Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 6
2.1 Структура мРНК н регуляция трансляции 6
2.1.1 Роль кепа в регуляции трансляции. 6
2.1.2 Роль поли(А)- последовательности в трансляции. 10
2.1.3 Кооперативное действие кепа и поли(А)-последователыюсти на эффективность трансляции . 13
2.1.4 Стабильность мРНКв бесклеточных системах трансляции. 17
2.1.5 Общие черты нетранслируемых областей мРНК эукариот. 18
2.1.6 Окружение стартового кодоиа мРНК. 20
2.2 Бесклеточиая система трансляции из зародышей пшеницы 22
2.2.1 Ионная сила и концентрация М^ в ЭЗП. 23
2.2.2 Влияние полиаминов, уровня АТФ и тРНК на биосинтез белка в ЭЗП. 25
2.2.3 Эндогенные активности ЭЗП. 27
2.3 Термннацня трансляции, котрансляционное сворачивание белков и рибосомиыи дисплей 29
2.3.1 Термннацня трансляции и её регуляция. 30
2.3.2 Котрансляционное сворачивание белков. 32
2.3.3 Рибосомиыи дисплей и гибриды мРНК-белок - основные методы отбора белков in vitro. 36
2.3.4 Достоинства и недостатки систем отбора in vitro. 45
3. Экспериментальная часть 49
4. Результаты и их обсуждение 63
4.1. Выделение бесклеточной системы трансляции из зародышей пшеницы (ЭЗП) и аналитический вариант трансляции в этой системе 63
4.1.1 мРНК и генетические конструкции. 63
4.1.2 Приготовление экстракта из зародышей пшеницы и аналитический вариант трансляции. 68
4.1.3 Качественный анализ целостности мРНКв условиях трансляции в ЭЗП 82 4.2 Синтез и скрининг белковой библиотеки из печени мыши в ЭЗП 87
4.2.1 Исследование агрегации продуктов трансляции с компонентами ЭЗП. 87
4.2.2 Определение чувствительности скрининга в рибосомном дисплее. 97
4.2.3 Синтез нашивной белковой библиотеки из печени мыши и ее скрининг на иммобилизованном метотрексате (ингибиторе активности ДГФР). 98
5. Выводы 102
6. Список литературы 103
- Структура мРНК н регуляция трансляции
- Кооперативное действие кепа и поли(А)-последователыюсти на эффективность трансляции
- Выделение бесклеточной системы трансляции из зародышей пшеницы (ЭЗП) и аналитический вариант трансляции в этой системе
- Приготовление экстракта из зародышей пшеницы и аналитический вариант трансляции.
Введение к работе
В настоящее время одним из ключевых методов изучения межмолекулярных взаимодействий является функциональный отбор биологически активных молекул in vitro. Разработанные ранее методы такого отбора оказались применимы только для РНК и ДНК со специфическими структурными и каталитическими свойствами [lieamlry, 1992; liartel, 1993; Osborn, 1997; Fanmlok, 2000; Hasselberth, 2000].
В отличие от скрининга нуклеиновых кислот функциональный отбор белков и пептидов in vitro требует физической связи между белком и кодирующей его нуклеиновой кислотой. Такая связь может быть реализована описанными ранее методами фагового дисплея [Smith, 1985] и дисплея на плазмидах [Schatz, 1996]. К сожалению, указанные методы отбора ограничены представительностью наборов РНК (ДНК). Так, библиотеки фагового дисплея лимитированы эффективностью трансфекции, которая составляет величину менее 10 независимых рекомбинантов.
Недавно была описана аналогичная фаговому дисплею стратегия функционального отбора белков, основанная на связи синтезированных полипептидов с прокариотическими (E.coli [Matteakis, 1994; Hanes, 1997; 1999]) и эукариотическими (ретикулоциты кролика \Hanes, 1999; Не, 1997; Makeyev, 1999] и зародыши пшеницы [Gersuk, 1997]) рибосомами. По аналогии с фаговым дисплеем этот метод скрининга получил название рибосомного дисплея. В этом случае количество последовательностей, которые могут быть представлены на рибосомах, значительно больше (более Ю12), чем это достижимо в фаговом дисплее. Однако оказалось, что метод рибосомного дисплея обладает существенным недостатком - он требует введения в скрининг мРНК без терминаторных кодонов. Это обстоятельство существенно затрудняет скрининг мРНК и кДНК библиотек в рибосомном дисплее.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы является:
1. Оптимизация бесклеточной системы трансляции /// vitro из зародышей пшеницы (экстракт зародышей пшеницы, ЭЗП) для скрининга в рибосомном дисплее мРНК (кДНК) библиотек.
2. Проведение отбора дигидрофолатредуктазы из полн(А+)РНК клеток печени мыши методом рибосомного дисплея на основе ЭЗП.
S
Структура мРНК н регуляция трансляции
Структура m G ррр Np (m7G, кеп), присоединенная к 5 -концу мРНК, является характерной для большинства эукариотических цитоплазматических и вирусных мРНК и m7G - структура кепа, uORF - открытые рамки считывания в 5 -нетранслируемой области мРНК, IRES - внутренние участки 5 -НТО мРНК, ответственные за связывание рибосомы, так называемые internal ribosome entry site (IRES -элементы), CDS - кодирующая часть мРНК, CPE - цитоплазматнческий элемент полиаденилирования. служит для эффективной инициации трансляции мРНК / // vivo. Копирование происходит в ядре почти сразу после синтеза первых 30 нуклеотидов РНК. Этот процесс катализируют ядерные гуанилилтрансферазы и гуанил-7-метилтрансферазы [Banerjee, 1980]. Ken мРНК играет важную роль в сборке инициаторного 488-комплекса и инициации трансляции на ранних этапах - он связывается с фактором инициации eIF4E, который является кеп-связывающей субъединицей фактора eIF4F. Это взаимодействие определяет сборку фактора eIF4F, в составе которого субъединица eIF4A функционирует как РНК-зависимая АТФ-аза [Шатский, 2001; Pestnva, 1999]. Последняя, как полагают, ответственна за разворачивание вторичной структуры РНК при АТФ-зависимом сканировании 5 -лидерной последовательности мРНК 405-субчастицей рибосомы [Gingras, 1999; Shatkin, 1985]
Известно, что целый ряд вирусных и некоторые клеточные мРНК некепированы, и это обстоятельство не мешает их эффективной трансляции. Оказалось, что эти мРНК используют другой, кеп-независимый механизм инициации трансляции, в который вовлечены внутренние участки 5 -НТО мРНК, ответственные за связывание рибосомы, так называемые internal ribosome entry site (IRES -элементы). Эти элементы представляют собой протяженные структурированные участки 5 -НТО, которые часто способны представлять инициирующий кодон сразу же в Р-участок 40S - субчастицы рибосомы. Необходимо отметить, что механизмы инициации с участием TRES -элементов многообразны. Интересные данные об этих механизмах можно найти в обзоре [Martiiiez-Salas, 2001].
Влияние кепа на инициацию бесклеточной трансляции было исследовано с точки зрения эффективности трансляции, корректности инициации и стабильности мРНК.
При изучении свойств нативной и декепированной мРНК вируса везикулярного стоматита в системах ЭЗП и бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика (лизат ретикулоцитов кролика, ЛРК), было установлено, что трансляция декепированной мРНК инициируется в том же месте, что и нативной мРНК, причем наличие кепа ускоряет время сборки SOS-комплекса в три раза [liergnumn, 1979]. Следует отметить, что оптимальные концентрации хлорида калия для эффективной трансляции нативной и декепированной мРНК вируса везикулярного стоматита оказались 96 и 50 мМ, соответственно. В ионных условиях, оптимальных для трансляции нативной мРНК, декепированная мРНК транслируется с 15% (ЭЗП) и 50% (ЛРК) эффективностью. Однако, оптимизация этих условий для декепированной мРНК позволила увеличить эффективность трансляции до 74% (ЭЗП) и 85% (ЛРК) [Bergmann, 1979].
Также было показано, что трансляция кепированной мРНК зрительного опсина быка в 2 раза эффективнее некепированного аналога, однако это снижение эффективности компенсировали увеличением концентрации декепированной мРНК в системе трансляции ЭЗП [Зозуля, 1988].
При исследовании ингибирования трансляции в ЭЗП и ЛРК было установлено, что аналоги кепа ингибируют трансляцию разных мРНК в разной степени [Shafritz, 1976; Weher, 1978]. Авторами был сделан вывод о том, что 5 -терминальный кеп может быть важен для трансляции некоторых мРНК независимо от выбранной бесклеточной системы трансляции. Однако вопрос, почему трансляция декепированных мРНК менее эффективна, оставался открытым.
При исследовании причин низкой эффективности трансляции декепированных мРНК Р-глобина и вируса мозаики люцерны выяснили, что декепированные мРНК в большей степени подвержены гидролизу в ЭЗП, чем кепированные, причем устойчивость последних к гидролизу не была связана с трансляцией (целостность мРНК в ЭЗП определяли в отсутствие аминокислот), а являлась, по-видимому, результатом защиты 5 -конца молекулы мРНК от 5 -экзонуклеазной деградации [Fletcher, 1990]. Аналогичные результаты были получены на реовирусных мРНК [Furuichi, 1977]. Кроме того, было показано, что для достижения одинаковой эффективности синтеза белка с декепированных матриц требуется в 6 (мРНК (3-глобина) и в 12 (мРНК вируса мозаики люцерны) раз больше фактора инициации eIF4F в системе, чем при использовании соответствующих кепированных мРНК [Fletcher, 1990].
Последнее обстоятельство, по-видимому, указывает на реализацию в ЭЗП отличного от общепринятого (модель Kozak) механизма инициации трансляции [Kozak, 1999]. Необходимо отметить, что к настоящему времени появилось большое количество данных, не подтверждающих модель Kozak, например, механизм шунтирования или механизм регуляции синтеза аминокислот у дрожжей [Futterer, 1993; Hannebush, 1997] (эти данные обсуждаются ниже). Серьёзной биохимической проверке в реконструированной системе трансляции и с разными матрицами (а не только с мРНК глобина), имеющими простую и короткую 5 -лидерную последовательность, модель Kozak никогда не подвергалась.
Кооперативное действие кепа и поли(А)-последователыюсти на эффективность трансляции
Большое количество экспериментальных данных свидетельствует о синергичной стимуляции трансляции кепированной и полиаденилированной мРНК в клетках животных, растений и грибов [Sachs, 1997; Gallic, 1995; Tarun, 1995]. Были даже предложены две математические модели, описывающие зависимость эффективности трансляции /// vivo от кепирования и полиаденилирования мРНК [Ш, 1999]. К сожалению, эти модели адекватно описывают лишь некоторые особенности процесса инициации трансляции. Так, хорошо согласуются с экспериментальными данными описания влияния экзогенной поли(А)-последовательности на трансляцию, репрессии мРНК клеток хозяина при аденовирусной и оспенной инфекциях, стимуляции трансляции мРНК генов теплового шока с одновременной репрессией остальных клеточных мРНК и кооперативного влияния кепа и поли(А)-хвоста на эффективность трансляции.
Кеп и поли(А)-последовательность в отдельности не обеспечивают такую эффективность трансляции в дрожжевых бесклеточных экстрактах, какой обладает кепированная и полиаденилированная мРНК [lizuka, 1994]. Однако, поли(А)-последовательность может стимулировать посадку рибосом на некепнрованные мРНК, даже если их 5 -конец химически модифицирован, и увеличивать вероятность инициации биосинтеза белка с внутренних кодонов [Preiss & Hentze, 1998; Preiss & Miickenthaler, 1998]. В оптимальных условиях уровень кеп-поли(А) синергизма для бесклеточных экстрактов из дрожжей и эмбрионов Drosophila составлял 3-15 раз в зависимости от системы трансляции [lizuka 1994; Preiss & Hentze, 1998; Gebauer, 1999; Tarun, 1997].
Более детально было исследовано кооперативное влияние кепа и поли(А) - мРИК на эффективность биосинтеза белка в системе бесклеточной трансляции из ретикулоцитов кролика. Было установлено, что максимальная кеп-поли(А) кооперативность требует взаимодействия eIF4G-PABP и, следовательно, циркуляризации мРНК [Michel, 2000]. Кроме того, показано, что elF4G-PABP связывание с кепированной и полиаденилированной мРНК значительно усиливает сродство eIF4E к 5 -концевому кепу [Вогпшп, 2000]. Также были определены условия, при которых синергичное влияние концевых структур мРНК реализуется в системе ЛРК в максимальной степени (присутствие кепа и поли(А) в структуре мРРІК увеличивали эффективность синтеза в 8 - 10 раз) : низкие концентрации ассоциированных с рибосомами факторов инициации; низкая концентрация мРЫК (тогда как обычно используют концентрацию близкую к насыщающей) и физиологические концентрации ионов К+ и Mg2+.
Данные о кооперативном участии кеп-поли(А) в ЭЗП противоречивы. Так, на примере полиаденилированной мРНК люциферазы было продемонстрировано, что в трансляции могут принимать участие молекулы мРНК со сближенными концами, причем во взаимодействие с поли(А)-участком вовлечены eIF4B (!) и eIF4F [Gallic, 1994]. В другой работе тех же авторов никакого кооперативного кеп-поли(А) влияния на эффективность трансляции мРНК люциферазы обнаружено не было [Gallic, 1995].
Отсутствие кооперативного влияния кепа и поли(А)-хвоста мРНК на эффективность трансляции в ЭЗП, по-видимому, может быть объяснено механизмом образования мРНК со сближенными концами в комплексе с факторами инициации и РАВР, несмотря на то, что трансляция в этой системе протекает в условиях, близких для проявления синергизма структурных элементов РНК, а именно в ЭЗП не было обнаружено достаточного количества инициаторных факторов для эффективной трансляции любых мРНК [Browning, 1988; 1990]. Кроме того, было убедительно показано, что мРНК-связывающие факторы инициации ЭЗП или функционально эквивалентны соответствующим факторам млекопитающих (elF4A) [Ш & Ren, 2000] или являются изоформами фактора elF4F млекопитающих (eIF4F и elF4B) [Abramson, 1988]. Исследование влияния фактора eIF4B из зародышей пшеницы на активность расплетания мРНК хеликазой eIF4A и на аффинитет связывания этим фактором АТФ и АДФ показало, что добавление в систему трансляции фактора eIF4B увеличивает эффективность связывания eIF4A с АТФ в 10 раз, тем самым увеличивая скорость гидролиза АТФ elF4A и эффективность расплетания мРНК инициаторным комплексом. В то же время, связывание АДФ остается на том же уровне, что и в отсутствие eIF4B (в отсутствие 4В хеликаза обладает большим сродством к АДФ) [Bi & Ren, 2000]. Также установлено, что eIF4F ( или eIFiso4F) и elF4B стабилизируют инициаторный комплекс факторов с мРНК [Hi & Ren, 2000]. Обнаружение непосредственного взаимодействия eIF4B в составе инициаторного комплекса с РАВР у растений [Le, 1997] дало возможность исследователям сделать вывод о том, что в растительных клетках (а, следовательно, в ЭЗП) механизм образования комплекса между факторами инициации, мРНК и РАВР (циркуляризация мРНК) отличается от такового в клетках грибов и животных [Gallie, 1989]. В растительных клетках в связывание с РАВР (поли(А)-хвостом мРНК) помимо eIF4G (eIFiso4G), по-видимому, вовлечен и elF4B, который через eIF3 и 408-субъединицу связан с мРНК (рис. 2). Вероятно, такая схема может предполагать либо некоторую независимость инициации от связывания кепа или существование в ЭЗП дополнительной возможности для эффективной трансляции некепированных мРНК.
Выделение бесклеточной системы трансляции из зародышей пшеницы (ЭЗП) и аналитический вариант трансляции в этой системе
Синтез и скрининг белковой библиотеки в бесклеточной системе трансляции требует от последней выполнения ряда условий, обеспечивающих воспроизводимые результаты, а также сохранность и доступность синтезированного материала в течение эксперимента. К числу таких условий можно отнести эффективную трансляцию гетерогенной по размеру и нуклеотидному составу РНК, низкий уровень неспецифической агрегации продуктов трансляции с компонентами трансляционной системы и малое содержание протеаз и РНКаз в системе.
К большому сожалению, перечисленные черты эукариотических систем бесклеточной трансляции ранее не были исследованы, поэтому использование ЭЗП в качестве "синтезатора" белковой библиотеки требовало экспериментального обоснования. С другой стороны, в настоящей работе ЭЗП была использована в качестве инструмента для синтеза белковой библиотеки. В связи с этим, в рамках данной главы представляется целесообразным, не останавливаясь на подробном обсуждении, изложить лишь основные результаты проведенных исследований, позволившие использовать ЭЗП для получения и скрининга нативной белковой библиотеки.
В экспериментах по оптимизации системы бесклеточной трансляции для синтеза белковой библиотеки в трансляцию вводили мРНК у-субъединицы цГТФ-зависимой фосфодиэстеразы из сетчатки быка (у-ФДЭ мРНК), интерлейкина 2 человека (ИЛ-2 мРНК), дигидрофолат редуктазы Е.соИ (ДГФР мРНК), энтеротоксина В Staphylococcus aureus (СЭТ мРНК) и мРНК родопсина из сетчатки быка. В таблицах 1 и 2 представлены некоторые характеристики этих мРНК и кодируемых ими белков.
Выбор этих мРНК не случаен. Набор различных по своим свойствам мРНК и соответствующих им белков (длина 5 -НТО и окружение стартового кодона мРНК; молекулярный вес, происхождение) позволяет моделировать синтез белковой библиотеки и оптимизировать ЭЗП для такого синтеза. При рассмотрении 5 -концевых нетраслируемых областей мРНК обращает на себя внимание тот факт, что контекст стартового кодона мРНК соответствует предложенному Kozak [Kozak, 1999; 1979; 1978] (CCACCATGG) только в случае мРНК СЭТ и родопсина (Таблица 2), что не мешает трансляции этих мРНК в ЭЗП с разной эффективностью (детально этот результат обсуждается в следующей главе). По видимому, влияние окружения стартового кодона не является определяющим для трансляции мРНК в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы.
Кроме перечисленных выше мРНК для исследования влияния терминаторного кодона на эффективность трансляции в ЭЗП использовали ДГФР мРНК, укороченную в 3 -конце кодирующей части на 45 оснований (ДГФР II мРНК). Для получения такой матрицы вектор, содержащий полноразмерный ген ДГФР гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Fsp І. В результате гидролиза получили три линейных фрагмента вектора, причем промотор sp6
РНК-полимеразы и укороченный на 45 оснований ген ДГФР содержались в одном фрагменте. Без дополнительного выделения продукты рестрикции служили матрицей для транскрипции "укороченного" варианта ДГФР мРНК. Кроме ДГФР II мРНК в трансляцию вводили мРНК, полученную из плазмидной ДНК отдельных клонов случайной пептидной библиотеки (случайный участок длиной 30 пар оснований), клонированной по сайтам BslX1 в одной рамке считывания с геном ДГФР, лишенном стоп-кодона. Плазмидная ДНК этих клонов была любезно предоставлена В.Ю. Алаховым (Supratek Pharma Inc., Канада). На рисунке 4 показаны генетические конструкции полноразмерной ДГФР, её Fsp /-рестрикта (рис.4А), клонов случайной пептидной библиотеки (рис.4Б), СЭТ (рис.4В), ИЛ-2 (рис.4Г) и соответствующие им sp6 - транскрипты. мРНК получены в реакциях транскрипции с использованием sp6 РНК-полимеразы. В качестве матриц служили Hind /Я-рестрикты плазмидных конструкций, несущих соответствующие гены. Ген СЭТ был клонирован из геномной ДНК Staphylococcus aureus в pSP65 по сайтам EcoR I и ВатН I под контроль sp6 РНК-полимеразы. Ген ИЛ-2 был переклонирован из плазмиды pAAl, любезно предоставленной профессором О.И. Киселёвым (Институт гриппа, г.Санкт-Петербург), в плазмиду pGEM2 по сайтам EcoR I и HindIII под контроль того же промотора. Векторы pSP65 и pGEM2 содержащие гены ДГФР, родопсина и у-ФДЭ под контролем промотора РНК-полимеразы фага sp6 были любезно предоставлены О.Курнасовым (Институт белка РАН, г. Пущино, Московской области) и Ю.Бондаренко (Филиал института биоорганической химии РАН, г. Пущино, Московской области).
Приготовление экстракта из зародышей пшеницы и аналитический вариант трансляции.
Для выполнения работы была выбрана система бесклеточной трансляции на основе экстракта из зародышей пшеницы (ЭЗП). Эффективность биосинтеза белка в этой системе в 2 раза ниже чем, в лизате ретикулоцитов кролика (ЛРК), но простота и воспроизводимость получения, а также низкий уровень РНКаз и протеаз (по сравнению с бактериальными системами бесклеточной трансляции) делает ЭЗП предпочтительней.
Из известных методов получения экстракта из зародышей пшеницы {Anderson, 1983; Erickson, 1983; March, 1986] был выбран вариант, описанный Морчем, поскольку в наших условиях он давал наиболее воспроизводимые результаты. В оригинальную методику были внесены два существенных изменения. Во-первых, была исключена обработка зародышей смесью СНСЬ : CCU ввиду того, что использованные нами зародыши содержали незначительное количество жирорастворимых веществ. Последние удавалось легко удалять из экстракта центрифугированием и гель-фильтрацией на Сефадексе G-25 в рамках оригинальной методики. Во-вторых, перед гель-фильтрацией экстракт обрабатывали фенилметансульфонил фторидом (ФМСФ), что снижало протеолитическую активность экстракта. Эффект такой обработки хорошо заметен на кинетических кривых трансляции ДГФР мРНК в обработанном (кривая 1) и необработанном ФМСФ лизате (кривая 2), представленных на рис.5. Очевидно, что уменьшение количества синтезированного продукта (включения радиоактивной аминокислоты в ТХУ-нерастворимую фракцию) после остановки биосинтеза ( 20-25 мин инкубации) связано именно с протеолитической активностью ЭЗП, причем эта активность подавлена в обработанном ФМСФ экстракте без ущерба для трансляции ДГФР мРНК (кривая 1, рис.5).
Известно, что условия трансляции в ЭЗП давно и подробно описаны, однако синтез и скрининг белковой библиотеки в этой системе требует сохранения мРНК и продукта её трансляции в неповрежденном виде, а такие требования делают необходимыми дополнительную оптимизацию и изучение ЭЗП.
Приведенные в таблице 3 оптимальные концентрации низкомолекулярных компонентов трансляционной системы отличаются от описанных в литературе [например Erickson, 1983] относительно низкими концентрациями креатинфосфата и аминокислот. Двукратное снижение концентрации этих компонентов не приводило в наших условиях к снижению продолжительности и эффективности синтеза белка.
Некоторые параметры системы трансляции определяются наличием на мРНК 5 концевых кепов. Кепы большинства эукариотических мРНК обеспечивают эффективную трансляцию и стабильность последних in vivo. Однако, «з анализа литературных данных следует, что наличие кепа на мРНК не является необходимым для её эффективной трансляции в ЭЗП и не оказывает существенного влияния на стабильность мРНК в этой системе [Gallic, 1995; Niepel, 1999]. Тем более, что модификация мРНК с использованием высоких концентраций кеп-предшественников и необходимость существенно снижать концентрацию ГТФ в системе делает процедуру "кепирования" / // vitro непрактичной, существенно ограничивая представительность "мРНК-версии" белковой библиотеки. В использованной системе трансляции оказалось более оправданным компенсировать снижение эффективности трансляции некепированной мРНК увеличением её концентрации до 80-100 мкг/мл трансляционной смеси.
Основным источником информации о трансляционной активности бесклеточных систем остается измерение включения радиоактивно-меченной аминокислоты в белковую фракцию системы (обычно используют [3Н]-, [14C]-Leu и [3 S]-Met). Зная количество радиоактивности в этой фракции легко рассчитать количество белка, синтезированного системой de novo. Именно такой подход был выбран для того, чтобы оценить продуктивность ЭЗП и влияние на трансляционную активность этой системы со стороны мРНК (контекст стартового кодона, 5 -НТО и З -НТО) и продуктов трансляции. В трансляцию вводили мРНК, перечисленные в таблице 2. На рисунке 6 приведены кинетические кривые трансляции этих мРНК в присутствии 1 мкКи [35S]-Met / 25 мкл трансляционной смеси (для СЭТ мРНК в присутствии 2 мкКи [3H]-Leu / 25 мкл трансляционной смеси). Как видно из данных рис. 6, продуктивность ЭЗП при трансляции различных мРНК варьирует в пределах от сотен пикограммов до нанограммов белка в I мкл трансляционной смеси. Такой продуктивности вполне достаточно для экспрессии в ЭЗП нативной белковой библиотеки, поскольку 25 мкл трансляционной смеси будут содержать по крайней мере 10 вариантов белковых молекул средней молекулярной массой 50 кДа (такое количество вариантов вполне перекрывает представительность нативных библиотек: например разнообразие белков обонятельной системы позвоночных [Lancet, 1993].
