Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 9
1.1 Строение биологических мембран 9
1.2 Мембранный скелет эритроцитов млекопитающих 11
1.3. АТФаза 17
1.3.1. Структурная организация Ыа,К-АТФазы 18
1.3.2 Реакционный цикл ^К-АТФазы 22
1.3.3 Влияние АТФ и ионов магия на конформационное состояние фермента 23
1.4 Регуляция активности №,К-АТФазы 26
1.4.1 Роль липидного окружения 27
1.4.2 Влияние белков мембранного скелета эритроцита 27
1.4.3 Роль FXYD-белков в регуляции №,К-АТФазы 28
1.4.4 Уабаин и эндогенные уабаин-подобные ингибиторы 30
1.4.5 Гормональная регуляция 31
1.4.6 Механизмы опосредованного фосфорилирования-дефосфорилирования 33
1.4.7 Действие фосфолипазы 2 и ее метаболитов 35
1.4.8 Действие ионов кальция и кальций-связывающих белков 36
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 38
ГЛАВА 3 Результаты исследований и их обсуждение 44
3.1 Влияние гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы 44
3.1.1 Модулирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность NaJC-АТФазы гомогената головного мозга 44
3.1.2 Модулирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях ЭДТА, MgCb и СаС!2в среде определения ферментативной активности 47
3.2 Разделение гемолизата эритроцитов на отдельные фракции с помощью гель-фильтрации 59
3.2.1 Фракционирование гемолизата эритроцитов 59
3.2.2 Электрофоретический анализ модулирующих фракций гемолизата эритроцитов 61
3.3 Влияние отдельных фракции гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы 64
3.3.1 Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность NajC-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях ЭДТА в среде определения ферментативной активности 64
3.3.2 Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях MgCl2B среде определения ферментативной активности 69
3.3.3 Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях СаСЬ в среде определения ферментативной активности 74
3.3.4 Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность ЫаД-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях СаСЬ и MgCb в среде определения ферментативной активности 80
Заключение 88
Выводы 96
Список литературы 97
- Мембранный скелет эритроцитов млекопитающих
- Механизмы опосредованного фосфорилирования-дефосфорилирования
- Модулирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность NaJC-АТФазы гомогената головного мозга
- Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность NajC-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях ЭДТА в среде определения ферментативной активности
Введение к работе
интегральным белком плазматической мембраны клеток. Основная функция
фермента заключается в сопряженном с гидролизом АТФ переносе ионов
натрия из клетки, а ионов калия в клетку (Skou, 1988; Scheiner-Bobis, 2002). В
настоящее время №,К-АТФаза рассматривается не только как система
активного транспорта ионов, но и как система рецепции и передачи сигналов
в клетку (Лопина, 2005; Xie et al., 2002).
Существуют кратковременные и долговременные пути регуляции активности фермента (Therien et al., 2000). Эритроциты, являясь высокоспециализированными клетками, не могут реализовывать долговременные механизмы регуляции, так как не имеют в зрелом состоянии белок-синтезирующих систем, поэтому ключевыми становятся кратковременные механизмы регуляции, связанные с уже существующими структурами и метаболическими путями эритроцита. Важная роль в регуляции Ыа,К-АТФазы эритроцитов принадлежит ионам кальция и магния, которые участвуют в реакционном цикле фермента (Skou, Esmann, 1992). Рядом авторов выявлено присутствие в мембране эритроцитов белка FXYD-2, который способен влиять на сродство Ыа,К-АТФазы к одновалентным катионам (Hoffman et al., 2002). Следует отметить, что активность фермента может регулироваться белками цитоскелета эритроцитов (Казенное и соавт., 1996).
Результатом работы разных авторов явилось обнаружение в эритроцитах веществ, обладающих как активирующим, так и ингибирующим эффектом на активность фермента из различных тканей. В работах Ингста (Yingst et al., 1985, 1992) было показано, что ингибирующее действие ионов кальция на активность фермента усиливалось присутствием мембранного белка кальнактина, позднее идентифицированного как фрагмент кальмодулина - регулятора активности Са-АТФазы. В работах других авторов отмечались активирующие эффекты гемолизата, которые зависели от соотношения ионов магния и кальция в средах
определения и используемых гемолизирующих растворах (Петруняка и соавт., 1990).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы головного мозга крысы. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать активность Na,K-АТФазы в гомогенате головного мозга
крысы после прединкубации с гемолизатом эритроцитов.
С помощью гель-фильтрации фракционировать гемолизат эритроцитов и исследовать влияние полученных фракций на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы.
Оценить зависимость модулирующего эффекта гемолизата эритроцитов и его отдельных фракций на активность №,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы от содержания в среде определения ферментативной активности ЭДТА и ионов магния и кальция.
Научная новизна. Показано, что гемолизат эритроцитов обладал выраженным ингибирующим влиянием на активность ИаД-АТФазы гомогената головного мозга крысы. Степень проявления модулирующего эффекта гемолизата зависела от содержания ЭДТА и соотношения ионов магния и кальция в среде определения ферментативной активности.
Проведено разделение с помощью гель-фильтрации гемолизата эритроцитов на отдельные фракции, три из которых модулировали активность Ка,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы в зависимости от соотношения двухвалентных ионов в среде инкубации. Впервые показано, что одна из трех модулирующих фракций обладала магний- и кальций-зависимым ингибирующим эффектом на активность Ыа,К-АТФазы, а активирующий эффект двух других фракций гемолизата эритроцитов в отношении фермента являлся кальций-зависимым.
Научно-практическая значимость работы. Показано, что в гемолизате эритроцитов и в его отдельных фракциях присутствуют модуляторы
7 активности Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы, степень
влияния которых на активность фермента зависит от соотношения
двухвалентных ионов (магния и кальция) в среде определения
ферментативной активности. Предполагается, что модулирующим эффектом
на активность Ыа,К-АТФазы могут обладать как белки мембранного скелета
эритроцитов (вероятно, спектрин), так и белковые компоненты с
приблизительной молекулярной массой 60-70 кДа или низкомолекулярные
полипептиды.
Полученные данные расширяют представления о путях регуляции Na,K-АТФазы, что важно в плане понимания механизмов контроля гомеостаза клетки.
Результаты проведенного исследования используются при чтении специализированного курса «Структуры и функции ферментов» студентам Тюменского государственного университета.
Положения, выносимые на защиту;
Гемолизат эритроцитов, полученный с использованием гемолизирующего раствора, не содержащего ЭДТА, вызывает снижение активности Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы.
Мембранный скелет эритроцитов млекопитающих
В начале 70-х годов при исследовании механических свойств мембран эритроцитов было обнаружено, что после разрушения мембраны, вызванного экстракцией липидов неионными детергентами, остается плотная ячеистая структура, сохраняющая форму эритроцита, которая выявилась с помощью метода электронной микроскопии (Yu et al., 1973). Эта структура получила название - цитоскелет (рис.1). На сегодняшний день цитоскелет эритроцитов достаточно хорошо изучен (Goodman et al., 1995; Bennett et al., 2001). Получены данные, свидетельствующие о том, что цитоскелет выполняет не только механическую функцию, но и участвует в ряде регуляторных процессов, в том числе в передаче сигналов.
Классическая работа по определению белкового состава цитоскелета эритроцита была выполнена Фэйрбенксом, после солюбилизации мембран детергентом додеци л сульфатом натрия проведен электрофорез денатурированных белков в полиакриламидном геле (Fairbanks et al., 1971). При электрофорезе мембранных препаратов эритроцитов, полученных методом гипоосмотического гемолиза, на геле проявляется до двадцати полос, каждая из которых соответствует отдельным полипептидным цепям или набору полипептидов, имеющих близкие молекулярные массы. Різ них семь основных полос идентифицированы и пронумерованы от анода к катоду (рис.2). Полосы 1 и 2 представлены двумя субъединицами одного белка -спектрина, а полосы 2.1 и 2.3 - фрагменты спектринсвязывающего белка -анкирина. Белок полосы 4.5 - переносчик глюкозы. Физические свойства белка полосы 4.2 , также как и его роль, пока не определены. Белок полосы
К белкам мембранного скелета относится также белок 4.9 - фосфопро-теин, состоящий из двух полипептидов с молекулярной массой 48 кДа и 52 кДа, который связан с актином (Геннис, 1997).
Ячейки сети примембранного цитоскелета формируются белком спектрнном, а вершины - короткими актиновыми филаментами, состоящими из 13-15 мономеров актина (Bennett et al., 2001). Основным местом крепления спектрина на мембране является анкирин (полоса 2.1). Анкирин взаимодействует с р-субъединицей спектрина на расстоянии 20 нм от С-конца молекул. Нейтральный домен анкирина связывается с белком полосы 3, осуществляя тем самым крепление спектрин-актиновой сети к плазматической мембране (Сторожок и соавт., 1997). Белок полосы 3 или анионный транспортер, является одним из основных интегральных белков эритроцитарной мембраны.
Охарактеризуем белки цитоскелета эритроцитов более подробно. Спектрин - главный компонент мембранного скелета и представляет собой а,р-гетеродимер, образованный двумя полипептидными цепями с молекулярной массой 260 кДа (а-цепь) и 220 кДа (Р-цепь). Показано, что спектрин может находиться в двух формах - гетеродимера и тетрамера. Тетрамер представляет собой ассоциированные друг с другом гетеродимеры таким образом, что аминогруппа кольцевой а-цепи одного гетеродимера взаимодействует с карбоксильной группой хвостовой аминокислоты р-цепи другого гетеродимера (Bennett et al., 2001). 15 В эритроцитах спектрин встречается чаше в виде тетрамеров, образующих двумерную сеть цитоскелета, связывается с анкирином, белком полосы 4.1, актином и адцуцином (Геннис, 1997). Спектрин способен фосфорилироваться, связывать кальмодулин (Bennett et al., 2001) и образовывать комплекс с гемоглобином (Kiefer et al., 1995). Актин - белок полосы 5, способный связываться со спектрином. Присутствует в клетке в виде филаментов, состоящих в среднем из 12-14 мономеров (Bennett et al., 2001). Одной из отличительных особенностей актина является способность его к полимеризации, при этом АДФ в большей мере способствует этому процессу, чем АТФ (Bennett, 1990). Есть сведения о способности коротких актиновых филаментов активировать Ка,К-АТФазу из различных источников (Bertorello, Katz, 1993). Важную роль во взаимодействии спектрина с актином играет белок полосы 4.1. Анкирин, или белок полосы 2.1 - мономерный белок, присутствующий в клетке в количестве 100 000 копий и имеющий молекулярную массу около -206 кДа (Bennett et al., 2001). Молекула анкирина имеет сферическую форму и состоит из двух доменов: домен с молекулярной массой 90 кДа может взаимодействовать с белком полосы 3 и носит название нейтрального, и второй домен (72 кДа), способный фосфорилироваться, взаимодействует со спектрином. (Bennett, 1989). Анкирин способен связываться также с белками, образующими потенциалзависимыми натриевыми каналами (Srinivasan et al., 1992), а-субьединицей №,К-АТФазы (Shibayama et al., 1993), что предполагает его участие в процессах транспорта одно- и двухвалентных катионов. Белок полосы 4.1 представлен в количестве 200 000 копий на клетку и является одним из основных белков, осуществляющих взаимодействие спектрина и актина (Геннис, 1997). Анализ первичной аминокислотной последовательности показал наличие у белка полосы 4.1 четырех доменов. Первый домен обуславливает взаимодействие этого белка с мембраной и несет участок фосфорилирования протеинкиназой С (Сторожок и соавт., 1997). Домен с молекулярной массой 100000 способен фосфорилироваться цАМФ-зависимой протеинкиназой. Этот домен содержит участок, обуславливающий связывание спектрина с актином. Последний, четвертый домен, способен гликозилироваться (Bennett, 1990). Белок полосы 4.1 способен связываться с интегральным белком полосы 3, гликофоринами А и С. Белок 4.9. Один из главных периферических белков цитоскелета, фосфопротеин, имеющий молекулярную массу 48 кДа, который связан со спектрин-актиновой сетью и находится в количестве 50000 копий на клетку (Сторожок и соавт., 1997). Этот белок способствует упаковке актиновых филаментов, однако, эта способность утрачивается после фосфорилирования его цАМФ-зависимой протеинкиназой. Кроме того, белок полосы 4.9 является субстратом для протеинкиназы С и кальций-зависимой протеинкиназы (Bennett, 1990). Белок полосы 4.2 имеет молекулярную массу 72 кДа и содержится в количестве 200000 копий на клетку. Белок связан с анионным обменником, анкирином и белком полосы 4.1. Возможно, он обеспечивает стабильность комплекса анкирин-белок полосы 3- белок полосы 4.2 (Cohen et al., 1984).
Тропомиозин (белок полосы 7) представлен в эритроците в виде димера -двух полипептидов с молекулярными массами 27 и 29 кДа в количестве 70-80 тысяч копий на клетку. Этот белок способен взаимодействовать с актиновыми филаментами (Bennett, 1990). Предполагают, что этот белок стабилизирует актиновые филаменты и ограничивает их длину и регулирует сродство спектрина к актину (Salzer et al., 1993). Не исключено, что с помощью этого белка осуществляется регуляция кальцием ассоциации спектрина с актиновыми филаментами (Bennett et al., 2001). Взаимодействие тропомиозина со спектрин-актиновым комплексом регулирует тропомиозинсвязывающий белок - тропомодулин (Bennett, 1990).
Механизмы опосредованного фосфорилирования-дефосфорилирования
Протеинкиназа А. Действие цАМФ-активируемой протеинкиназы, или РКА опосредуется внутриклеточным цАМФ (Palmer et al., 1991; Nestor et ai., 1997; Stewart et al., 1998). В работе Cheng и соавторов (1999) показано, что ионы кальция являются важным посредником в действии РКА на Na,K 34
АТФазу. Механизмы, с помощью которых РКА изменяет активность Na,K АТФазы, разнообразны и комплексны (Borin, 1997). Наиболее простой эффект РКА проявляется через непосредственное фосфорилирование Na,K-АТФазы (Муртазина и соавт., 2001; Lingham et al., 1982). Fisone и соавторы (1994) показали, что фосфорилирование Ser-943 приводит к снижению активности фермента, а также, что фосфорилирование Ser-943 играет важную роль в запуске процесса фосфорнлирования фермента под действием РКС по Ser-23.
Lingham и Sen (1982) предположили, что РКА требует присутствия промежуточного белка, опосредующего эффекты на ЫаД-АТФазу мозга крысы. Satoh и соавторы (1993а) показали, что РКА снижает активность Ыа,К-АТФазы в почечном собирающем протоке, активизируя РЬА2-путь. В работе Canliello (1997) показано, что фосфорилирование мономерного актина РКА предшествует актин-опосредованной стимуляции №,К-АТФазы, тогда как фосфорилирование полимерного актина способствует фосфорилированию под действием РКА.
Протеинкиназа С (РКС). В присутствии диацилглицерола и форболовых эфиров РКС связывается с мембраной и увеличивает свое сродство к ионам кальция и фосфолипидам, ее конечным активаторам. Активизированная РКС является мощным регулятором многих ферментов, включая №,К-АТФазу (Feschenko et al., 1997, 2000). Efendiev и соавторы (1999) показали, что механизм действия РКС на Na,K-АТФазу зависит от изоформы протеинкиназы. Ингибирование фермента под действием РКС опосредуется одним из двух механизмов. Первый связан с активацией РЬА2-пути (Owada et al., 1999), второй вызывает прямое фосфорилирование Ыа,К-АТФазы РКС по Ser-23 а-субъединицы(СЫЬа1ше1а1., 1998,1999).
Протеинкиназа G. цГМФ-зависимая протеинкиназа (PKG) является следующей киназой, имеющей высоко специфичные эффекты на Na,K-АТФазу (Pontiggia et al., 1998). Увеличение концентрации цГМФ ингибирует Ыа,К-АТФазу мозга, а в солевой железе утки активирует фермент (Stewart et al., 1981). В почках показано, что цГМФ и PKG как ингибировали, так и стимулировали Na,K-AT I a3y. Механизм PKG-активации связан с активацией гуанилатциклазы окисью азота (N0). NO-стимулируемый синтез цГМФ вызывается нейромедиаторами ацетилхолином и глутаматом (Nathanson el al., 1995). Регулирует ли PKG №,К-АТФазу через вторичные модуляторы, или прямым фосфорилированием молекулы фермента неизвестно. ПротеинФосфатазы. Многие эффекты протеинкиназ на Na.K-АТФазу могут быть сняты под действием протеинфосфатаз. Главными участниками протеинфосфатазно-зависимой модуляции активности Ыа,К-АТФазы являются протеинфосфатаза 1 (РР1) и протеинфосфатаза 2В (РР2В). Показано, что увеличение уровня цАМФ, вызванное дофамином и изопротеренолом, в почках и мозге ведет к фосфорилированию DARPP-32, который в свою очередь становится мощным ингибитором РР1 (Aperia et al., 1991). Физиологическая роль РР2В в почках была определена недавно. Это кальций- и кальмодулин-зависимый фермент, который при активации норадреналином и агонистами (3-адренергического рецептора активирует Ыа,К-АТФазу в большинстве отделов нефрона. Предполагается, что РР2В опосредует эффекты стимуляции, по крайней мере, частично, увеличивая сродство Ыа,К-АТФазы для ионов натрия (Lea et al., 1994). Другая протеинфосфатаза, модулирующая активность №,К-АТФазы — это протеинфосфатаза 2А (РР2А), которая увеличивает количество молекул фермента в плазматической мембране (Blot-Chabaud et al., 1996). Тирозинфосфатазы могут также изменять активность №,К-АТФазы печени, данный факт объясняется стимулирующим эффектом ионов ванадата, действующих как ингибиторы тирозинфосфатаз (Bruck et al., 1998). Фосфолипазный (PLA2) путь регуляции активности №,К-АТФазы может быть активизирован как РКА, так и РКС. Активированная PLA2 может расщеплять фосфолипиды мембраны, что приводит к образованию лизофосфолипидов и арахидоновой кислоты, которые обладают специфическими эффектами на Иа,К-АТФазу (Okafor et al., 1997). Арахидоновая кислота под действием оксигеназ участвует в образовании эйкозаноидов (простагландини, тромбоксаны) и окисленных компонентов, таких как гидроксиэйкозатетраеновые кислоты и эпоксиэйкозотриеновые кислоты, которые являются модуляторами Ыа,К-АТФазы (Satoh et al., 1993b). Производные лизофосфолипидов, такие как арахидоновая кислота и ее метаболиты, ингибируют Na,K-ATOa3y, а также арахидоновая кислота опосредует дофаминовое ингибирования фермента почек. Дальнейшие исследования этой системы показали, что эффекторами арахидонат-опосредованного ингибирования являются ее метаболиты, а именно, простагландин Е. Satoh и соавторы (1993b) показали, что простагландин Е ингибирует Na.K-АТФазу, уменьшая концентрацию внутриклеточного натрия.
Модулирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность NaJC-АТФазы гомогената головного мозга
Согласно литературным данным в эритроцитах млекопитающих присутствует ингибитор Ыа,К-АТФазы - кальнактин (Yingst, 1988), а также возможно наличие активатора фермента (Петруняка, Панюшкина, 1994). Данными авторами высказывались предположения о том, что модуляторы активности фермента могут обладать магний- и кальций-зависимыми свойствами. Учитывая это, изучали влияние гемолизата эритроцитов на активность Na.K-АТФазы гомогената головного мозга крысы в зависимости от содержания в среде определения ферментативной активности ЭДТА, MgCb и СаСЬ- №,К-АТФаза головного мозга крысы была выбрана в качестве объекта исследования, поскольку обладает высокой активностью по сравнению с ферментом эритроцитов, что, как предполагалось, позволит более выражено выявить модулирующие эффекты гемолизата эритроцитов. Гемолизат не обладал АТФазной активностью в условиях эксперимента, что позволило использовать его для оценки действия факторов, высвобождающихся в процессе гемолиза.
Результаты исследования показали, что гемолизат эритроцитов, полученный при соотношении упакованных эритроцитов к гемолизирующему раствору 1 ;4, ингибировал №,К-АТФазу головного мозга на 40%, в то время как при соотношениях 1:9 и 1:19 не влиял на активность исследуемого фермента (рис.7).
Наличие ингибирующего эффекта гемолизата, возможно, связано с отсутствием в гемолизирующем растворе хелаторов, часто применяемых в аналогичных работах. Возможно, это позволило проявиться модулирующим эффектам двухвалентных ионов, в частности ионов кальция и магния, которые высвобождаются при гемолизе эритроцитов.
Примечание: -р 0,001 - достоверность различий по сравнению с контролем Среда определения ферментативной активности содержала в мМ: NaCl-100; КСІ- 20; трис-НСІ- 50 (рН 7,6 при 25С); MgCl2 - 3; СаС12 - 0; ЭДТА-0,5;АТФ-3(1=37С)(п=6). Однако, как в контроле, так и в опыте в среде определения ферментативной активности содержался ЭДТА в концентрации 0,5 мМ, что могло существенно снизить модулирующие эффекты ионов. Помимо действия двухвалентных ионов можно допустить действие кальнактина (Yingst, 1992), который повышает чувствительность Na,K-АТФазы к кальций-зависимому ингибированию. Показано, что в присутствие ЭДТА данный ингибитор удаляется с мембран на стадии гемолиза эритроцитов и отмывания их от внутриклеточного содержимого (Yingst, 1985). Наряду с кальнактином многие другие компоненты мембранного цитоскелета, в частности кальмодулин (Орлов и соавт, 1985), тропомиозин (Bennett, 1989) также удаляются из мембранных препаратов. Данный процесс протекает при регулирующем эффекте ионов кальция и магния (Bennett, 1990). В целом, оценивая ингибирующий эффект гемолизата на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы, следует отметить, что эффект проявлялся только при определенном соотношении упакованных эритроцитов и гемолизирующего раствора в гемолизате. Можно сказать, что при снижении содержания эритроцитов в гемолизате при соотношениях упакованных эритроцитов и гемолизирующего раствора 1:9 и 1:19 модулирующий эффект гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы отсутствовал. На наш взгляд, не следует исключать опосредованного действия гемолизата эритроцитов на активность фермента. Снижение активности №,К-АТФазы головного мозга крысы может быть связано с запуском кратковременных механизмов регуляции, а гемолизат эритроцитов служит, в качестве инициатора данных процессов. Известно, что ряд протеинкиназ участвуют в регуляции активности Ка,К-АТФазы (Bertorello et al., 1991), также показана роль двухвалентных ионов в данном процессе (Kimura et al., 2005). В связи с вышесказанным на следующем этапе исследования проводилась оценка ингибирующего эффекта гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы головного мозга крысы при изменении содержания ЭДТА, MgCl2 и СаС12 в среде определения ферментативной активности. Изменение содержания ЭДТА в среде инкубации позволило выявить возможные эффекты двухвалентных ионов в наблюдаемом снижении активности Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы после прединкубации с гемолизатом. Так было показано, что увеличение содержания ЭДТА в среде определения ферментативной активности приводило к снижению ингибирующего эффекта гемолизата эритроцитов с 40% при 0,5 мМ до 22% при 2 мМ (рис.8). Следует отметить, что в контроле увеличение концентрации ЭДТА приводило к снижению активности №,К-АТФазы гомогената головного мозга, что, скорее всего, связано с хелацией двухвалентных ионов, и, прежде всего ионов магния, который является важным регулятором активности фермента (Bonting S.L et al., 1983). Однако в опыте увеличение концентрации ЭДТА не приводило к изменению активности фермента, что, по-видимому, обусловлено тем, что прединкубация с гемолизатом эритроцитов снижает чувствительность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга к низким концентрациям ионов магния.
Таким образом, изменение концентрации ЭДТА в среде определения ферментативной активности выявило, что факторы из гемолизата эритроцитов, вызывающие снижение активности Na.K-АТФазы гомогената головного мозга крысы, влияли на фермент даже при низких концентрациях двухвалентных ионов.
На следующем этапе исследовали влияние высоких концентраций MgCI2 в бескальциевой среде определения ферментативной активности на ингибирование Ка,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы гемолизатом эритроцитов при 0,5 мМ ЭДТА.
Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность NajC-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях ЭДТА в среде определения ферментативной активности
Результаты исследования зависимости активности №,К.-АТФазы гомогената головного мозга после прединкубации с полученными отдельными фракциями гемолизата эритроцитов от концентрации ЭДТА в среде определения ферментативной активности представлены нарис.14-16.
Ингибирующий эффект фракции №1 на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга проявлялся только при низкой концентрации ЭДТА (0,5 мМ) в среде определения ферментативной активности. Поскольку увеличение содержания ЭДТА приводит к снижению концентрации двухвалентных ионов магния в результате их хелации, то можно предположить, что отсутствие ингибирующего эффекта фракции №1 в средах, содержащих 1 мМ и 2 мМ ЭДТА, связано с магний-зависимым механизмом ингибирования.
Показано, что фракции №3 и №6 активировали Ка,К-АТФазу головного мозга при определении активности фермента в средах, содержащих 0,5 мМ и 1 мМ ЭДТА, тогда как при концентрации 2 мМ ЭДТА активность ЫаД-АТФазы гомогената головного мозга в опыте после прединкубации с модулирующими фракциями №3 и №6 не отличалась от активности фермента в контроле.
Также следует отметить, что в опыте с фракциями №3 и №6 выявлено достоверное снижение активности №,К-АТФазы гомогената головного мозга после инкубации в среде определения ферментативной активности содержащей 2 мМ ЭДТА по сравнению с активностью фермента после инкубации в среде, содержащей 0,5 мМ ЭДТА. Сведения об активаторах Na,K-ATOa3bi не многочисленны и представлены только в нескольких работах (Петруняка и соавт., 1990; Мацкевич, 1994). Важную роль в действии активаторов на функционирование Ыа,К-АТФазы играет соотношение двухвалентных ионов. Таким образом, можно отметить, что при снижении концентрации двухвалентных ионов в среде определения ферментативной активности в результате их хелации с помощью ЭДТА наблюдалось снижение модулирующих эффектов отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность исследуемого фермента, вплоть до отсутствия достоверных различий по сравнению с контролем после инкубации в среде определения ферментативной активности, содержащей 2 мМ ЭДТА. Отсутствие ингибирующего эффекта фракции №1 на активность Ка,К-АТФазы гомогената головного мозга при изменении содержания ЭДТА в среде определения ферментативной активности, может указывать на выраженную зависимость модуляторов данной фракции от концентрации двухвалентных ионов. Тогда как модулирующие эффекты фракций Xs3 и Х6 при варьировании содержания ЭДТА в среде определения на активность исследуемого фермента являются практически сходными между собой, что позволяет сделать предположение о сходных механизмах регуляции активности Na.K-АТФазы гомогената головного мозга крысы под влиянием факторов из этих фракций. Сравнивая проявление модулирующего эффекта нефракционированного гемолизата эритроцитов с проявлением эффектов его отдельных фракций на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга при аналогичных составах сред определения ферментативной активности, можно отметить, что эффект гемолизата эритроцитов являлся более выраженным и менее зависимым от состава среды определения ферментативной активности в отличие от эффектов отдельных фракций. Мы предположили, что во фракциях №1 и №2 присутствует спектрин -один из основных белков мембранного скелета, часть которого, что нельзя исключать, удаляется с цитоплазматической стороны мембраны эритроцитов уже в процессе гемолиза. В работе Фроловой (1996) показано, что прединкубация смеси белков мембранного скелета с тенями эритроцитов существенно повышала активность NaJC-АТФазы, причем при увеличении концентрации MgCb в инкубационной среде степень активации возрастала и достигала 45%. В связи с вышесказанным на следующем этапе исследования проводилась оценка модулирующих эффектов отдельных фракций гемолизата на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга крысы после инкубации в средах определения ферментативной активности, содержащих различные концентрации MgCk Модулирующие эффекты отдельных фракций гемолизата эритроцитов на активность Ма,К-АТФазы гомогената головного мозга при различных концентрациях MgCke среде определения ферментативной активности Изучение влияния содержания NfgCIg на модулирующие эффекты полученных фракций гемолизата эритроцитов на активность Ыа,К-АТФазы гомогената головного мозга показало, что повышение концентрации MgCh в среде определения ферментативной активности приводило к устранению ингибирующего эффекта фракции №1 (рис.17) и не влияло на активацию фермента головного мозга фракциями №3 и №6 (рис. 18-19).
