Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1 Современные представления о стрессе 9
1.1.1 Стресс, вызванный токсическими соединениями 14
1.2 Холинергическая система и антихоли нэстеразные средства 17
1.2.1 Характеристика компонентов холинергической системы 17
1.2.2 Молекулярная структура и локализация ацетилхолинэстеразы 20
1.2.3 Строение активного центра и реакционный цикл 21
1.2,4 Некаталитические функции ацетилхолинэстеразы 25
1.2.5 Антихолинэстеразные средства. Неостигмин 25
1.3 Характеристика Ка,К-АТФазы 28
1.3.1 Молекулярная структура Na,K-ATOa3bi 29
1.3.2 Изоформы 35
1.3.3 Реакционный цикл 38
1.3.4 Регуляция активности 41
ГЛАВА II Материалы и методы исследования 54
ГЛАВА III Результаты исследования 62
3.1 Определение маркеров стресс-реакции у животных после иммобилизационного стресса и внутримышечного введения неостигмина62
3.1.1 Определение маркеров стресс-реакции у крыс после иммобилизационного стресса различной продолжительности 62
3.1.2 Определение маркеров стресс-реакции после внутримышечного введения животным различных доз неостигмина 64
3.1.3 Обсуждение результатов исследования 67
3.2 Исследование активности АХЭ и Na,K-ATOa3bi в эритроцитах и головном мозге крыс после иммобилизационного стресса 71
3.2.1 Исследование активности ацетилхолинэстеразы у крыс после иммобилизационного стресса различной продолжительности 72
3.2.2 Исследование активности Na,K-AT 3.2.3 Обсуждение результатов исследования 81 3.3 Исследование активности Na,K-ATOa3bi и АХЭ в эритроцитах и головном мозге крыс после введения различных доз нео стигми на 87 3.3.1 Исследование активности ацетилхолинэстеразы у крыс после введения различных доз неостигмина 88 3.3.2 Исследование активности Ыа,К-АТФазы у крыс после введения различных доз антихолинэстеразного препарата 89 3.3.3 Обсуждение результатов исследования 95 Заключение 99 Выводы 103 Список литературы 105 Введение к работе Актуальность проблемы. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) - фермент гидролиза нейромедиатора ацетилхолина - играет ведущую роль в механизме трансдукции нервного импульса в холинергических синапсах животных (Голиков, 1964; Маралев, 1999; Taylor, 1991). Необратимое ингибирование АХЭ нервной системы животных блокирует проведение нервного импульса и вызывает нарушение нормального функционирования организма, приводя в конечном итоге к его гибели (Голиков, Розенгарт, 1964; Голиков и соавт., 1986). Однако роль холинергической системы в организме не ограничивается только медиаторными функциями (Silman et al., 2005). Так, показано участие центральных и периферических холинергических систем в высвобождении АКТГ из гипофиза человека (Rich et al., 1981). Высказывались также предположения о дополнительных некаталитических функциях АХЭ, среди которых указывалось на её участие в развитии и функционировании нейронов благодаря способности влиять на транспорт аминокислот и гидролиз пептидов (Appleyard, 1992; Grisaru, 1999; Day, 2002). Весьма вероятным является участие холинергических систем в развитии стресс-реакции (Фурдуй и соавт., 1985; Хайдарлиу, 1984,1989). Ш,К-АТФаза - фермент плазматических клеточных мембран, осуществляющий сопряженный с гидролизом АТФ перенос ионов натрия и калия через мембраны против электрохимического градиента (Болдырев, 2001; Skou et al, 1992; Scheiner-Bobis, 2002). Благодаря градиенту ионов возбудимые клетки способны кодировать и передавать сигналы, что необходимо для нормального функционирования нервной системы и организма в целом. Таким образом, 1Ча,К-АТФаза играет важную роль в реализации клеточных функций, в связи с чем активность этого фермента подвержена тонкой регуляции со стороны эндокринной и нервной систем. В связи с вышеизложенным изучение регуляции активности Na,K-АТФазы в условиях стресса и оценка возможного вовлечения холин ерги чес ких систем в этот процесе может дать дополнительную информацию о механизмах стресс-реакции на молекулярном уровне. Изучению функциональной связи компонентов холинергической системы и 1Ча,К-АТФазы было посвящено большое количество исследований (Елаев, 1980; Елаев и соавт., 1983; Кривой и соавт., 2003; Кривой и соавт., 2004; Stewart, 1981; Busch, 2004), в которых демонстрировались эффекты ацетилхолина и н-холинорецептора на Ыа,К-АТФазу. Регуляторная роль компонентов холинергических систем на №,К-АТФазу может реализовываться также путем их участия в стимуляции выработки эндогенных дигиталис-подобных факторов (ЭДПФ), снижающих активность Na,K-АТФазы (Кривой и соавт., 2003). Концентрация стероидных соединений, обладающих дигиталис-подобной иммунореактивностью, согласно ряду исследований может возрастать в тканях животных в стрессовых условиях (Kelly et al., 1985; Lichtstein et al, 1985; Hamlyn et al., 1989; Doris, 1994; Buckalew et al, 1998; Grambert et al., 1998; Hamlyn et al, 1998 et al.). Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании влияния иммобилизации как классического стрессорного раздражителя и внутримышечного введения неостигмина на активность ацетилхолинэстеразы и Na,K-ATOa3bi. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: Изучить маркеры стресс-реакции у крыс после иммобилизационного стресса различной продолжительности и после введения различных доз неостигмина. Оценить состояние периферических и центральных холинреактивных систем у контрольных и опытных животных. 3. Изучить влияние иммобилизационного стресса различной продолжительности на активность ЫаД-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс. 4. Изучить активность Ш,К-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс после внутримышечного введения различных доз неостигмина. 7 Положения, выносимые на защиту. - Острый иммобилизационный стресс и однократное введение неостигмина вызывают сходные изменения маркеров стресс-реакции, однако в случае применения антихолинэстеразного соединения эти изменения более значительны, - В процессе адаптации животных к иммобилизационному стрессу и после однократного внутримышечного введения животным неостигмина происходит усиление секреторной деятельности надпочечников. - Острый иммобилизационный стресс приводит к снижению активности Na,K-ATOa3bi в эритроцитах животных, что связано с присутствием в крови стрессированных животных эндогенных ингибиторов фермента. - Влияние неостигмина в экспериментах in vivo на активность Na,K- АТФазы в эритроцитах и в микросомально-митохондриальных фракциях гомогенатов различных структур головного мозга животных зависит от дозы и режима введения соединения. Научная новизна и научно-практическая значимость работы. Установлено, что однократное внутримышечное введение животным антихолинэстеразного соединения в дозах 0,08 мг/кг и 0,25 мг/кг массы тела приводит к более значительному снижению концентрации аскорбиновой кислоты в гомогенате надпочечников по сравнению с действием иммобилизационного стресса. Впервые выявлено увеличение концентрации аскорбиновой кислоты в гомогенате надпочечников после многократного внутримышечного введения животным неостигмина в дозе 0,08 мг/кг массы тела, Выявлено, что у животных, адаптированных к иммобилизационному стрессу, снижена активность ацетилхолинэстеразы в гомогенате надпочечников и хвостатого тела. При этом обнаружены однонаправленные изменения активности ацетилхолинэстеразы и Na,K-AT<>a3bi в хвостатом теле после адаптации к иммобилизации. Впервые показано, что внутримышечное введение антихолинэстеразного препарата периферического действия в дозе 0,25 мг/кг массы тела животного вызывает снижение активности Ш,К-АТФазы в различных структурах головного мозга. Многократное введение небольшой дозы неостигмина (0,08 мг/кг массы тела) приводит к активации Na,K-АТФазы эритроцитов животных. Полученные результаты расширяют представление об участии холинергических систем в изменениях, происходящих в организме животных в ходе развития стресс-реакции и адаптации к действию экстремальных факторов. Результаты исследования используются при проведении спецпрактикума «Кинетика ферментативных реакций» и при чтении спецкурса «Механизмы биохимической адаптации» для студентов, специализирующихся по кафедре анатомии и физиологии человека и животных Тюменского государственного университета. Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на V Общероссийской научной конференции "Успехи современного естествознания" (Сочи, 2004), V Общероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Кисловодск, 2004), Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (С.-Петербург, 2005), IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пушино, 2005), Всероссийской конференции "Менделеевские чтения" (Тюмень, 2005). Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает 193 источников, в том числе 114 на иностранных языках. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и 11 таблицами. Согласно Селье причиной стресса любого происхождения как напряжения организма являются разнообразные действующие на организм повреждающие факторы - стрессоры (Селье, 1960). В качестве стрессоров могут выступать болезнетворные агенты, физические факторы, биологически активные вещества, а также токсические и чужеродные соединения. При поступлении токсинов во внутреннюю среду организма происходит отравление - интоксикация. Различают две стадии отравления: токсикогенную и соматогенную. На первой стадии проявляется непосредственное действие яда на организм. Вторая стадия характеризуется изменениями, наступающими после удаления или разрушения агента (Голиков и соавт., 1986). При воздействии химических веществ важной особенностью нарушений гомеостаза является непосредственное повреждающее влияние на различные механизмы регулирования гомеостаза, начиная от низших уровней до гипоталамических и кортикальных. В этом случае нарушение процессов регуляции становится ведущим патогенетическим механизмом химической интоксикации (рис 1). Стресс-реакция в начале интоксикации маскируется типичными для данного яда симптомами отравления, и лишь в дальнейшем проявляются общие биохимические и функциональные сдвиги, характерные для соответствующей стадии стресса (Голиков и соавт., 1986). Наиболее серьезные сдвиги гомеостаза наступают при остром воздействии летальных и сублетальных доз яда. Стресс-реакция при острых экзогенных отравлениях не всегда протекает однотипно и имеет ряд особенностей в зависимости от того, какой конкретный патологический механизм лежит в основе отравления. При отравлении антихолинэстеразными веществами экзотоксический стресс сопровождается усилением секреторной деятельности гипофиза. На первом этапе развивается нормальная стресс-реакция, сопровождающаяся кратковременным усилением секреции катехоламинов, глюкокортикоидов и минералокортикоидов, происходит повышенный выброс нейрогипофизом вазопрессина. Далее наблюдается гиперергическая реакция, приводящая к более продолжительной секреции данных гормонов. Затем вследствие длительного и интенсивного воздействия неиротропных веществ на механизмы регулирования гомеостаза происходит истощение запасов катехоламинов. В ранние периоды интоксикации возможно падение или полное отсутствие синтеза катехоламинов или некоторых других гормонов. На последней стадии на фоне гормонального дисбаланса происходит снижение общего уровня стресс-реакции (Голиков и соавт., 1986). При тяжелых интоксикациях может происходить ослабление физиологических механизмов стресса. Это проявляется в большей степени, если отравление протекает с резким напряжением вегетативной и гуморальной регуляций жизненных функций в связи с непосредственным вмешательством холинотропных веществ в функционирование гипофизадреналовой системы. Адаптивные возможности организма при воздействии химических факторов внешней среды зависят от того, на какое звено холинергической системы действует токсический агент (Голиков и соавт., 1986). К холинергическим нейронам относятся: спинальные мотонейроны, терминали которых находятся на вставочных нейронах и скелетных мышцах позвоночных; парасимпатические постганглионарные нейроны, терминали которых расположены в гладких мышцах; симпатические и парасимпатические прегангли он арные нейроны; часть нейронов ствола, зрительного бугра и среднего мозга (Хухо, 1990; Ашмарин, 1999). Несмотря на ограниченность холинергического представительства в нервной системе компоненты системы АХ включаются в реакцию экстренной адаптации с самого начала действия экстремальных факторов и участвуют в формировании неспецифического и специфического компонентов (Хайдарлиу, 1984). Основными функциональными компонентами холинергической системы являются ацетилхолин, холинорецептор и ацетилхолинэстераза. Ацетилхолин синтезируется в нервных клетках из ацетил-СоА, образующегося в клетке, и холина, поступающего их межклеточного холинового пула. Реакция синтеза ацетилхолина катализируется холинацилтрансферазой. Часть ацетилхолина упаковывается в везикулы, а часть остается свободной в цитоплазме нейрона (Хухо, 1990). Согласно квантовой (везикулярной) теории высвобождения медиатора из пресинаптического окончания в хранении и высвобождении АХ участвуют синаптические пузырьки. Предполагается, что при возбуждении нервного окончания в клетку входят ионы Са2+, запускающие процесс слияния мембран пузырьков с пресинаптической мембраной, в результате чего содержимое каждого пузырька (квант АХ) попадает в синаптическую щель. Согласно цитоплазматической гипотезе АХ в нервном окончании находится и в везикулах, и в цитоплазме, но освобождается в основном цитоплазматический АХ. Освобождение кванта происходит либо в результате действия Са + на специализированные белки пресинаптической мембраны, приводящего на некоторое время к открыванию канала, либо с помощью мембранного оператора, переносящего квант АХ через мембрану. Роль синаптических везикул согласно этой гипотезе заключается в хранении резервного АХ и восполнении потерь цитоплазматического АХ, а также в устранении избытка ионов кальция, входящих в клетку при возбуждении (Кривой и соавт., 1987; Ашмарин, 1999). Освобожденная молекула нейромедиатора посредством диффузии через синаптическую щель достигает постсинаптической мембраны, на которой расположены холинорецепторы. Различают два основных типа холинорецепторов: н-холинорецепторы (никотиновые) и м-холинорецепторы (мускариновые). Активация н-холинорецепторов вызывает классический ионотропный эффект - быстрое и продолжительное изменение проницаемости мембраны для ионов натрия, что приводит к возбуждению клетки. Активация м-холинорецепторов, относящихся к метаботропному типу, через стимуляцию циклаз приводит к усилению продукции циклических нуклеотидов с последующими метаболическими изменениями в постсинаптической клетке системы вторичных мессенджеров. Эта активность значительно медленнее и вызывает небольшие изменения проницаемости и потенциала постсинаптической мембраны (Ашмарин, 1999). Классическая роль АХЭ состоит в ограничении во времени холинергической нервной передачи путем гидролиза АХ. Однако биологическая роль АХЭ этим не ограничивается (Silman et al., 2005). Предположения о дополнительных некаталитических функциях АХЭ основываются на высоких уровнях АХЭ в не нервных тканях (эритроцитах, мегакариоцитах, овоцитах, сперме), где участие АХЭ в холинергической передаче маловероятно (Brimijoin et al., 1999; Day et al., 2002). В некоторых областях мозга (черная субстанция, мозжечок, гипоталамус и др.) содержание холинергических синапсов невелико и уровень холинацетилтрансферазы низок, в то время как уровень активности АХЭ повышен. Таким образом, в возбудимых тканях распространение АХЭ превышает распространение холинергических систем, что может свидетельствовать о дополнительной нехолинергической функции данного фермента (Appleyard, 1992). Многие нехолинергические нейроны содержат АХЭ. Предполагают, что АХЭ выполняет структурную функцию в глиальных клетках и обеспечивает взаимодействие нейронных и глиальных клеток. АХЭ может участвовать в развитии и функционировании нейронов благодаря способности влиять на состояние мембраны, транспорт аминокислот и гидролиз пептидов (Grisaru et al., 1999; Day et al., 2002;). Утрате ацетилхолинэстеразой неклассических функций придается большое значение в развитии нейродегенеративных болезней типа болезни Альцгеймера, при которой имеет место широко распространенное разрушение АХЭ-содержащих нейронов (Grisaru et al., 1999). Антихолинэстеразные средства. Неостигмин Ингибиторы АХЭ могут взаимодействовать либо с активным центром, либо с периферическими связывающими участками фермента. Будучи сериновой эстеразой, фермент необратимо инактивируется орган о фосфатам и, которые блокируют активный центр фермента путем ковалентного связывания с остатком серина. Другая группа ингибиторов, таких как эзерин и неостигмин, инактивируют активный центр обратимо путем карбамоилирования гидроксильной группы серина. Образующиеся соединения представляют собой замещенные эфиры карбаминовой кислоты, реакция реактивации фермента протекает медленно. Эти антихолинэстеразные агенты используют для временного ингибирования эстеразы с целью пролонгирования или усиления действия АХ. Соединения, содержащие четвертичные аммониевые группы (к которым относится и неостигмин), могут связываться в активном центре (конкурентное ингибирование) или на периферии (неконкурентное ингибирование), что часто зависит от концентрации ингибитора и ионной силы (Абдувахабов и соавт., 1989; Хухо, 1990;). Неостигмин (синонимы: прозерин, простигмин, N-(Mera-диметилкарбомоилоксифенил)-триметиламмоний-метилсульфат) - антиАХЭ препарат, преимущественно периферического действия, общей формулой СиНго Оз СИзЗО , с молекулярной массой равной 334,39. Представляет собой белый кристаллический порошок без запаха, горького вкуса, гигроскопичный, розовеющий на свету, хорошо растворимый в воде (1:10) и в спирте (1:5), с и,авл=142-146 С (Машковский, 1993), Неостигмин является упрощенным синтетическим аналогом физостигмина и относится к группе карбаматов, т.к. содержит карбамоилфенильную группу, обеспечивающее молекулярное взаимодействие с АХЭ. При взаимодействии неостигмина с АХЭ сначала карбонильная группа последнего образует электростатическую связь с основной группой эстеразного субцентра, представляющей собой азот имидазола, а затем карбамоилирует гидроксо-группу серина АХЭ, в результате чего образуется замещенный эфир карбаминовой кислоты, что и является причиной торможения фермента. Неостигмин не влияет на процесс деацилирования АХЭ и поэтому относится к конкурентным ингибиторам фермента. Помимо торможения АХЭ неостигмин может вызывать эффекты, не связанные с его антихолинэстеразными свойствами (пре- и постсинаптическое облегчающее действие), которые проявляются, преимущественно действием на нервно-мышечную передачу (Прозоровский и соавт., 1976). По своим фармакологическим свойствам неостигмин близок к галантамину и физостигмину, но в отличие от последних, в терапевтических дозах не действует на ЦНС, т.к. является четвертичным аммониевым соединением и поэтому плохо проникает через ГЭБ (Машковский, 1993). Однако в опытах на крысах установлено, что при внутрибрюшинном введении неостигмина в дозе 1,68 мг/кг (5 мкмоль/кг), он способен проникать через гематоэнцефалический барьер и тормозить активность АХЭ головного мозга на 20 % (Игумнова, 1988). После парентерального введения неостигмин подвергается гидролизу, а также метаболизируется в печени. В желудочно-кишечном тракте ингибитор всасывается не полностью, связывание с белками плазмы составляет 15-25%. После введения в терапевтических дозах неостигмина, в крови он определяется в течении 3-5 часов, что соответствует продолжительности торможения АХЭ. Выводится с мочой в виде неизменного вещества и метаболитов, один из которых 3-гидроксифенилтриметиламмоний. Неостигмин используется в качестве антагониста курареподобных веществ недеполяризующего типа действия. А также как лекарственное средство для лечения параличей, парезов и миастений центрального происхождения (Машковский, 1993). Интоксикация неостигмином характеризуется следующими признаками: миозом, гиперсаливацией, тошнотой, увеличением перистальтики желудочно-кишечного тракта, диареей, диурезом, мышечными фибрилляциями, общей слабостью. При введении очень высоких доз неостигмина, он начинает проникать через ГЭБ и действовать на АХЭ в ЦНС, в результате развивается возбуждение моторных центров головного и спинного мозга, что проявляется судорогами и ознобом. Для купирования этих проявлений применяют холиноблокаторы (атропин, метацин и т.п.), аденозинтрифосфатаза, КФ 3.6.3,9, ранее 3.6Л.37) - фермент наружных клеточных мембран, осуществляющий сопряженный с гидролизом АТФ перенос ионов натрия и калия через мембраны против электрохимического градиента (Лопина, 1999; Болдырев, 2001). Основной функцией 1\Га,К-АТФазы является установление градиентов ионов натрия и калия на плазматической мембране. Эти градиенты вовлечены в регуляцию объема клетки, поддержание соответствующей среды для синтеза белка, контроль за дыханием и/или гликолизом, регуляцию внутриклеточного значения рН и трансмембранного переноса Сахаров, аминокислот и нейротрансмиттеров. В возбудимых клетках градиент Na+ составляет движущую силу для быстрого его тока внутрь клетки при возбуждении, для контроля за внутриклеточным содержанием Са + через Na/Ca -обменный механизм (Аскари, 1990). Таким образом, Ыа,К-АТФаза является важнейшим регулятором клеточных функций, который обеспечивает способность возбудимых клеток воспринимать, кодировать и передавать сигналы, что необходимо для нормального функционирования нервной системы и организма в целом (Драбкина и соавт., 2004). Со времени своего открытия Скоу в 1957 г. данный фермент был объектом очистки и реконструкции отдельных функций, предметом интенсивных кинетических исследований, были проделаны опыты с экспрессией фермента. В 60-80-х года прошлого столетия №,К-АТФаза привлекала внимание исследователей также в связи с изучением механизма развития артериальной гипертензии и поисками натрийуретического гормона (Hamlyn et al, 1996; Buckalew et al., 1998). На сегодняшний день установлена первичная структура субъединиц №,К-АТФазы, их топография в мембране, открыто семейство изоформ для субъединиц, выявлено участие Ыа,К-АТФазы в реализации межклеточных контактов и её связь с цитоскелетом. Накопленная за последние годы информация представлена в многочисленных обзорах (Моденов и соавт., 1987; Капля, 1997; Лопина, 1999; Болдырев, 2001; Драбкина и соавт., 2004;; Shyjan et al., 1989; Koob et al., 1990; Devarajan et al., 1994; Hebert et al, 2001; Segall et al., 2001; Taniguchi et al., 2001; Pierre et al, 2002; Xie et al., 2002; Xie et al., 2003; Laughery et al., 2004). Метод основан на взаимодействии 2,4-нитрофенилгидразина с дегидроаскорби новой кислотой (ДАК) с образованием в серной кислоте соответствующего озона. Аналогично протекает реакция с дикетогулоновой кислотой (ДКГ). Озоны ДАК и ДКГ дают красное окрашивание, что используется для фотометрического определения. Для вычисления суммы всех фракций аскорбиновой кислоты (АК) их окисляют 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия (2,6ДХФФН). Содержание аскорбиновой кислоты определяют по разности между содержанием суммы всех фракций АК (АК, ДАК, ДКГ) и содержанием окисленных форм АК (ДАК, ДКГ). Для дифференцированного определения дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот, смесь подвергают действию восстановителя, при этом восстанавливается в АК только ДАК. В качестве восстановителя использовали унитиол. В три пробирки отмеряли по 0,5 мл гомогената надпочечников, в первую пробирку приливали по 0,25 мл 0,9% раствора NaCl и 2,5 мМ унитиола для восстановления содержащейся в образце окисленной формы аскорбиновой кислоты (АК). После 15-ти минутной инкубации при комнатной температуре при постоянном перемешивании из каждой пробирки отбирали по 0,2 мл экстракта, к которому приливали по 1,5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугировали 10 мин при 2600 об/мин (центрифуга Т-23, ГДР), после чего в чистые пробирки вносили по 0,75 мл супернатанта. Во вторую пробирку по каплям приливали 0,001 Н раствор 2,6-дихлор фен олипд о фенолята натрия (2,6-ДХФФН) до появления слаборозового окрашивания, устойчивого в течение 30 сек. Затем во все пробирки добавляли по 0,25 мл 2% раствора 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДФГ), приготовленного на 9 Н H2S04, содержащей 0,25% тиомочевины. Далее во все пробирки приливали по 0,25 мл дистиллированной воды, при этом во вторую пробирку добавляли объем воды за вычетом объема 2,6-ДХФФН, пошедшего на титрование супернатанта. Пробы инкубировали в течение 10 мин на водяной бане, затем вносили в каждую пробирку по 1,25 мл 85% раствора H2SO4, одновременно охлаждая их на ледяной бане. Через 1 час пробы фотометрировали относительно воды при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм. Расчет концентраций отдельных форм аскорбиновой кислоты проводили по следующим формулам: - концентрация кислот, мг%; А - оптическая плотность пробы; 3 - концентрация стандартного раствора, мг%; 0,085 -оптическая плотность стандартного раствора. Эритроцитометрию проводили путем построения кривых Прайс-Джонса. Принцип основан на определении диаметра эритроцитов в окрашенном мазке с помощью окуляр-микрометра. Окуляр-микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку с нанесенной по ее диаметру шкалой, разделенной на 50 делений. Величина этих делений зависит от увеличения объектива, при котором используют шкалу. Абсолютную величину этих делений определяли с помощью объект-микрометра, который представляет собой предметное стекло с нанесенной на нем шкалой длинной 2мм, каждое деление которой равно Юмкм. Для определения цены делений окуляр-микрометра последний вставляли в окуляр микроскопа, а объект-микрометр помещали на предметный столик микроскопа. Их шкалы, при этом, устанавливали так, чтобы они совпали. Затем отсчитывали число делений окуляр-микрометра в микрометрах. Диаметр эритроцитов определяли в окрашенных мазках крови с иммерсионной системой тем же микроскопом и той же измерительной линейкой окуляр-микрометра, для которого была вычислена цена одного деления. Мазок крови готовили шлифовальным стеклом с идеально ровным краем, ширина которого была приблизительно на 2-3 мм уже предметного стекла. Каплю крови наносили стеклянной палочкой на сухое обезжиренное предметное стекло ближе к краю. Далее шлифовальное стекло ставили на предметное под углом 45 на 1-2 мм перед каплей, сдвигали назад так, чтобы оно коснулось крови и капля растеклась по краю шлифовального стекла. Затем быстрым легким движением справа налево делали мазок. Мазки высушивали на воздухе и маркировали. Высохший мазок был равномерно тонким, желтоватого цвета и занимал % общей длины предметно стекла, заканчивался "метелочкой". Фиксацию мазков осуществляли в течении 20-30 минут в метиловом спирте, а затем высушивали на воздухе. Высохшие мазки окрашивали по Романовскому-Гимзе, используя готовый краситель, который перед началом работы разводили из расчета 75 мл краски на 100 мл дистиллированной воды рН=4,6. Фиксированные мазки помещали на "рельсы" и заливали краской на 45-50 минут. С помощью объектива 10Х (малое увеличение) находили край мазка, затем наносили каплю иммерсионного масла и не меняя положения стекла, переводили иммерсионный объектив (100Х) таким образом, чтобы он погрузился в каплю иммерсионного масла. Далее с помощью микровинта подбирали соответствующее фокусное расстояние, устанавливая четкую видимость клеток, и измеряли диаметр 100 эритроцитов. Статистическая обработка результатов. Полученные данные были обработаны методами вариационной статистики. Сравнительную оценку полученных результатов проводили с использованием непараметрического рангового U-критерия Уилкоксона (Манна-Уитни), рекомендованного для малых выборок (Лакин Г.Ф., 1990). Результаты изучения активности АХЭ и содержания аскорбиновой кислоты в надпочечниках животных, свидетельствуют об активации секреторной деятельности надпочечников у крыс после иммобилизации и в процессе адаптации к иммобилизационному стрессу. При исследовании активности Ш,К-АТФазы у животных, подвергнутых иимобилизационному стрессу и адаптации к иммобилизации было обнаружено, что в эритроцитах крыс, подвергнутых однократному иммобилизационному воздействию, активность фермента была ниже контрольных значений, а у животных других опытных групп не отличалась от контрольного уровня. Изменение активности NaJC-АТФазы в эритроцитах крыс, подвергнутых иммобилизации, может быть следствием выброса под действием стресса в периферическую кровь животных депонированных форм эритроцитов, представленных клетками разной степени зрелости (Маслова, 2005). Долю «молодых» и «старых» форм эритроцитов в периферической крови можно определить на основании процентного соотношения эритроцитов разного диаметра в мазке крови животных, поскольку известно, что старение эритроцитов сопровождается уменьшением их диаметра (Кост, 1975). Результаты эритроцитометрии, свидетельствуют о том, что в крови животных, подвергнутых многократным иммобилизационным воздействиям и стрессу после предварительной адаптации, преобладали эритроциты меньшего диаметра, чем в контроле. В ряде работ было показано, что при старении эритроцитов происходит снижение активности мембранных ферментов, в том числе ИаД-АТФазы и АХЭ (Камышенцев и соавт., 1976; Медведева и соавт,, 1993). Как показали наши исследования, в эритроцитах животных, подвергнутых однократной иммобилизации, активность №,К-АТФазы была ниже контрольного уровня, а активность АХЭ не отличалась от контроля. Можно предположить, что обнаруженное снижение активности №,К-АТФазы в эритроцитах животных, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу, обусловлено не только выбросом в периферическую кровь «старых» эритроцитов, но и может быть связано с увеличением в плазме крови стрессированных животных концентрации соединений, снижающих активность фермента. Действие на организм стрессирующих факторов может усиливать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в различных тканях животных (Малышев и соавт., 1995; Маслова, 2005). Так, было показано изменение содержания индивидуальных липидов в эритроцитарной мембране при хроническом стрессе: увеличение содержания холестерина на 40%, снижение содержания фосфолипидов на 28% (фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина - легкоокисляемых фракций), накопление цитотоксичного лизофосфатидилхолина и увеличение содержания сфингомиелина. Подобные изменения отражаются на структурно-функциональном состоянии мембраны (Рожковский и соавт., 1991). Хронический стресс в опытах этих авторов сопровождался снижением активности Ыа,К-АТФазы эритроцитов, что было связано с изменениями в содержании липидных компонентов мембран клеток и накоплением продуктов ПОЛ. Поскольку в надпочечниках животных, подвергнутых однократной иммобилизации, обнаружено снижение восстановленной формы аскорбиновой кислоты, свидетельствующее об активации синтетической и/или секреторной деятельности надпочечников, то с большой долей вероятности можно говорить о повышении в крови животных данной опытной группы катехоламинов, которые могут оказывать влияние на активность Ма,К-АТФазы. Однако, в работах (Капля, 1998) был установлен стимулирующий эффект норадреналипа in vivo в мозге и миокарде крыс на изоформы ЫаД-АТФазы с высоким сродством к уабаину. Предполагается, что краткосрочная регуляция фермента катехоламинами реализуется через обратимое фосфорилирование каталитической субъединицы. Пути метаболизма гормонов надпочечников могут быть тесно взаимосвязаны с метаболизмом эндогенных дигиталис-подобных факторов (ЭДПФ) (Doris et al., 1989; Shaikh et al., 1991; Perrin et al., 1997; Hamlyn et ah, 1998; Lichtstein et al., 1998), которым принадлежит важная роль в регуляции активности Ыа,К-АТФазы (Therien et al., 2000). Это дает основания предполагать, что синтез и/или секреция ЭДПФ возрастает при действии стресс-фактора, что приводит к снижению активности №,К-АТФазы в эритроцитах стрессированных животных. Для проверки данного предположения было исследовано влияние плазмы крови животных, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу, на активность №,К-АТФазы микросомально-митохондриальной фракции гомогената коры головного мозга крыс. Выявлено снижение активности фермента в микросомально-митохондриальной фракции коры головного мозга контрольных животных после инкубации с плазмой крови стрессированных крыс, что позволяет предположить присутствие в крови крыс, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу, факторов, ингибирующих NajK-АТФазу. При исследовании активности Ыа,К-АТФазы в различных структурах головного мозга животных при иммобилизационном стрессе и адаптации к нему было обнаружено снижение активности фермента в хвостатом теле крыс, подвергнутых нескольким сеансам иммобилизации, что может быть вызвано рядом причин. Во-первых, посредством действия протеинкиназ снижается активность тех молекул, которые подверглись регуляторному фосфорилированию. Во-вторых, активные формы кислорода могут устранять активирующее действие АТФ на фермент за счет нарушения межбелковых взаимодействий. Эти способы ингибирования являются обратимыми, но их обращение зависит от конкретной ситуации в клетке - наличия активных протеинфосфатаз в первом случае, а также восстановительных эквивалентов или антиоксидантов во втором (Болдырев, 2001). В-третьих, известно, что функционирование мембранных ферментов зависит от микровязкости их липидного окружения, обладающего специфическими физико-химическими свойствами, обусловленными как структурой внутримембранной части белка, так и самих липидов. Физическое состояние липидного окружения Na,K-ATOa3bi влияет на конформационную подвижность фермента и способность к олигомерно-протомерным переходам (Капля, 1997). Известно, что протомеры фермента в ходе реакционного цикла разобщаются под действием ионов магния (Болдырев и соавт. 1989; Bonting et al., 1983). Кроме того, ионы магния обладают мембранотропными эффектами, влияя на фазовые переходы мембранных липидов (Болдырев и соавт., 1990; Кравцов и соавт., 2001). Характер кривых зависимости активности Ыа,К-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената хвостатого тела от содержания MgCl2 в среде определения ферментативной активности в контроле и в опыте был одинаковым. Следовательно, способность фермента переходить из олигомерной формы в протомерную у опытных животных не изменялась. Вместе с тем активность №,К-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената хвостатого тела крыс, подвергнутых нескольким сеансам иммобилизации, была ниже контрольных значений при определении активности в средах, содержащих 6 мМ и 12 мМ MgCl2, на 27,7% и 19,4% соответственно. Можно предположить, что снижение активности ИаД-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената хвостатого тела крыс после нескольких сеансов иммобилизации обусловлено связыванием с молекулой фермента каких-то факторов. В ряде исследований было показано существование в головном мозге животных ЭДПФ, которые, как известно, ингибируют Ыа,К-АТФазу (Haber et al., 1987; Sancho, 1998; Van Huysseetal., 1998; Lichtstein et ah, 2001).Стресс, вызванный токсическими соединениями
Антихолинэстеразные средства. Неостигмин
Определение маркеров стресс-реакции после внутримышечного введения животным различных доз неостигмина
Исследование активности Ыа,К-АТФазы у крыс после введения различных доз антихолинэстеразного препарата
Похожие диссертации на Влияние иммобилизационного стресса и внутримышечного введения неостигмина на активность ацетилхолинэстеразы и Na, K-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс
