Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание систем, способных осуществлять специфический направленный транспорт биологически активных веществ из системного кровотока к клеткам центральной нервной системы является одной из самых актуальных задач нейрофармакологии. Известно, что инкапсуляция препаратов в различные микроконтейнеры существенно улучшает их фармакокинетические параметры, снижает токсичность, позволяет уменьшать разовые и курсовые дозы На современном этапе доставка препаратов к клеткам мозга сводится к использованию конъюгатов лекарственных препаратов с векторными антителами, наночастиц и липо-сом. Наиболее перспективными системами для доставки различных лекарственных средств считаются стерически стабилизированные липосомы, обладающие свойством длительно циркулировать в системном кровотоке, будучи нераспознанными макрофагами ретикулоэндотелиальной системы [Allen Т.М., 1991]. Конъюгация их с различными векторными молекулами должна обеспечить нацеливание их на определенные клетки-мишени [Ga-bizon A., et al., 1990; Allen T.M., et al., 1994] Основным недостатком таких систем является неспособность преодолевать гематоэнцефалический барьер. Что касается направленного транспорта в опухоли мозга, то он в значительной степени облегчен благодаря нарушению целостности гемагоэнце-фалического барьера. За последнее десятилетие было создано несколько липосомальных транспортных систем для доставки противоопухолевых препаратов к клеткам злокачественных глиальных опухолей, которые по частоте занимают первое место среди первичных опухолей мозта [Kou-kourakis М., et al., 2000; Fabel К., et al., 2001; Haoki H., et al., 2004]. Для повышения эффективности их действия в качестве векторов использовались молекулы трансферрина, антитела к трансферрину, фолиевая кислота, так как опухолевые клетки экспрессируют рецепторы к этим веществам в больших количествах, нежели нормальные клетки [Huwiler J., ct al., 1996, Huwiler J., et al., 1997; Shi G., et al., 2002; Saul J., ct al., 2003]. Это, с одной стороны, делало доставку препаратов в опухолевые клетки избирательной по отношению к нормальным клеткам мозга, а с другой стороны, приводило к накоплению препарата практически во всех органах и тканях, так как выбранные молекулярные мишени являлись неспецифичными. Решить такую проблему было бы возможно, если в качестве мишеней можно было использовать молекулы, экспрессируемые только опухолевой клеткой. Изучение молекулярного профиля злокачественных глиом на сегодняшний день не обнаружило присутствия постоянно экспрессируемых опухолевыми клетками специфических маркеров [Kondo Y., et al., 2004]. Исследования специфического маркера нормальных астроцитов — глиофибрилляр-ного кислого белка (GFAP), показали возможность использования его в качестве мишеней для направленного транспорта [Чехонин В.П. с соавт., 2000; Чехонин В.П. с соавт,, 2003], а, разработка методов получения моноклинальных антител к нейроспецифическим белкам позволило вплотную подойти к решению проблемы [Чехонин В П с соавт , 2000, Турина О И..
2005]. Наличие данных о сохранении эксгЬвдвиюодмбМЯЭДй^крлевыми
БИБЛИОТЕКА і
I I *
клетками астроглиального происхождения [Коршунов А.Г., Сычева Р.В., 1995; Iwa N., et al., 1983] позволяет рассматривать его как потенциальную мишень для доставки биологически активных веществ к соответствующим клеткам с помощью микроконтейнеров, конъюгированных с моноклональ-ными анти-СРАР-антителами, создание которых и являлось целью данного исследования.
Цель исследования: Разработать способ получения ПЭГилирован-ных (покрытых полиэтиленгликолем) иммунолипосомальных контейнеров, способных направленно доставлять противоопухолевые препараты к клеткам астроглиапьных опухолей и изучить ряд их физико-химических свойств.
Задачи исследования:
-
Разработать способ получения ПЭГилированных липосом.
-
Разработать способ конъюгирования моноклональных антител к глио-фибриллярному кислому белку (GFAP) с ПЭГилированными липосо-мами.
-
Изучить ряд физико-химических свойств иммунолипосом і
-
Провести иммуноморфологическую оценку специфичности связывания ПЭГилированных иммунолипосом с эмбриональными астроцитами мозга крысы и клетками глиомы крыс.
-
Определить количественное содержание GFAP в сыворотке крови больных глиомами мозга разной степени злокачественности.
Научная новизна:
Созданы стерически стабилизированные иммунолипосомы, содержащие доксорубицин, способные осуществлять адресную доставку препарата в клетки опухолей астроглиального происхождения.
Разработан способ практически 100%ной загрузки липосом доксору-бицином с использованием трансмембранных фадиентов рН и сульфата аммония в присутствии малеимидного производного фосфатидилхолина.
Практическая значимость исследования:
Показана возможность направленного транспорта в клетки глиаль-ных опухолей с помощью иммунолипосом с использованием GFAP в качестве молекулярной мишени, что открывает очевидные перспективы для патогенетически обусловленного метода терапии глиом, обеспечивающего избирательное накопление препарата в клетках опухоли и позволяющего значительно повысить эффективность терапии при снижении побочного действия противоопухолевых препаратов.
Положения, выносимые на защиту: 1. Эмульсионно-экструзионная технология обработки липидной смеси, состоящей из лецитина, холестерина, малеимидного производного фосфа-тидилэтаноламина и дистеароилфосфатидилэтаноламина, конъюгирован-ного с ПЭГ-2000, в молярном соотношении 23:16:1:1,6. использование активной зафузки доксорубицина с помощью трансмембранных концентрационного и рН фадиентов и малеимидного метода конъюгации анти-
GFAP-антител обеспечивают получение стерически стабилизированных иммунолипосом заданного размера.
-
Специфическое взаимодействие иммунолипосом с эмбриональными астроцитами мозга крысы и клетками глиомы С6 обусловлено иммунохи-мическим взаимодействием конъюгированных aHTH-GFAP-антител с антигеном, расположенным на поверхностной мембране клеток
-
Глиофибриллярный кислый белок может использоваться в качестве молекулярной мишени для адресной доставки биологически активных веществ в клетки опухолей астроглиального происхождения, поскольку его содержание в сыворотке крови больных глиальными опухолями мозга остается низким даже при больших объемах опухолей и не может препятствовать проникновению иммунолипосом в патологический очаг при их парентеральном введении
Апробация работы:
Материалы диссертации доложены и обсуждены на V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию Самарского государственного медицинского университета «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» (Самара, 2005) и на научных конференциях кафедры биохимии РУДН.
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура работы:
Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 19 рисунками Указатель литературы включает 245 источников, из них 8 отечественных, 237 зарубежных.
Автор выражает огромную признательность за поддержку и квалифицированную помощь сотрудникам лаборатории иммунохимии ГНЦ социальной и судебной психиатрии Росздрава д.м.н Гуриной О.И., к.х.н. Жиркова Ю.А., к.м.н. Семеновой А.В. и приносит слова искренней благодарности своим научным руководителям академику РАМН, д.м.н профессору Березову Темирболату Темболатовичу и академику РАМН, д.м.н. профессору Чехонину Владимиру Павловичу.
