Введение к работе
Актуальность проблемы
Представления о роли облигатного мембранного белка Na,K-ATPa3bi (синоним -Na-насос) в жизни животной клетки помимо выполнения основной функции -поддержание ионных градиентов Na и К , в настоящее время дополнились фактами, свидетельствующими об участии этого белка в процессах клеточной сигнализации. Было показано, что Na,K-ATPa3a может выступать в роли рецептора кардиотонических стероидов, связывание которых с №,К-АТРазой приводит к инициации сигнального каскада, завершающегося активацией транскрипционных факторов, регулирующих гены раннего и позднего ответов (Kometiani et al, 1998; Xie et al, 1999; Peng et al, 2006). Исследование сигнального каскада с участием Na,K-ATPa3bi проводилось преимущественно на кардиомиоцитах и клетках почечного эпителия, где присутствуют al (почечный эпителий, кардиомиоциты) и а2 изоформы (кардиомиоциты) №,К-АТРазы (Xie, Askari, 2002; Aizman, Aperia, 2003; Akimova et al, 2005), различающиеся no чувствительности к переносимым ионам Na+ и К+, АТФ (Mobasheri et al, 2000) и активным формам кислорода (АФК) (Huang et al, 1994; Boldyrev et al, 2003), а у некоторых животных - и по чувствительности к кардиотоническим стероидам (Charlemagne et al, 1993).
Наиболее интересным, на наш взгляд, является исследование участия Na-насоса в сигнальных каскадах нейрональных клеток, поскольку Na,K-ATPa3a имеет особое значение для функционирования нервной ткани. В тканях мозга Na,K-ATPa3a представлена al, a2 и a3 изоформами, причем а2 типична преимущественно для глиальных клеток, а аЗ - для нейронов (Urayama et al, 1989; McGrail et al, 1991; Peng et al, 1997). Показано, что мутация аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi сопряжена с развитием нейрональных заболеваний, таких как паркинсонизм и семейная гемиплегическая мигрень II типа (Aguiar et al, 2004); а а2 изоформа отвественна за повышение кровяного давления, в результате накопления уабаина в кровеном русле после продолжительного введение уабаина в организм (Dostanic et al, 2005; Van Huysse, 2007). Другая особенность нервной ткани - это разнообразие глутаматных рецепторов, нарушение функций которых приводит к развитию окислительного стресса и, как следствие, к развитию ряда нейродегенеративных заболеваний (Boldyrev et al, 2004). Наиболее важными для этих процессов являются глутаматные рецепторы, активирумые ТЧ-метил-О-аспартатом (NMDA). Более того, было показано, что низкие концентрации уабаина оказывают нейропротекторное действие и предотвращают развитие апоптоза клеток нервной ткани, вызванное действием каиновой кислоты (агонист глутаматных рецепторов) (Golden et al, 2006).
В этом отношении возникает оправданный вопрос, существует ли взаимодействие между этими белками - №,К-АТРазой и глутаматными рецепторами. Показано, что гиперактивация NMDA-рецепторов, относящихся к классу ионотропных глутаматных рецепторов, приводит к снижению активности только а2 и аЗ, но не а1 изоформы Na,K-АТРазы в гранулярных клетках мозжечка (Boldyrev et al, 2003). Нельзя исключить и обратного влияния - Na,K-АТРазы на активность глутаматных рецепторов.
В данной работе мы предполагали исследовать внутриклеточные события, к которым приводит ингибирующее действие уабаина на работу Na,K-ATPa3bi в нейрональных клетках, а также определить роль разных а изоформ Na,K-ATPa3bi в осуществлении этих событий. Поскольку известно, что в других типах клеток действие уабаина приводит к активации митоген-зависимого сигнального каскада, мы сконцентрировали наши исследования впервую очередь на участниках именно этого сигнального каскада. Кроме того, мы предполагали оценить вовлечение глутаматных рецепторов NMDA-класса в процесс активации сигнального каскада, вызванного действием уабаина на нейрональные клетки. Цель и задачи работы
Целью данной работы явилась оценка участия разных изоформ а-субъединицы Na,K-ATPa3bi в реализации возможного сигнального каскада, активирующегося в нейрональных и подобных им клетках, при действии уабаина. Для выполнения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
Исследовать активацию Erkl/2 киназы, центрального белка митоген-активируемого сигнального каскада, в нейрональных клетках при действии различных концентраций уабаина
Выявить зависимость активации Erkl/2 киназы от свободных радикалов и концентрации внутри- и внеклеточного Са при действии уабаина в нейрональных клетках
Выявить участие различных протеинкиназ в активации Erkl/2 киназы в нейрональных клетках
Создать клетки с раздельным подавлением в них экспрессии al и аЗ изоформ Na,K-АТРазы
Оценить жизнеспособность клеток, в которых подавлена экспрессия al или аЗ изоформы Na,K-АТРазы при действии уабаина
Сравнить активацию уабаином Erkl/2 киназы в клетках с подавленной экспрессией al или аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi
Научная и практическая новизна
Впервые показано, что в активации Erkl/2 киназы, вызванной ингибированием Na,K-ATPa3bi уабаином в нейрональных клетках, принимают участие NMDA-рецепторы. Впервые были созданы разные типы клеток нейробластомы SK-N-AS, в которых осуществляется раздельное подавление экспрессии преимущественно al или аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi с помощью механизма РНК-интерференции и охарактеризовано действие уабаина на их жизнеспособность. Обнаружено, что удаление любой из исследованных изоформ Na,K-ATPa3bi приводит к гибели клеток. Это указывает, что в условиях активации сигнального каскада, вызванного ингибирующим действием уабаина на работу Na,K-ATPa3bi, ни одна из исследованных изоформ Na,K-ATPa3bi не способна компенсировать отсутствие другой. Исследование клеток нейробластомы SK-N-AS с подавленной экспрессией аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi, показало непосредственное участие этой изоформы в активации Erkl/2 киназы, что отражает сигнальную роль аЗ изоформы в этих клетках и указывает на функциональные различия изоформ а субъединицы фермента. Полученные данные о сигнальной роли аЗ изоформы в клетках могут стать основой для уточнения молекулярных механизмов различных нейродегенеративных заболеваний, поскольку известно, что их развитие сопряжено с наличием мутаций в гене аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi (Vanmolkot et al, 2003; de Carvalho Aguiar et al, 2004). Апробация работы и публикации
Результаты диссертационной работы были представлены на VII Международной конференции по АТРазам, связанным с различной клеточной активностью (Киренчестер, Англия, 2007), XII Международной конференции по АТРазам Р-типа (Орхус, Дания, 2008), II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2010 г). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ. Структура и объем диссертации
Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 49 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 194 отечественных и зарубежных источников.
