системы проходит ряд критических этапов. В пренатальный период наиболее критическим считается период формирования структур нервной системы (период органогенеза). В постнатальной жизни одним из важнейших периодов считается период миелинизации, протекающий у крыс в возрасте 10-30дней. Любые воздействия в этот период, которые могут сказаться на процессе миелинизации, оставляют след вплоть до взрослого состояния, выражающийся в неполноценном функционировании ЦНС.
В настоящее время довольно подробно изучены процессы цитологических и гистохимических изменений в течение эмбриогенеза и постнаталыюго созревания головного мозга крысы. Изучены изменения активности ферментов энергетического обмена в процессе онтогенеза, синтез белка и митохондриальная активность. Однако представленные в литературе данные, как правило, фрагментарны и выполнены с помощью гистохимической техники. Кроме того, авторы зачастую не аргументируют выбор сроков исследования. При этом какие-либо работы о процессах ОМБ в процессе онтогенеза ЦНС нами не обнаружены.
Сравнение параметров ОМБ в отделах затруднено недостаточным освещением в литературе особенностей метаболизма стриатума, гиппокампа и гипоталамуса. Доступные сведения трудно использовать в интерпретации полученных нами данных, поскольку исследователи пользуются разными названиями при описании структур, использованных в работе. Кроме того, там, где достаточно четко определен объект исследования, речь, как правило, идет о целом мозге, коре больших полушарий, мозжечке, продолговатом мозге. Таким образом, эти данные при обсуждении полученных нами результатов могут быть использованы с определенной долей осторожности.
Нами было исследовано становление ОМБ в онтогенезе в течение такого критического этапа в формировании мозга, как миелинизация. Изученные структуры (стриатум, гиппокамп и гипоталамус) непосредственно связаны с реакцией целого организма на резкое изменение внешних условий. Все эти образования, так или иначе, включаются в лимбическую систему, функции которой имеют отношение к адаптивным процессам в ответ на стрессорные воздействия.
Как известно, особенностью метаболизма мозга является интенсивный окислительный обмен. При этом интенсивному поступлению кислорода в ткани мозга, и соответственно, его двухэлектронному восстановлению сопутствует повышенная концентрация субстратов свободнорадикального окисления. При этом активность антиоксидантных ферментов в ткани мозга довольно низка, что подтверждают наши данные (Вьюшина, 2005(a), 2005(6)). Очевидно, этот парадокс имеет под собой практическую основу - в процессе эволюции побочные продукты аэробного дыхания, обладающие рядом специфических свойств, нашли применение в функциональной активности такого сложного органа, как головной мозг.
Проведенное нами исследование становления ОМБ в течение постнатального онтогенеза у нормальных крыс Вистар в структурах, связанных с нейроэндокришюй регуляцией обнаружило как сходство, так и различия в исследованных отделах. При сравнении уровней ОМБ в стриатуме гиппокампе и гипоталамусе на разных исследованных сроках обращает на себя внимание общий профиль изменения интенсивности ОМБ в процессе постнатального онтогенеза. Вероятно, это связано как с определенной консервативностью оелкового состава этих структур, так и с тождественностью функций ОМБ в этих структурах. При этом если базальный уровень ОМБ достигает своего максимума в этих структурах в целом, к JU дням, то индуцированный уровень ОМБ максимален уже в 20 дней. Это может свидетельствовать как о том, что система контроля имь в 2U дней уже интенсивно функционирует, так и оо усиленном синтезе белковых предшественников в период интенсивной миелинизации. В то же время некоторые осооешюсти каждого исследованного отдела свидетельствуют о специфичности процессов ОМБ, обусловленных вероятно, как разным аминокислотным составом некоторых специфических оелков, так и функциональными осооенностями структур.
