Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
2.1 Характеристики бесклеточных систем трансляции 10
Бесклеточная система трансляции Е. coli 10
Проблема фолдинга 12
Лизат Ретикулоцитов Кролика RRL (rabbit reticulocyte lysate) 14
Система Экстракта Зародышей Пшеницы WGE (wheat germ extract) 18
Трансляционно-активные экстракты трипаносоматид 21
2.2 Бесклеточная трансляция в проточной системе 25
АТР-РЕГЕНЕРИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ 30
ПРИМЕНЕНИЕ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЫ 34
Включение модифицированных аминокислот 34
IN VITRO продукция мембранных белков 35
Продуктивность и автоматизация. Применение in vitro системы экспрессии в геномике и протеомике 38
Бесклеточная система трансляции используется для молекулярной эволюции 42
АКТИВНОСТЬ EIF2 ОПРЕДЕЛЯЕТ уровень трансляции in VIVO & IN VITRO.... 43
Сплайс-лидер в инициации трансляции У ТРИПАНОСОМАТИД 47
Использование anti-sence подхода для избирательного подавления трансляции 50
Инициация трансляции 52
Проблемы инициации трансляции эукариот 52
AUG контекст 59
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 63
3.1 Культивирование клеток Leishmania tarentolae 63
Поддержание культуры клетокЬ. tarentolae 63
Трансфекция Leishmania tarentolae 63
3.2 Выделение митохондрий и анализ целостности внешней
митохондриальной мембраны 64
Способы разрушения клеток 64
Процедура выделения митохондриальных фракций L. tarentolae 66
Приготовление препаратов клеток и митохондрий для флуоресцентной микроскопии 66
Измерение активности сукцинат-цитохром с дегидрогеназы и анализ целостности внешней митохондриальной мембраны 67
3.3 Получение экстракта L. tarentolae и трансляция 68
Процедура получения экстракта L. tarentolae 68
Обработка экстракта для подавления эндогенной трансляции 69
Постановка и проведение реакции in vitro трансляции 70
Получение суммарных гомологичных мРНК и mPHKL. tarentolae 70
Очистка EGFP и MALDI-TOF-macc спектроскопия 71
Поиск пре-AUG триплетов для I. major 72
3.6 Создание генноинженерных конструкций для геномной интеграции
72
Создание конструкций, содержащих ires-последовательность для геномной интеграции в тубулиновый локус Leishmania tarentolae 72
Создание плазмид с 64 вариантами npe-ATG триплетов для геномной интеграции в SSU-локус 75
Конструирование TET-R и DS-Red экспрессирующих плазмид 75
3.7 Создание конструкций для in vitro экспрессии 76
Конструкции содержащие IRES элемент в качестве 5 '-нетранслируемого участка 76
Конструкции содержащие комбинацию обелинового 5 '-лидера с 3'-нетранслируемым участком сателлита вируса некроза табака 77
Содание серии плазмид «ОКНА», содержащих дополнительный ATG в рамке с ОРС egfp, окруженный последовательностями полностью неструктурированных участков 79
3.7.4 Содание серии плазмид «ОКНА», содержащих дополнительный ATG в рамке с ОРС egfp, окруженный последовательностями полностью (5') и
частично (3') неструктурированных участков 81
3.8 Методы Молекулярной Биологии 83
Получение и трансформация компетентных клеток Е. coli 83
Выделение плазмиднойДНК 84
Расщепление ДНК эндонуклеазами 84
Обработка продуктов эндонуклеазного расщепления ДНК полимеразой фага Т4 для достройки выступающих концов до «тупых» 84
ЛигированиеДНК. 84
Секвенирование ДНК 85
ПЦР 85
Норзерн-гибридизация 85
Гибридизация по Вестерну 87
Анализ продуктов трансляции 88
Транскрипция in vitro 88
Определение устойчивости РНК к нуклеазам VI & ТІ 89
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 90
4.1 Оптимизация параметров получения клеточного экстракта 90
4.1.1 Поиск наиболее щадящего метода разрушения клеток L. tarentolae ...90
4.2 Трансляция в экстракте L. tarentolae (LtE) 96
Оценка способности экстракта L. tarentolae к эндогенной трансляционной активности и инициации трансляции на экзогенно-вводимой гомологичной РНК. 96
Применение антисмыслового олигонуклеотида к последовательности сплайс-лидера, для подавления трансляции SL-несущих РНК 99
Трансляция гетерологичных РНК в aSL-обработанном экстракте L. tarentolae 102
Сравнение эффективностей трансляции в LtE, после обработки aSL-олигонуклеотидом и микрококковой нуклеазой 105
4.3 Экспрессия /^-содержащих конструкций in vivo в составе генных
кассет, интегрированных в геном l. tarentolae 107
4.4 Создание оптимальных матриц для трансляции in vitro 111
Влияние неструктурированного 5'- UTR на эффективность трансляции РНК-матрицы 114
Трансляция РНК матриц, несущих оптимальный пре-А UG контекст и относительно легкоплавкий 3'-участок «окна», кодирующий гидрофильную лидерную последовательность 120
Сравнительный анализ степени структурных изменений, вызванных в РНК температурной денатурацией 124
Оптимизация триплета, предшествующего AUG 126
4.5 ВЫВОДЫ 132
БЛАГОДАРНОСТИ 134
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 137
ПРИЛОЖЕНИЕ 166
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
aprt- 5'-нетранслируемый участок гена аденин фосфорибозил-трансферазы
Ыа - ген Р-лактамазы (маркер устойчивости к ампициллину)
bleR - ген белка, связывающего флеомицин (маркер устойчивости к зеоцину)
сатВС - межгенный участок генов кальмодулина В и С.
CAT - chloramphenicol acetyl transferase, хлорамфеникол-ацетилтрансфераза
d - диаметр
DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole
DHFR - dihydrofolate reductase, дигидрофолатредуктаза
DIG - digoxigenin, дигоксигенин
DTT - дитиотрейтол
EDTA - этилендиаминтетраацетат
egfp - зеленый флуоресцентный белок
EGTA - ethyleneglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N'-tetraacetic acid этиленгликольтетраацетат
FISH - fluorescence in situ hybridization, флуоресцентная in situ гибридизация
GPI (GPtdlns) - Glycosil-Phosphatidyl Inositol anchor, гликозил фосфатидил инозитоловый «якорь»
HEPES - гидроксиэтилпиперазинэтансульфонат
Hyg - hygromycin, гигромицин
IR - intergenic region, межгенный участок
IRES - internal ribosome entry site, сайт внутреннего связывания рибосомы
kb-1000n.o.
Км- константа Михаэлиса
LRV - Leishmania RNA virus, РНК-содержащий вирус Leishmania
МНС I - главный комплекс гистосовместимости I
Neo - neomycine, неомицин
neoR - ген устойчивости к неомицину
NTC - nourseotricin
PBS - phosphate buffered saline, фосфатный буфер
PEG - полиэтиленгликоль
Ras - малая ГТФаза, участвующая в клеточной «сигнализации»
sat - ген устойчивости к NTC
SL - splice-leader, последовательность миниэкзона
SL - splice-leader, сплайс-лидер
SSU - small subunit loci, локус генов РНК малых рибосомных субъединиц
ТАЕ - Трис-ацетат
TED - translation enhancing domain, эйнхансер трансляции
TMV - вирус мозаики табака
ТпТ - сопряженная система транскрипции трансляции
TUB - тубулин / ОРС тубулина
VSG-variant surface glycoprotein, вариабельный белок поверхности клетки
aSL - антисмысловои олигонуклеотид к последовательности SL
а - атмосферы
В - вольты
кДа - килодальтоны
ККМ - критическая концентрация мицеллообразования
кл/мл - клеток в миллилитре
л-литр
мкл- микролитр
мкМ - концентрация (микромоль в литре)
мкм - микрометры
мКю - милликюри
мл - миллилитр
мМ - концентрация (миллимоль в литре)
мН - микрококковая нуклеаза
мс - миллисекунды
НА - influenza hemagglutinin, гемагглютинин вируса гриппа
нм - нанометры
нт - нуклеотидов
о.е. - оптические единицы
об. - объемные величины...
ОРС - открытая рамка считывания
п.о. - пар оснований
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Введение к работе
С завершением многочисленных проектов по секвенированию геномов разных организмов, изучение генной-экспрессии выходит на новый уровень структурно-функциональной характеристики кодируемых геномом белков. В силу огромного набора открытых рамок считывания, обнаруженных в процессе секвенировния, прогресс в анализе соответствующих полипептидов напрямую зависит от их высоко-эффективной наработки в достаточном количестве для структурного и функционального анализа.
В настоящее время используются три основные стратегии получения белков для исследований: химический синтез, in vivo экспрессия и in vitro экспрессия
Химический синтез не применим для синтеза длинных полипептидов. Несмотря на более чем тридцатилетнюю историю, универсальная система экспрессии эукариотических белков так и не была разработана. Технические ограничения связанные с необходимостью быстрой и продуктивной наработки белков для анализа вынудили исследователей вернуться к наиболее эффективной системе на основе Е. coli, однако лишь 15% эукариотических белков могли быть проэкспрессированы в своей функционально-активной форме.
Эукариотические системы экспрессии in vivo основанные на культуре клеток млекопитающих, насекомых, трансгенных растениях и животных имеют значительные ограничения: дороговизна, трудоемкость. Дешевая и относительно гибкая система на основе Saccharomyces cerevisiae характеризуется относительно низким выходом и отсутствием желаемого типа пост-трансляционных модификаций. Использование других дрожжевых представителей (Pichia pastoris) наталкивается на препятствия связанные с активацией системы отрицательной обратной связи при гиперпродукции белка. При создании новой эукариотической системы разумным могла бы быть замена РНК-полимеразы II менее контролируемыми и более эффективными односубъединичными фаговыми полимеразами Т7, SP6 и т.д. Однако в данном случае проблематичным представляется кэпирование РНК, так как фаговые полимеразы не обладают свойством сопряжения транскрипции и процессинга (Moteki and Price, 2002).
Бесклеточные системы дают возможность работать с широким спектром РНК-матриц, лишенных основных регуляторных модификаций. Из множества
прикладных задач in vitro система позволяет экспрессировать токсичные белки, включать модифицированные аминокислоты, вносить необходимые добавки для экспрессии мембранных и других труднорастворимых белков и селективно метить изотопами. Несмотря на видимую универсальность, бесклеточные системы имеют ряд ограничений: а) низкая эффективность экспрессии в йо/с/г-формате по сравнению с in vivo продукцией, b) дороговизна применения высокопродуктивной проточной системы, с) отсутствие универсальных регуляторних элементов (UTRs) для трансляции любых открытых рамок считывания в любой in vitro системе.
Наибольшее распространение получили системы на основе экстракта Е. coli, зародышей пшеницы (WGE) и лизата ретикулоцитов кролика (RRL) благодаря максимальному отношению выгодных свойств к стоимости получения белкового продукта. Под полезными свойствами понимают высокую эффективность синтеза белков в их функционально-активной форме, отсутствие эндогенного уровня трансляции.
Бесклеточная эукариотическая система трансляции на основе трипаносоматид могла бы обладать преимуществами по сравнению с вышеперечисленными системами благодаря нескольким факторам: а) легкой процедуре наработки клеточной биомассы и разрушения клеток Ь) присутствию идентичной 5'-концевой последовательности сплайс-лидера (SL) на всех зрелых РНК трипаносоматид, допускающей использование анти-SX олигонуклеотида для подавления фонового уровня трансляции.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Похожие диссертации на Бесклеточная система трансляции на основе представителя трипаносоматид Leishmania tarentolae. Создание оптимальной матрицы для трансляции in vitro
