Содержание к диссертации
ВВБЩЕНИЕ , .5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
ГЛАВА I. ХАРАКТЕРИСТИКА Ка,К-АТРазной СИСТЕМЫ 7
1.1. Локализация и распространение 7
1.2. На,К-АТРаза - основа активного транспорта ионов )/а+ и К+ 8
1.3. Молекулярная структура Ха,К-АТРазы 8
1.4. Регуляция Ка,К-АТРазы II
1.5. Частные реакции }/а,К-АТРазы 15
1.6. Участки специфического связывания 18
1.7. Кинетические модели Ка,К-АТРазы 21
ГЛАВА 2. КИНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ 32
2.1. Уравнение стационарной скорости 32
2.2. Методы анализа кинетических кривых 35
2.3. Определение количества центров связывания... 38
ГЛАВА 3. ЭКС1ШШШТМВНАЯ ЧАСТЬ 42
3.1. Материалы исследования 42
3.2. Методы исследования 42
3.2.1. Получение мембранных препаратов. Обработка дезоксихолатом 42
3.2.2. Обработка микросомальной фракции
йодистым натрием 43
3.2.3. Определение концентрации белка и ]/а,К-АТРазной активности 46
3.3. Математическая обработка даниых 47'
3.3.1. Методы статистической оценки 47
3.3.2. Оценка линейности функций 49
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 52
4.1. Определение количества активаторных и ингибиторных катионных участков Ка,К~АТРазы.. 52
4.2. Изучение зависимости скорости от отношения концентрации ионов Ка+ и К+ 62
4.3. Кинетическая схема рКрРазы 75
4.3.1. Зависимость рМРРазной активности от ионов К+ 76
4.3.2. Зависимость гидролиза pl^PP от ионов Ка+... 83
ІЖВА 5. ОБСЛДЕШЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 90
ВЫВОДЫ 102
ПРИЛОЖЕНИЕ 104
ЛИТЕРАТУРА
Введение к работе
Кга+,К+ активируемая, Mq +-зависимая аденозинтрифосфатфос-фогидролаза представляет собой центральный белок плазматической мембраны клеток. Являясь основой натрий-калиевого насоса» она обеспечивает неравномерное распределение катионов между цитоплазмой и внеклеточной средой, осуществляя активный выброс натрия и одновременное накопление калия за счет энергии гидролиза АТР. Созданный таким образом градиент электрохимических потенциалов одновалентных катионов обеспечивает возникновение и проведение нервного импульса,и тем самымсоставляет основу явления возбудимости, биологическое значение которого трудно переоценить. Асимметричное распределение катионов имеет важное значение и для транспорта разных метаболитов: Сахаров, аминокислот и др. Неудивительно поэтому, что внимание к } а»К-АТРазе, основному белку плазматической мембраны клеток, не только не ослабевает со времени обнаружения этого фермента Скоу в 1957 году ( Skau,l957), но изучение его становится интенсивней и обширней, привлекая все новые разнообразные методы исследования.
Интерес к Ма»К-АТРазе определяется не только важной физиологической ролью фермента в жизнедеятельности клетки, но и тем, что она является сложным биологическим механизмом, преобразующим один вид энергии в другой. Каким образом происходит сопряжение скалярного процесса гидролиза АТР с векторным процессом транспорта ионов против градиента их концентрации в настоящее время неизвестно, хотя ответ на этот вопрос интересует не только исследователей Ка,К-АТРазы, но и других транспортных АТРаз. Имеются попытки сравнительного анализа экспериментальных данных о механизме действия различных транспортных АТРаз (Backer , 1970; schuur mans Stekhoven , Bon ting ,1981), однако общие закономерности функционирования транспортных ферментных систем еще не установлены. Для успешного решения этой проблемы, по видимому, необходимо дальнейшее исследование механизма действия отдельных АТРаз, а также нужно попытаться найти новые аспекты и подходы в изучении общих теоретических вопросов кинетики транспортных систем. Разработка новых теоретических подходов приобретает все большее значение еще и потому, что в настоящее время исследование Иа,К-АТРазы вступило в ту стадию, когда накоплен обширнейший экспериментальный материал и все чаще возникают кинетические схемы и молекулярные модели, авторы которык .пытаются объединить результаты многих исследований и предложить окончательный механизм протекания Ка,К-АТРазной реакции, или, по крайней мере, отдельных ее стадий ( Levitt,1980; Plesner et al., 198I; Robinson et al .»1983).
Целью данной работы является кинетическое изучение )/а,К-АТРазной системы. Применением новых кинетических методов определяется число катионных центров Ка,К-АТРазы с тем, чтобы найти необходимые условия для построения минимальной катионной модели транспортной системы. Обнаруженные особенности Wa,K-ATP-азы, а именно способность изменять число катионных центров в зависимости от условий, отражены в предлагаемой кинетической схеме рКРРазы. Особое внимание уделяется проверке соответствия модели с экспериментальным материалом, для чего проводится сравнение теоретических кривых с экспериментальными зависимостями. Работа представляет попытку доказать, что р}/РРаза может функционировать в двух режимах, переход между которыми контролируется ионами натрия.
