Введение к работе
Актуальность проблемы. Липопротеины плазмы крови в функциональном отношении представляют собой, как известно, транспортную систему для биологически активных веществ различной химической природы. Кроме липидов липопротеины могут связывать и транспортировать, в том числе и через цитоплазматическую мембрану, ксенобиотики [Поляков Л.М. и др., 1992; Woofter R.T., Ramsdell J.S., 2007], жирорастворимые витамины [Glevidence B.A., Bieri J.G., 1993; Панин Л.Е. и др., 1997; Balazs Z. et al., 2004], стероидные соединения [Панин Л.Е. и др., 1988; Meng Q.H. et al., 1999; Khalil A. et al., 2000], тиреоидные гормоны [Поляков Л.М., 1998], лекарственные препараты [Rensen P.C. et al., 2001; Lou B. et al., 2005; Feng M. et al., 2008].
Главную роль при взаимодействии биологически активных веществ с липопротеинами играют белковые компоненты – аполипопротеины, а клеточный захват их осуществляется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Многолетние научные исследования сотрудников НИИ биохимии СО РАМН и данные литературы позволяют сделать вывод о преимущественном участии липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и их основного белкового компонента – аполипопротеина А-I (апоА-I), – в связывании и транспорте биологически активных соединений. Так, именно ЛПВП с высоким сродством связывают стероидные гормоны и ксенобиотики, играя роль их активной транспортной формы в организме [Панин Л.Е. и др., 1992; Поляков Л.М. и др., 1992]. Показана способность липопротеинов высокой плотности осуществлять транспорт некоторых противоопухолевых лекарственных препаратов [Kader A., Pater A., 2002]. В серии работ изучена способность апоА-I транспортировать малые интерферирующие РНК против вируса гепатита С в гепатоциты посредством рецептора SR-B1 [Kim S.I. et al., 2009; Lee H. et al., 2009]. Отмечено участие апоА-I в переносе олигонуклеотидов через гемато-энцефалический барьер [Kratzer I. et al., 2007].
Следует отметить, что проблема направленного транспорта является одной из центральных в современной медицинской биотехнологии. Химическая природа липо(апо)протеинов, способность их проникать в клетки обусловливают преимущества данных соединений как высокоэффективных природных переносчиков. Использование липо(апо)протеинов в качестве транспортной формы лекарственных препаратов и генетического материала может повысить эффективность лечения ряда патологических состояний.
Роль липопротеинов плазмы крови не ограничивается выполнением транспортной функции. Известно, что липопротеины и их белковые компоненты участвуют в регуляции многих метаболических процессов. Так, ЛПВП и апоА-I осуществляют регуляцию обмена холестерина в клетках при участии мембранных белков ABCA1 и SR-BI [Zannis V.I. et al., 2006; Торховская Т.И. и др., 2006]. Липопротеины разных классов оказывают влияние на функцию эндокринной системы, в частности, принимают участие в регуляции стероидогенеза [Панин Л.Е., Поляков Л.М., 1979; Temel R.E. et al., 1997; Travert C. et al., 2000], синтеза тироксина [Бернштейн Л.М. и др., 1982] и инсулина [Панин Л.Е. и др., 1994]. Описано влияние липо(апо)протеинов на структурно-функциональные свойства митохондрий [Панин Л.Е. и др., 1991]. Показана роль липопротеинов и их белковых компонентов в регуляции углеводного обмена [Панин Л.Е. и др., 1990].
Обнаружен лизосомотропный эффект апоА-I [Панин Л.Е., 1987], отмечены его антимикробные [Agawa Y. et al., 1991; Tada N. et al., 1993] и противовирусные свойства [Srinivas R.V. et al., 1990; . et al., 1990; Панин Л.Е. и др., 2002]. Известно кардиопротекторное, антиоксидантное и противовоспалительное действие ЛПВП, апоА-I и их синтетических миметиков [Ma J. et al., 2004; Gupta H. et al., 2005; Navab M. et al., 2007; Gomaraschi M. et al., 2008]. В то же время ЛПВП в силу сложности своего строения и состава могут оказывать прооксидантный и провоспалительный эффекты [. et al., 2001].
Имеются данные о способности ЛПВП усиливать пролиферацию опухолевых клеток [Favre G. et al., 1989, 1993; . et al., 1989]. Напротив, липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и их основной белковый компонент аполипопротеин Е (апоЕ) ингибируют деление клеток, включая опухолевые [Vogel T. et al., 1994; Paka L. et al., 1999; Moore Z.W. et al., 2005].
Особый интерес для изучения механизмов регуляции внутриклеточного метаболизма представляет взаимодействие липопротеинов и гормонов. Отмечено, что стимулирующий эффект эстрадиола на клеточный рост карциномы грудной железы проявляется только в присутствии ЛПВП [Jozan S. et al., 1985]. Показан кооперативный эффект в действии гидрокортизона, адреналина и ЛПВП, в основе которого лежит лизосомозависимая активация хроматина, приводящая к индукции синтеза РНК и белка в переживающих срезах печени крыс [Панин Л.Е., 1987; 1990].
Исследования, проведенные сотрудниками НИИ биохимии СО РАМН под руководством академика РАМН Л.Е.Панина, позволяют утверждать, что липо(апо)протеины играют важную роль в структурно-функциональной организации хроматина эукариот, поддерживая его транскрипционную активность. В частности, в ядрах клеток различных тканей крыс была обнаружена апоА-I-иммунореактивность. Наиболее высокой она оказалась в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе [Панин Л.Е.и др., 1992, 2000]. В серии работ института на различных моделях была показана способность ЛПВП и апоА-I усиливать процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в клетках различных тканей организма [Панин Л.Е. и др., 1987, 2001, 2002, 2003, 2007]. Механизм этого явления связан с образованием биологически активного комплекса апоА-I и восстановленных форм стероидных гормонов при участии макрофагов и его специфическим взаимодействием с ДНК с последующей инициацией транскрипции генов [Панин Л.Е., 1998; Гимаутдинова О.И. и др., 2002; Панин Л.Е. и др., 2002, 2006, 2008]. Предполагается, что данный механизм лежит в основе регуляции процессов пролиферации [Панин Л.Е., 2002].
Участие липо(апо)протеинов в регуляции генетического аппарата клетки подтверждают и данные других авторов. Так, ЛПВП ингибировали экспрессию фактора адгезии-1 в эндотелиальных клетках пупочной вены человека. При этом более выраженным эффектом обладала фракция ЛПВП3 [Ashby D.T. et al., 1998]. В опухолевых клетках ЛПВП повышали скорость образования мРНК апоА-I [. et al., 1989]. АпоА-I и его синтетический пептид стимулировали экспрессию плацентарного лактогена в культуре трофобластов человека [Handwerger S., et al., 1995].
Несмотря на представленные в литературе результаты исследований по изучению транспортной и регуляторной роли липо(апо)протеинов плазмы крови, многие вопросы в этой области остаются открытыми. В частности, окончательно невыяснены механизмы регуляции метаболических процессов с участием липо(апо)протеинов. Недостаточно работ по изучению возможности использования липо(апо)протеинов в качестве транспортной формы лекарственных препаратов для повышении эффективности лечения ряда заболеваний. Отсутствуют данные о способности липо(апо)протеинов осуществлять направленный транспорт генетического материала в ядра клеток для коррекции функции поврежденных генов.
Цель исследования: изучить роль липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А-I в механизмах регуляции внутриклеточного метаболизма и направленном транспорте биологически активных веществ в клетки.
Задачи исследования:
-
Изучить процессы комплексообразования липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А-I с биологически активными веществами различной природы: стероидными гормонами, полисахаридами, лекарственными препаратами и исследовать способность аполипопротеина А-I осуществлять направленный транспорт биологически активных веществ в клетки.
-
Выяснить роль липопротеинов высокой плотности в комплексе со стероидными гормонами в регуляции процессов биосинтеза белка в опухолевых клетках.
-
Изучить роль аполипопротеина А-I в комплексе со стероидными гормонами и аполипопротеина Е в регуляции биосинтетических процессов в клетке.
-
Выяснить влияние липопротеинов высокой плотности и их комплексов с полисахаридами на продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1.
-
Оценить возможность использования аполипопротеина А-I в качестве транспортной формы генетического материала в ядра эукариотических клеток.
-
Исследовать эффективность использования липопротеинов высокой плотности в качестве транспортной формы противоопухолевого лекарственного препарата рубомицина.
-
Изучить возможность использования аполипопротеина А-I в качестве транспортной формы противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида.
Научная новизна работы.
На изолированных гепатоцитах крыс методами флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показан рецептор-опосредованный эндоцитоз апоА-I с последующей транслокацией белка в ядерный аппарат клетки. Показана способность апоА-I повышать эффективность внутриклеточного транспорта биологически активных веществ различной природы.
Впервые показано взаимодействие апоА-I с генетическим материалом с использованием в качестве модели эукариотического вектора с встроенным геном флуоресцирующего белка CFP. В опытах in vitro и in vivo методами флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показана способность апоА-I осуществлять транспорт генетического материала в ядра клеток (гепатоциты) с последующей экспрессией транспортируемого гена и синтезом флуоресцирующего белка в цитоплазме.
В работе обнаружена способность липопротеинов плазмы крови связывать и транспортировать свободные нуклеиновые кислоты. Показано относительное содержание внеклеточной ДНК в составе различных фракций липопротеинов. Наибольшее содержание внеклеточной ДНК отмечено в составе ЛПВП.
На модели асцитной карциномы Эрлиха показано участие ЛПВП и стероидных гормонов (кортизол, прогестерон) в механизме опухолевого роста, которое заключается в усилении скорости биосинтеза белка. В сокультуре опухолевых клеток подтвержден открытый ранее в НИИ биохимии СО РАМН механизм регуляции процессов пролиферации и клеточного роста, в котором важную роль играют макрофаги.
Показано участие перитонеальных макрофагов в метаболической деградации ЛПВП. Обнаружено, что опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженной способностью к поглощению и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП. Отмечено стимулирующее влияние стероидных гормонов на поглощение ЛПВП макрофагами, более выраженное для опухоль-ассоциированных клеток.
Впервые на культуре гепатоцитов крыс выявлена биологическая активность комплексов апоА-I с женскими половыми гормонами. Показано повышение скорости синтеза белка под влиянием эстриола и эстрадиола, которое значительно усиливалось в присутствии апоА-I. Отмечено, что комплекс апоА-I с эстроном также усиливал синтез белка, в то время как свободный гормон не обладал индуцирующим влиянием. Впервые показана способность комплекса апоА-I с прегненолоном повышать скорость биосинтеза ДНК и белка в культуре гепатоцитов.
Обнаружена активация гликолитического звена углеводного обмена в изолированных гепатоцитах крыс под влиянием комплекса апоА-I с тетрагидрокортизолом, биологическая активность которого в отношении процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот была показана ранее в работах НИИ биохимии СО РАМН.
На культуре гепатоцитов, клеток асцитной НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха впервые установлена разнонаправленность эффектов ЛПВП/апоА-I в комплексе со стероидными гормонами и ЛПОНП/апоЕ в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. Показана способность ЛПОНП и апоЕ снижать скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот и подавлять стимулирующий эффект биологически активных комплексов апоА-I со стероидными гормонами.
Обнаружение разнонаправленности эффектов ЛПОНП/апоЕ и ЛПВП/апоА-I раскрывает механизм регуляции опухолевого роста с участием макрофагов, который обусловлен способностью макрофагов, с одной стороны, поглощать ЛПВП и стероидные гормоны с образованием биологически активного комплекса, усиливающего биосинтез белка и нуклеиновых кислот, а с другой стороны, синтезировать и секретировать апоЕ, обладающий антипролиферативной активностью. Показано, что опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженным содержанием апоЕ.
Впервые методом флуоресцентной микроскопии показана возможность транспорта ЛПС в гепатоциты с использованием в качестве переносчика апоА-I. Результаты свидетельствуют о способности гепатоцитов участвовать в метаболической деградации эндотоксина при поглощении его в комплексе с ЛПВП и апоА-I. Путь нейтрализации ЛПС без участия макрофагов можно рассматривать как альтернативный, позволяющий снизить интенсивность воспалительного ответа. Показана способность ЛПВП ингибировать продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1 перитонеальными макрофагами мышей.
На культуре клеток HA-1 гепатомы показана эффективность использования ЛПВП в качестве средства адресной доставки противоопухолевых лекарственных препаратов на примере рубомицина. На частицах ЛПВП обнаружены места связывания для препарата с различной степенью аффинитета. Показано повышение эффективности поглощения рубомицина опухолевыми клетками при использовании ЛПВП в качестве переносчика, обусловленное рецептор-опосредованным эндоцитозом. Отмечено увеличение цитотоксического эффекта препарата в комплексе с ЛПВП при снижении его терапевтических доз. Показана селективность воздействия препарата в комплексе с ЛПВП, более выраженная по отношению к опухолевым клеткам.
Впервые проведено исследование возможности использования апоА-I в качестве лизосомотропного агента и средства внутриклеточной доставки противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида. Обнаружен высокий аффинитет изониазида к апоА-I. Показана способность апоА-I повышать свободную активность ферментов лизосом на фоне антимикобактериальной терапии. Отмечен противовоспалительный эффект апоА-I.
Теоретическая и практическая значимость работы. Решение поставленных в диссертации задач является важным этапом в изучении транспортной и регуляторной роли липопротеинов плазмы крови и их белковых компонентов. Внесен вклад в понимание механизмов проникновения биологически активных веществ в клетку в составе липопротеиновых комплексов. Результаты исследования свидетельствуют о том, что транспортируемые липопротеинами соединения проникают в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Изучение роли липопротеинов в регуляции пролиферации и клеточного роста имеет важное теоретическое значение для понимания молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий в норме и в условиях опухолевого роста и может служить основой для повышения эффективности лечения онкологических больных.
Совокупность полученных фактов свидетельствует о перспективности использования ЛПВП и апоА-I в качестве транспортных форм для биологически активных веществ и лекарственных препаратов как в эксперименте, так и в клинике. Результаты работы показывают перспективность дальнейшего изучения использования апоА-I в качестве транспортной формы генетического материала при решении проблем генотерапии и генокоррекции.
Положения, выносимые на защиту.
-
ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами усиливают процессы биосинтеза белка в опухолевых клетках при участии макрофагов. Опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженной способностью к поглощению и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП. Стероидные гормоны оказывают стимулирующее влияние на метаболическую деградацию ЛПВП.
-
Комплексы апоА-I со стероидными гормонами обладают высокой биологической активностью: усиливают процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в изолированных гепатоцитах и повышают активность гликолитического звена углеводного обмена.
-
ЛПВП/апоА-I в комплексе со стероидными гормонами и ЛПОНП/апоЕ характеризуются разнонаправленностью эффектов в регуляции процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот.
-
АпоА-I проникает в ядерный аппарат гепатоцитов и может использоваться в качестве средства адресной доставки генетического материала с последующей экспрессией транспортируемого гена.
-
ЛПВП и апоА-I являются эффективной формой для направленного транспорта в клетки различных лекарственных средств: цитостатиков, противотуберкулезных и гормональных препаратов.
Апробация результатов исследования. Материалы диссертации докладывались на I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (19-23 сентября 2005 г, Сочи), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (19-22 мая 2008 г, Москва), Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (1-3 октября 2008 г, Новосибирск), Российской научно-практической конференции с международным участием «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г, Томск), EASL Special Conference on NAFLD/NASH and Related Metabolic Disease (24-26 сентября 2009 г, Болонья, Италия), IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (27-29 октября 2009 г, Новосибирск) и были представлены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (7-9 ноября 2007 г, Новосибирск), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г, Новосибирск), II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (29-31 октября 2008 г, Кишинев, Молдова), 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell (2-4 декабря 2008 г, Гуанджой, Китай), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г, Москва), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (18-19 марта 2010 г, Новосибирск).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, из них 12 статей в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ биохимии СО РАМН.
***
Автор выражает глубокую благодарность за консультативную помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы академику РАМН Панину Льву Евгеньевичу, профессору Полякову Льву Михайловичу, а также всем коллегам, принимавшим участие в исследованиях.
