Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
ГЛАВА I. Выделение и изучение структуры №+,К+-АТФазы
История открытия фермента и его функции 9
Строение Ш^Х-АТФазы 11
Молекулярная гетерогенность Na+,K+-АТФазы 13
Каталитический цикл Na+,K*-АТФазы 15 # 1.5. Четвертичная структура Na+,K+-АТФазы 18
ГЛАВА И. Модификаторы активности №\К*-АТФазы 24
2.1. Эндогенные модификаторы активности Na+,K*-АТФазы 25
Катионы кальция 25
Фосфорилирование Ыа+,К+-АТФазы протеинкиназами 28
Ванадат-анион 28
Нейромедиаторы 29
Сердечные гликозиды 33
Влияние АФК на активность Na"\K+-АТФазы 42
Влияние NO на активность Na+,K+-АТФазы 45
2.2. Экзогенные модификаторы активности Ыа+,К+-АТФазы 48
Палитоксин 48
Сангинарин 50 ГЛАВА III. Материалы и методы исследований 52
Определение активности №+,К+-АТФазы 52
Определение активности №+,К+-АТФазы эритроцитов крысы 53
Получение микросом и диализата микросомно-цитоплазматической фракции из мозга крупного рогатого скота 54
3.4. Обнаружение веществ после разделения смесей методом
ТСХ на силуфоле и на пластинках с закрепленным
слоем силикагеля 54
3.5. Кислотный гидролиз ингибитора
Ыа+,К+-АТФазы из мозга крупного
рогатого скота 55
3.6. Определение молекулярной массы ингибитора, выделенного из мозга
крупного рогатого скота 55
3.7. Физико-химические методы исследования структуры
ингибитора Na+,K*-ATOa3bi, выделенного из мозга крупного
рогатого скота 55
Синтез N-оксидов пиридина и хинолина и их производных 57
Статистическая обработка результатов 61 ГЛАВА IV. Экспериментальные результаты 62
Выделение эндогенного ингибитора 62
Влияние N-оксидов пиридина и хинолина
на активность №+,К+-АТФазы 70
ГЛАВА V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 78
ВЫВОДЫ 95
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96
ПРИЛОЖЕНИЕ 113
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АХ - ацетилхолин
АФК - активные формы кислорода
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ДА-дофамин
НА - норадреналин
НМ — нейромедиаторы
ПКА- протеинкиназа А
ПКС -протеинкиназа С
СМ - синаптические мембраны
ТСХ - тонкослойная хроматография
ЭРФ - эпидермальный ростовой фактор
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ЭИТЦ — эозинизотиоцианат
4DPyO - N-оксид 4-(4-диметиламиностирил)пиридина 15.2DQO - N-оксид 2-(4-диметиламиностирил)хинолина 16.4DQO - N-оксид 4-(4-диметиламиностирил)хинолина
JNK — c-jun N-terminal kinase
MAP - mitogen activated protein
МАРК - mitogen activated proteinkinase
4NQO- N-оксид 4-нитрохинолина
QO - N-оксид хинолина
SAPK a - stress activated protein kinase a
Введение к работе
Актуальность проблемы. №+,К+-АТФаза - фермент с олигомерной структурной организацией, встроенный в плазматическую мембрану животных клеток. Функции, выполняемые данным ферментом разнообразны: перенос ионов Na+ и К* против их концентрационного градиента, участие в создании мембранного потенциала клетки, в регуляции водно-солевого обмена. В ряде тканей роль Ыа+,К+-АТФазы связана с транспортом субстратов для клеточного метаболизма. Выявлено участие №+,К+-ЛТФазы в реализации межклеточных контактов и её связь с цитоскелетом. Последние годы активно изучается рецепторная функция фермента и его влияние на работу ядерного аппарата клетки (Лопина О.Д., 2001).
Учитывая выше сказанное, естественно предположить наличие сложной, гибкой, разноуровневой системы регуляции активности №+,К*-АТФазы. В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на поиски регуляторов активности фермента.
Решение этой проблемы имеет не только научное, но и практическое значение. В частности, изменение концентрации модификаторов активности фермента в организме, как полагают, связано с развитием и течением гипертонии, патогенеза хронической сердечной, почечной недостаточности, ишемии (de Wardener Н.Е., 1985; Haddy F.J. 1990; Schwinger R.H., 2003;). Проводились исследования, выявляющие корреляцию между поведенческими реакциями и высокой активностью Na ,К -АТФазы, что может непосредственно влиять на способность к обучению. Снижение активности Ыа+,К+-АТФазы, по-видимому, является одним из патогенетических факторов развития аллергического энцефаломиелита. Эти изменения наблюдаются еще до появления клинических признаков данного заболевания (Кучмеровская Т.М. и соавт., 2001). Существует также мнение, что злокачественное перерождение некоторых тканей начинается с того, что клетка не в состоянии восстановить нормальное соотношение Na /К*. Это
происходит вследствие повреждения мембраны и ее повышенной проницаемости для этих ионов или в результате взаимодействия сердечных гликозидов различного происхождения с Na ,К -АТФазой. Следствием этого может быть запуск метаболических реакций, приводящих к индукции онкогенов (Nakagawa Y. et al., 1992; Numazawa S. et al., 1996; Szabo E. et al., 1998).
Поэтому неудивительно, что большое внимание уделяется поиску как эндогенных, так и экзогенных модификаторов активности Ыа+,К+-АТФазы.
К настоящему времени из коры надпочечников и гипоталамуса млекопитающих получен в очищенном состоянии эндогенный оуабаин — высоко специфичный ингибитор Ыа+,К+-АТФазы, химическая структура которого идентична структуре сердечных гликозидов растительного происхождения (Schoner W., 2001)
Важность выполняемых функций №+,К+-АТФазой, существование нескольких изоформ фермента, их различная устойчивость к сердечным гликозидам (существует оуабаинрезистентная форма Ыа+,К+-АТФазы) (Болдырев А.А., 2001) дают основания предполагать о существовании в организме позвоночных других модификаторов данного фермента, отличающихся по структуре от выделенного эндогенного оуабаина. И действительно, в результате многочисленных экспериментов были получены вещества, воздействующие на активность Na ,К -АТФазы, по структуре не являющиеся гликозидами (Елаев Н.Р., 1994).
Целью настоящей работы явилось выделение эндогенного ингибитора Ыа+Х-АТФазы нервных клеток из ткани головного мозга крупного рогатого скота, характеристика его структуры, а также синтез новых биологически активных соединений, способных изменять активность изучаемого фермента.
Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1.Выделение и очистка из мозга крупного рогатого скота ингибитора Na+,K"H-ATOa3bi. Характеристика его структуры.
2. Изучение влияния выделенного ингибитора на скорость АТФазной реакции.
З.Синтез N-оксидов пиридина и хинолина, оценка возможности их использования в качестве экзогенных веществ-модификаторов активности Na+,K+-AT 4. Сопоставление специфичности эндогенных и экзогенных ингибиторов №+,К+-АТФазы. Научная значимость работы состоит в том, что выделен и очищен до гомогенного состояния из мозга крупного рогатого скота новый ингибитор Na ,К -АТФазы нервных клеток. Идентифицирована химическая структура и изучены его свойства. Выделенное соединение, тропное к Na ,К -АТФазе, является представителем нового класса ингибиторов этого фермента. Данный ингибитор, отличающийся по строению от эндогенного оуабаина, характеризуется аналогичной специфичностью, ингибирующей активностью, действующей при концентрации до 10"8 М, что сопоставимо с действием оуабаина. Впервые показано, что синтезированные N-оксиды пиридина и хинолина и их производные, ингибирующие №+,К+-АТФазу нервных клеток, также проявляют высокое сродство к данному ферменту. Полученные данные расширяют представления о возможностях влияния модификаторов активности изучаемого фермента на физиологические процессы. Научно-практическая значимость исследования заключается в том, что выделенный ингибитор, его характеристики могут быть использованы для патогенетически обоснованного подхода к терапии ряда заболеваний, связанных с нарушением функций №+,К+-АТФазы. Получение гетероароматических N-оксидов пиридина и хинолина и их производных может послужить оснозой для разработки новых фармакологических препаратов, используемых для экзогенной регуляции активности фермента. На защиту выносятся следующие положения: В ткани головного мозга крупного рогатого скота обнаружен неизвестный ранее ингибитор Ыа+,К+-АТФазы. Этот ингибитор оказался ациклическим аминоспиртом с молекулярной массой 200 Да. Предложена примерная формула и возможный механизм действия выделенного ингибитора Ка+,К*-АТФазы. ф 4. Разработан синтез N-оксидов пиридина и хинолина и их производных, специфически ингибирующих активность Ыа+,К+-АТФазы. 5. Сопоставлены степени аффиности эндогенных и экзогенных ингибиторов Ыа+,К+-АТФазы. Апробация работы. Материалы работы были представлены на 11 международном симпозиуме по орган ическому синтезу в Амстердаме (Амстердам, 1996); на международной конференции студентов и молодых ученых Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2004). Публикации* По теме диссертации опубликовано 8 научных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, полученных результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. В работе приведены 21 рисунок, 13 таблиц. Список литературы содержит 157 библиографических источников, из них 36 отечественных и 121 иностранных публикаций. 9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫПохожие диссертации на Влияние эндогенных и экзогенных модификаторов на активность Na+, K+ -атфазы
