Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 8
1.1 Современные представления о системе свертывания крови 8
1.1.1 Структура и функционирование системы гемостаза человека 8
1.1.2 Тромбоцитарпое звено гемостаза. 8
1.1.3 Плазменное звено гемостаза 10
1.1.4 Роль сосудистой стенки в гемостазе 15
1.2 Экспериментальные модели свертывания крови 16
1.3 Математические модели свертывания крови 21
1.3.1 Качественные и феноменологические модели 21
1.3.2 Количественные и механизмениые .модели 23
1.3.3 Учет диффузии и кровотока в моделях свертывания 28
1.4 Постановка задачи 30
ГЛАВА 2. Методы 31
2.1 Подходы, использованные для описания ферментативных реакций 31
2.1.1 Общая структура модели 31
2.1.2 Кинетика многосубстратных реакций с избытком фермента над субстратом.. 31
2.1.3 Математическое описание взаимодействия факторов свертывания с мембранами тромбоцитов 32
2.1.4 Вывод граничных условий для факторов, взаимодействующих с поверхностью ... 33
2.2 Численный метод и его программная реализация 34
2.3 Расчет коэффициентов корреляции и контроля 36
2.5 Экспериментальные методы и материалы исследования 37
2.5.1 Материалы 37
2.5.2 Эксперименты по связыванию факторов свертывания с фосфолипидными везикулами 38
2.5.3 Эксперименты по активации фактора X. 39
ГЛАВА 3. Построение модели 40
3.1 Построение моделей отдельных реакций системы свертывания 40
3.1.1 Ингибирование внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора 40
3.1.2 Активация фактора Xвнутренней теназой 45
3.2 Построение математической модели системы свертывания крови 46
3.2.1 Допущения и условия применимости гомогенной модели 46
3.2.2 Допущения и условия применимости простра)іственной модели 48
3.2.3 Построение модели и сравнение с экспериментом 49
ГЛАВА 4. Экспериментальное исследование механизма действия внутренней теназы 51
4.1 Связывание факторов VIII, VIIIA, IX и X с фосфолипидными везикулами 51
4.2 Роль комплекса VIII-X в активации фактора X внутренней теназой 56
ГЛАВА 5. Исследование модели 62
5.1 Сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям в системе свертывания 62
5.2 Анализ пороговых свойств системы свертывания 66
5.3 Анализ механизма терапевтического действия препарата novoseven 68
5.4 Сравнительный анализ вкладов внутреннего и внешнего пути свертывания в пространственную динамику формирования фибринового сгустка 69
5.5 исследование эффекта тромбомодулина на остановку роста фибринового сгустка 72
Глава 6. Обсуждение результатов 74
выводы 83
Список литературы 85
Список сокращений и обозначений 98
Приложение 1. Математическая модель свертывания 99
- Количественные и механизмениые .модели
- Вывод граничных условий для факторов, взаимодействующих с поверхностью
- Ингибирование внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора
- Сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям в системе свертывания
Введение к работе
Свертывание крови является одним из элементов системы гемостаза, функция которой заключается в предотвращении потери крови при повреждении сосудистой системы. Нарушение целостности стенки сосуда приводит к активации свертывания, сложнейшего процесса, в который вовлечено свыше пятидесяти белков, а также клетки крови и сосудистой стенки. Этот процесс приводит к локальному переходу крови из жидкого в гелеобразное состояние в районе повреждения и остановке кровотечения благодаря сформированному сгустку. Любой сдвиг в деликатном балансе свертывания крайне опасен для организма, угрожая либо повышенной кровоточивостью, либо тромбозом, что делает изучение свертывания одной из приоритетных задач биохимии, биофизики и медицины.
Исследования, проводившиеся на протяжении последних десятилетий, привели к качественному изменению представлений о свертывании крови. В настоящий момент можно довольно уверенно утверждать, что устройство этой системы сравнительно хорошо известно: в последний раз новые белки в свертывании были открыты в конце 80-х годов XX века, а последние реакции обнаружены в начале 90-х. Несмотря на напряженную работу тысяч лабораторий во всем мире, за последние десять лет новых участников в каскаде свертывания обнаружено не было. Однако, знание устройства системы не означает понимания ее функционирования и далеко не всегда помогает определить правильный способ скорректировать то или иное нарушение. Именно поэтому все больше и больше работ в последние годы посвящается изучению разнообразных экспериментальных in vitro, in vivo и ex vivo моделей свертывания с целью понять, как оно функционирует и как можно па него воздействовать.
В силу сложности этой системы, обусловленной огромным количеством белковых и клеточных участников, наличием диффузии и потока крови, математические модели являются крайне перспективным методом исследования функционирования гемостаза. Однако, существующие на настоящий момент математические модели большей частью не сравнивались с экспериментом и не включают многих существенных реакций. Далее, многие принципы устройства опубликованных моделей сильно устарели и сейчас нуждаются в уточнении, или даже были признаны неправильными.
Целью настоящей работы было построение новой количественной модели свертывания крови, способной успешно описать экспериментальные данные, и ее применение для изучения регуляции системы свертывания. В качестве объекта моделирования были выбраны две экспериментальные модели гемостаза. Первой моделью был тест генерации тромбина, в котором свертывание в плазме или в цельной крови активируется тканевым фактором (ТФ) и регистрируется изменение активности тромбина со временем. Второй моделируемой системой была разработанная в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН методика по исследованию пространственного формирования фибринового сгустка в тонком, неперемешиваемом слое рекальцифицированной плазмы при активации свертывания монослоем клеток, экспрессирующих ТФ. Первая модель была выбрана из-за того, что она является одним из самых эффективных и популярных методов, применяющихся как для фундаментальных исследований свертывания, так и для клинической диагностики. Чувствительность этой модели к различным изменениям в системе свертывания может быть исследована с помощью метода коэффициентов контроля в варианте, адаптированном для нестационарных систем. Вторая же экспериментальная постановка наиболее воспроизводимо и точно отображает пространственные аспекты свертывания, столь существенные in vivo, позволяя изучать роли как различных реакций, так и диффузии различных факторов в формирование сгустка.
В качестве наиболее актуального приложения модели было исследовано влияние на свертывание рекомбинантного активированного фактора VII и тромбомодулина. Первое из этих веществ успешно используется в терапии гемофилии и других геморрагических заболеваний свертывания (коммерческое название NovoSeven, Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), в то время как растворимый тромбомодулин (Solulin) сейчас предлагается использовать для лечения тромбозов. Однако, механизм действия обоих препаратов не вполне ясен, и прояснение его способно внести вклад в стратегию терапии, использующей эти препараты.
Цель работы: Разработка количественной математической модели свертывания крови для решения биохимических и клинических задач.
Задачи исследования:
Построить количественную математическую модель каскада свертывания крови и сравнить ее с существующими экспериментальными данными по динамике свертывания.
Провести сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям констант реакций и концентраций факторов свертывания крови.
Проанализировать роль внешнего и внутреннего пути свертывания в пространственной динамике роста фибринового сгустка,
Использовать предложенную математическую модель для анализа механизмов действия препаратов рекомбинантного фактора Vila (NovoSeven) и рекомбинантного растворимого тромбомодулина (Solulin).
Научная новизна. Предложен механизм действия ингибитора пути тканевого фактора, позволяющий объяснить ранее необъясненные наблюдения. Экспериментально показано, что фактор Villa связывает фактор X и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней тсназой. Построена новая оригинальная математическая модель свертывания крови, отвечающая современным биохимическим представлениям и успешно описывающая большой набор экспериментальных данных из литературы. В этой модели учтены такие важные реакции, как активация факторов X и IX активированным фактором VII п присутствии активированных тромбоцитов, тромбоцит-зависимая активация фактора XI тромбином, секреция тромбоцитов, регуляция комплекса внешней теназы и активированного фактора X ингибитором пути тканевого фактора, и многие другие, которые отсутствуют в ранее опубликованных моделях свертывания. С помощью модели проведен анализ чувствительности и информативности теста генерации тромбина. Показан неизвестный ранее различный механизм работы внутреннего и внешнего путей в фазе распространения свертывания: установлено, что активированный фактор X производится внутренней теназой, тогда как фактор IX активируется по внешнему пути и распространяется в пространстве путем диффузии. Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулина, подтвержденный экспериментально. Обнаружено, что вклад ТФ-зависимого и ТФ-независимого действия препарата NovoSeven в нормализацию свертывания в плазме больных гемофилией зависит от условий эксперимента, однако физиологическое формирование сгустка определяется преимущественно ТФ-независимым механизмом.
Научно-практическое значение. Полученные результаты по кинетике и регуляции реакций, катализируемых внутренней и внешней теназами могут иметь значение для клинических и биохимических исследований свертывания. Построенная модель может быть использована в качестве инструмента для планирования и анализа экспериментов по биохимии свертывания крови, а также для исследования механизмов действия препаратов, воздействующих на свертывание. Результатом исследования модели является вклад в понимание регуляции системы свертывания и механизмов . действия препаратов, направленных на коррекцию гемостаза, что может как иметь значение для экспериментальных исследований свертывания, так и дать базу для терапевтической стратегии при использовании этих препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
Показано экспериментально, что фактор Villa связывает фактор X на фосфолипидных мембранах и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней теназой.
Построена оригинальная математическая модель свертывания крови, активированного по внешнему пути, количественно описывающая процесс свертывания как в гомогенной, так и в пространственной экспериментальных постановках,
Доказано, что пространственный рост сгустка определяется выработкой активированного фактора X внутренней теназой, однако активированный фактор IX производится преимущественно по внешнему пути.
Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулииа, подтвержденный экспериментом.
Количественные и механизмениые .модели
Все перечисленные модели исследовали "абстрактные" системы уравнений, соответствующие схемам реакций, имеющим лишь отдаленное сходство с системой свертывания. В 1991 г. впервые была предложена количественная модель свертывания [68], в которой использовалась схема реакций, соответствующая биохимическим представлениям того времени, кинетические константы реакций были взяты из литературных данных, а результаты (кинетика тромбина и фактора Va) сопоставлялись с экспериментом. Объектом моделирования являлась рекальцифицированная дефибршшрованная плазма, в которую были добавлены фосфолипиды в качестве источника поверхности для реакций. Активация системы производилась по внешнему пути. Поскольку механизмы начальных реакций свертывания были изучены еще не очень хорошо, моделировался лишь участок каскада от образования фактора Ха до образования тромбина с учетом активации тромбином фактора V и протеина С. Экспериментально наблюдавшаяся кинетика фактора Ха была аппроксимирована функцией вида F(t) = A-1-exp(-af). Было показано, что такая система обладает порогом по концентрации фактора Ха (пороговое значение константы А было 1-10 пМ при а=1 мин ). При исследовании влияния констант реакций на порог по активации, было также показано, что скорости инактивации фактора Ха и протромбиназы сильнее влияют на это значение, чем скорости инактивации тромбина или активации протеина С.
Иной подход к вопросу был продемонстрирован в работе, принадлежащей группе K.G. Мапп [97]. Вместо того, чтобы моделировать кровь или плазму, чрезвычайно сложные системы, авторы попробовали детально и количественно описать события, происходящие в системе очищенных белков, включающей основные факторы свертывания — IX, X, V, VIII, II — в плазменных концентрациях, а также фосфолипиды и кальций. Ингибиторов в модели не было. Инициация производилась по внешнему пути добавлением пикомолярных концентраций комплекса VIIa-ТФ. Для расчетов использовались измеренные экспериментально константы реакций, некоторые из них варьировались, чтобы добиться согласия с результатами эксперимента. Все фермент-субстратные комплексы рассматривались как независимые переменные, для этого скорости их образования были введены в модель искусственно, а скорости диссоциации рассчитаны на основании известных констант Михаэлиса и каталитической. Кроме того, сравнение результатов с экспериментом потребовало от авторов введения искусственной деградации комплекса внутренней теназы, чтобы удержать его концентрацию на уровне не более 3 пМ.
Эта работа ставила перед собой чисто биохимические задачи. Основным результатом является утверждение, что рассмотренных в модели реакций достаточно для описания наблюдаемых в экспериментальной системе закономерностей. В некотором смысле, была подведена черта под представлениями об устройстве основного участка системы свертывания и последовательности событий, происходящих при активации. Кроме того, в работе было показано, что концентрация активатора сильнее влияет на задержку роста тромбина, чем на максимальную скорость, что фактор VIII и внутренний путь в целом становятся важными при малых концентрациях активатора и сильно влияют на кинетику системы после первых 40 сек процесса, что, наконец, фактор Ха и тромбин являются одинаково эффективными активаторами фактора V, но активация фактора VIII тромбином намного важнее, чем активация фактором Ха.
Впоследствии, та же группа опубликовала усовершенствованную модель подобной экспериментальной системы [98]. В нее уже были включены ингибиторы АТ-Ш и TFPI. Модель успешно описала экспериментальные данные, и продемонстрировала существование порога по концентрации ТФ, вызванного присутствием двух основных ингибиторов свертывания.
Оригинальная модель Jones и Mann [97] завоевала популярность и была использована впоследствии другими исследователями в прикладных целях. Она была незначительно модифицирована [99] в целях клинических исследований с тем, чтобы оценить эффект антитромботической терапии ингибиторами сери новых протеаз. Было показано, что существует хорошая корреляция между влиянием препарата на кинетику тромбина в модели и его влиянием на свертывание in vivo у крыс, которым вводили препарат. В качестве показателя состояния системы свертывания in vivo использовался тест АЧТВ. Также, эта модель была использована с модификациями в работе Nagashima [100] для исследования механизма терапевтического действия антитромботических препаратов аргатробапа и DX-9065а, которые являются ингибиторами тромбина и фактора Ха, соответственно. Была проанализирована разница в ингибировании генерации тромбина этими двумя ингибиторами: в то время, как аргатробан воздействовал на фазу генерации тромбина, DX-9065а воздействовал на время свертывания. Эти результаты были подтверждены экспериментами по генерации тромбина, выполненными в той же работе.
Наконец, с теоретической точки зрения, самое глубокое развитие идеи работы [97] нашли в недавнем исследовании канадской группы под руководством R. Gentry [101]. В этой работе были смоделированы все те же системы очищенных белков в присутствии фосфолипидов, однако теперь концентрация фосфолипидов присутствовала, как переменный параметр. Это потребовало серьезных изменений в уравнениях мембранно-зависимых реакций свертывания. Важно отметить, что модель тщательно сравнивалась с экспериментом. В качестве одного из основных результатов работы фигурировало пороговое поведение системы по концентрации фосфолипидов.
Возвращаясь к моделям, описывающим плазму крови, а не системы очищенных белков, следует выделить группу моделей, созданных для клинических тестов АЧТВ и ПВ. Первая такая работа [102] посвящена моделированию ПВ и рассматривает весь процесс свертывания по внешнему пути — от связывания тканевого фактора с фактором Vila до образования фибрина. Внутренняя теназа, фактор XI, протеин С в модели не учитывались. Это однако, нельзя считать серьезным недостатком, поскольку объектом моделирования был тест ПВ, Из клинической практики известно [61], что тест ПВ нечувствителен к колебаниям в концентрациях этих факторов. Неизвестные константы реакций были определены с помощью х2 аппроксимации результатов теста протромбинового времени для больных с различными дефицитами факторов свертывания. Модель была ориентирована на использование для интерпретации клинических данных.
Вторая модель теста ПВ была предложена четыре года спустя [103]. Как и в предыдущей работе, внутренний путь, путь протеина С н активация фактора XI тромбином не рассматривались. Реакции считались подчиняющимися кинетике Михаэлиса-Ментен, образование комплексов теназы и протромбиназы считалось необратимой реакцией, константы реакций были взяты из литературы. Были исследованы кинетика факторов свертывания и чувствительность теста к концентрациям их предшественников. Модель предсказала, что лишь сильные дефициты факторов ( 20%) могут быть обнаружены с помощью теста.
Две модели для теста АЧТВ были независимо предложены в 2001 году [104,105]. Одна из этих работ [104] (также принадлежащая лаборатории Ханина) занимается общей задачей моделирования этого теста, анализом кинетики факторов в процессе теста и его чувствительности к различным аномалиям. Другая работа [105] моделирует АЧТВ, чтобы оценить значения констант реакций автоактивации фактора XI и активации фактора XI тромбином и выяснить, какая из этих реакций существеннее. Сравнение результатов моделирования с результатами опытов в различных дефицитных плазмах привело авторов к заключению, что в данном тесте автокатализ фактора XI важнее, чем его активация тромбином.
Вывод граничных условий для факторов, взаимодействующих с поверхностью
Реагенты. Хромогенный субстрат S-2765 для фактора Ха был приобретен в Diapharma (West Chester, ОН). БСА и РРАСК были приобретены в Sigma (St. Louis, МО). ФС из бычьего мозга и ФХ из яичного желтка были приобретены в Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Все прочие реагенты были не менее чем аналитического уровня чистоты.
Белки. Человеческий фактор 1Ха и фактор с заингибированным активным сайтом IXa-EGR были приобретены в Haematologic Technologies (Essex Junction, VT). Человеческие факторы X и Ха были приобретены в Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). Человеческий a-тромбин был приобретен в Sigma. Активность тромбина определялась титровкой активных сайтов с помощью РРАСК [100]. Человеческий фактор VIII был очищен из терапевтического концентрата (Antihemophilic Factor, human, American Red Cross, Rockville, MD) по методу [132]. Активность фактора VIII (4000 ед/мг) определялась одношаговым клоттинговым тестом; активность 1 ед/мл считалась эквивалентной 0.7 нМ активного кофактора [133]. Белки хранились при -80 С в аликвотах 5-Ю мкл и размораживались непосредственно перед использованием. Факторы VIII, IXa-EGR, X были помечены флуоресцеином с использованием FluoReporter Fluorescein-EX Protein Labeling Kit (Molecular Probes, Eugene, OR). Степень мечения определялась по поглощению при 280 и 494 им.
Фосфолгтидные везикулы. ФС и ФХ смешивались в хлороформе в молярной пропорции 25:75 (если не указано иное) и высушивались под азотом иа протяжении 30 мин. Для экспериментов по связыванию добавлялась липофильный флуоресцентный краситель DiIC16(3) (Molecular Probes) в этиловом спирте в концентрации 0.2% v/v. Затем линиды ресуспендировались в 150 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, рН 7.4 (буфер А) на вортексе в течение 30 мин. Полностью гидратированные образцы подвергались экструзии путем 11 экструзионных циклов через мембраны с размером пор 0.1 или 0.8 мкм с использованием мини-эксгрудера (Avanti Polar Lipids) нагретого до 70С. Липосомы хранились при +4СС и использовались в течение 4 дней после изготовления. Для экспериментов по связыванию и кинетике использовались везикулы размером 0.8 мкм и 0.1 мкм, соответственно, если не указано иное.
Меченные флуоресцеином факторы сыертывания инкубировались с фосфолипидными везикулами в 150 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 0.4 мМ NaH2P04, 20 мМ HEPES, 5 тМ глюкозы, 0.5% БСА (буфер Б) в присутствии СаС12 (2.5 мМ) при 37С на протяжении 15 мин, если не указано иное. Контрольные эксперименты подтвердили, что этот период был достаточен для достижения насыщения. При исследовании связывания фактора Villa, фактор VIII активировался тромбином (1 нМ) на протяжении 1 мин перед инкубированием с везикулами, и затем тромбин ингибировался добавлением РРАСК в концентрации 1 мкМ. Образцы быстро разводились в 10 раз буфером В, содержащим 2.5 мМ CaCli, и немедленно подвергались анализу на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) на протяжении 10 с. Везикулы идентифицировались по флуоресценции DiIC16(3) в канале FL2. Примерно 1000 РЬ2-положительных событий регистрировалось в каждом эксперименте. Связанный фактор определялся по флуоресценции везикул в канале FL1. Интенсивность флуоресценции пересчитывалась в среднее число молекул на везикулу с использованием калибровочной кривой, приготовленной по Quantum Fluorescent Microbead Standard for fluorescein (Sigma). Контрольные эксперименты подтвердили, что за время разведения образца и анализа диссоциация белка с везикул не превышала 5%,
Все эксперименты проводились не менее чем трижды, если не указано иное, и репрезентативные эксперименты показаны на рисунках. Для определения равновесных констант связывания и констант активации фактора X соответствующие кривые для независимых экспериментов аппроксимировались стандартной гиперболой с использованием нелинейного метода наименьших квадратов. Чтобы определить количество вновь сформированных дополнительных сайтов связывания, например, сайтов, предоставленных для фактора 1Ха фактором VIII, мы вычитали кривую связывания для фактора 1Ха из кривой связывания для фактора ІХа в присутствии фактора VIII. Этот метод не принимает во внимание возможной конкуренции между ІХа и VIII за сайты связывания на фосфолипидах. Чтобы избежать вызванных этим погрешностей, мы использовали только ту часть кривых связывания, где вычтенное связывание фактора ІХа не превосходило полученного специфичного связывания.
Эксперименты проводились в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Фосфолипиды, факторы IXa и VIII инкубировались в буфере Б в различных комбинациях в присутствии 2.5 мМ CaCl при 37С. После активации фактора VIII тромбином (конечная концентрация 1 нМ) на протяжении 1 минуты, реакция запускалась добавлением фактора X. Реакция останавливалась спустя 2 мин добавлением EDTA в буфере Л (конечная концентрация 10 мМ). Наработанный фактор Ха определялся по скорости расщепления хромогенного субстрата S-2765 (конечная концентрация 0.3 мМ). Скорость гидролиза субстрата определялась по поглощению при 405 нм с использованием микропланшетного ридера Tecan GENios Pro (Tecan U.S., Durham, NC) в кинетическом режиме и пересчитывалась в концентрацию фактора Ха с использованием калибровочной кривой, приготовленной с помощью стандартного раствора фактора Ха. Контрольные эксперименты показали, что вклад тромбина, использоавшегося для активации фактора VIII, в гидролиз S-2765 был пренебрежимо мал (данные не показаны).
При анализе литературы с целью построения математической модели каскада свертывания было обнаружено, что для ряда реакций каскада ранее не предлагалось математического описания и механизмы их неизвестны. По этой причине первым шагом в построении большой модели была разработка моделей этих реакций как будущих составных частей модели свертывания.
Как описано в Главе 1, TFPI принадлежит к семейству ингибиторов типа Куница. Свободный TFPI связывает Vila медленно и слабо по сравнению с фактором Ха [15, 8]. Однако, комплекс XaFPI способен хорошо связывать VIIa-ТФ, формируя ингибиторный комплекс XaFPI-VIIa-ТФ [48]. Поэтому изначально был предложен двухшаговый механизм действия TFPI (Рис. 4А): TFPI сначала связывает Ха, затем комплекс XaFPI связывает VIIa-ТФ, полностью ингибируя его активность.
Ингибирование внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора
Равновесное связывание факторов. Чтобы изучить взаимодействие компонентов фактор Х-активирующего комплекса на фосфолипидной мембране, мы исследовали связывания меченных флуоресцеином факторов VIII, Villa, IXa-EGR и X (в различных комбинациях с немеченными факторами) с фосфолипидными везикулами, используя проточную цитометрию. Характерные кривые связывания представлены на Рис. 8, и средние параметры связывания, рассчитанные для трех независимых экспериментов, представлены в Таблице 1. Фактор VIII связывался с 32700±5000 сайтами на везикулу с наблюдаемой Kcj=76±23 нМ, активный кофатор имел блихкие параметры. Следует отметить, что в условиях наших экспериментов концентрация сайтов связывания (которая может быть оценена как 50-100 нМ при 5 мкМ фосфолипидов) может значительно превышать концентрацию лиганда. В таких условиях, простая модель связывания по-прежнему может использоваться, однако, полученные значения констант диссоциации будут наблюдаемыми константами, равными сумме истинных констант и концентраций сайтов связывания для соответствующих факторов. Поэтому, наблюдаемая константа 76 нМ для фактора VIII не противоречит значениям истинной константы 5-10 нМ сообщавшимся ранее [142]. Связывание фактора VIII не менялось в присутствии небольших концентраций факторов IXa-EGR и X. Напротив, как очевидно из кривых связывания, аффинность фактора IXa-EGR значительно возрастала в пристуствии факторов VIII и X, хотя максимальное связывание уменьшалось. Кривые связывания для IXa-EGR в присутствии фактора VIII или X не могли быть аппроксимированы односайтовой моделью связывания. По этой причине, для характеризации фактор VIII- или Х-зависимого связывания фактора IXa-EGR, мы вычитали связывание IXa-EGR в отсутствие факторов VIII или X из полного связывания, как описано в "Материалах и Методах". Аппроксимация показала, что факторы VIII и X индуцируют 1810±370 и 541 ±67 высокоаффинных сайтов для 1Ха, соответственно, а их комбинация индуцирует 4410±580 сайтов (Таблица 2). Связывание фактора X не зависело от IXa-EGR, тогда как VIII и Villa увеличивали как аффинность, так и максимальное связывание. Фактор Vlll (Villa) в концентрации 10 нМ индуцировал 12630±690 (11700±3300) высокоаффинных сайтов для фактора XcKj 14±4 нМ (1б.0±0.4 нМ).
Эти параметры описывают специфическое связывание и определялись вычитанием кривых неспецифического связывания из кривых полного связывания. Чтобы далее охарактеризовать взаимодействие факторов на фосфолипидной поверхности, мы провели параллельные титровки факторов VIII, Villa, IXa-EGR, и fX. На Рис. 9 связывание меченных флуоресцеином факторов IXa-EGR (панели А-В) и X (панель Г) дано как функция немеченного фактора VIII (панели А и Г), Villa (панель Б) или X (панель В) связанного с везикулами. Концентрация связанного немеченного фактора определялась в параллельном эксперименте с меченным фактором, с использованием того предположения, что, на основании предыдущего эксперимента (Рис. 7), связывание фактора VIII(a) не изменяется в присутствии IXa-EGR и X, а связывание фактора X не изменяется в присутствии 1Ха. Непрерывное увеличение связывания факторов IXa-EGR и X в присутствии увеличивающихся концентраций фактора VIII показывает формирование комплексов ГХа-VIII и X-VIII на фосфолипидной мембране. Положительный эффект фактора X на связывание IXa-EGR также наблюдается при низких концентрациях IXa-EGR и X. При более высоких концентрациях наблюдается ингибирование, предполагающее вытеснение фактора IXa-EGR с фосфолипидной мембраны фактором X, Таким образом, результаты по равновесному связыванию показывают формирование бинарных комплексов IXa-VIII и X-VIII на фосфолипидной поверхности, и, в меньшей степени, формирование комплекса 1Ха-Х.
Влияние фактора VIII па кинетику связывания фактора X с фосфолипидами. Важным наблюдением экспериментов по равновесному связыванию был факт, что факторы VIII и Villa связывают фактор X со столь же высокой аффинностью, что и аффинность взаимодействия VIII(VIIIa)-IXa, предполагая, что комплекс VIII(a)-X активно формируется по ходу активации фактора X. Чтобы проверить, является ли формирование этого комплекса кинетически эффективным, ассоциация фактора X с фосфолипидными везикулами исследовалась при возрастающих концентрациях фактора X в отсутствие или в присутствие 20 нМ фактора VIII (Рис. 10). Аппроксимация экспериментальных данных убывающей экспонентой с помощью нелинейного метода наименьших квадратов (что соответствует реакции псевдопервого порядка) привело к кинетическим параметрам ассоциации/диссоциации „=0.017±0.007 НГУГ МИН"1 и fo=1.50±0.22 мин"1 для фактора X (п=3). В присутствии фактора VIII эти параметры изменились на ДЮ.026±0.012 нМ мин" и ,/=0.55±0.04 мин (п=3), показывая 1.5-кратное увеличение скорости ассоциации и 3-кратное уменьшение скорости диссоциации. Средние значения этих констант дали К =\ 18±33 нМ в отсутствие и 32±14 нМ в присутствии фактора VIII, в согласии со значениями, полученными в равновесных опытах (Таблица 2).
Эксперименты по равновесному связыванию продемонстрировали формирование высокоаффиршого комплекса межд факторами VHI(a) и X, а кинетические эксперименты показали, что этот процесс является быстрым. Вслед за этим, мы попытались изучить роль этого комплекса в сборке фактор Х-активирующего комплекса и в активации фактора X. Рис. 11 показывает активацию фактора X при разных концентрациях фактора X и фосфолипидов. Скорость активации фактора X изначально возрастала с увеличением концентрации фосфолипидов, а затем убывала, с плато в области концентраций 10-100 мкМ. При низких концентрациях липидов максимальная скорость реакции увеличивалась линейно, достигая плато при -10 цМ, в то время как константа Михаэлиса линейно росла в области 0.5-1000 мкМ. Для последующих экспериментов, мы выбрали концентрацию фосфолипидов 10 мкМ, предполагая, что при этой концентрации максимальная скорость достигает стационарного значения (оптимальное связывание факторов), но эффекты ингибирования избытком поверхности еще не наблюдаются.
Сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям в системе свертывания
Сложная регуляция системы свертывания крови делает математическое моделирование многообещающим инструментом в ее анализе. В этой работе мы разработали новую модель свертывания крови, проверенную сравнением с экспериментом на каждом из этапов разработки. Эта модель отвечает современным представлениям о биохимии свертывания, включая множество реакций, не учтенных в предыдущих моделях: ТФ-независимая активация факторов IX и X фактором Vila в присутствии фосфолипидов, зависящая от тромбоцитов активация фактора XI фактором Па, регуляция факторов Va и Villa протеином S, ингибирование комплекса ТФ-VIIa-Xa при участии TFPI, сборка комплексов теназы и протромбиназы на липопротеинах и микровезикулах из тромбоцитов, секреция фактора V и PN2 тромбоцитами, ингибирование фактора Х1а при участии PN2, отдельно учтенное ингибирование а2-макроглобулином, а;-антитрипсином, аг-антиплазмином, кофактором гепарина II, ингибитором протеина С, С1-ингибитором, и другие реакции. Кроме того, были кардинально пересмотрены и исправлены механизмы и кинетика других реакций, в частности, связывание всех факторов с тромбоцитами и механизмы всех мембранно-зависимых реакций. Эти особенности придают модели широкий круг возможных приложений и делают ее удобным инструментом в исследованиях свертывания.
Экспериментальные исследования активации фактора X внутренней теназой. Основной задачей этого раздела было изучение механизма сборки фактор Х-активирующего комплекса на фосфолипидной мембране в процессе активации фактора X внутренней теназой, с целью последующего построения математической модели функционирования этого комплекса. Конкретно, были проанализированы две задачи. Первой задачей был порядок сборки фактор Х-активирующего комплекса. Всего может быть семь возможных путей сборки тернарного комплекса, в зависимости от существующих промежуточных бинарных комплексов. Взаимодействие факторов Villa и X изучалось твердофазном тесте, но не в растворе и не на фосфолипидных мембранах [31].
Другой неразрешенной проблемой является роль фосфолипидной мембраны в доставке фактора X к активирующему комплексу. Существуют два принципиальных механизма доставки субстрата в мембранно-зависимой реакции: субстрат может либо напрямую связывать фермент из раствора (модель свободного субстрата), либо сначала связывать мембрану и затем взаимодействовать с ферментом путем двухмерной диффузии (модель связанного субстрата). Предыдущие исследования противоречат друг другу в вопросе механизма доставки субстрата в реакциях, катализируемых гомологичными комплексами теназы и протромбиназы. В то время, как ряд ранних работ предположил, что в этих реакциях работает модель связанного субстрата [17,30], другие считали, что поведение этих систем более соответствует модели свободного субстрата [143].
В настоящей работе, мы систематически исследовали равновесное связывание компонентов внутреннего фактор Х-активирующего комплекса в различных комбинациях, чтобы описать формирование бинарных комплексов, и затем проанализировали эффект этих комплексов в регуляции связывания и активации фактора X, Эксперименты по связыванию (Рис. 8) показали, что формируются все три возможных бинарных комплекса, но наиболее значительно формирование IXa-VIII(a) и VIII(a)-X. Наши эксперименты предполагают, что факторы с высокой аффинностью, Villa и X, особенно фактор Villa, служат "якорями" для связывания факторов с более низкой аффинностью, предоставляя высокоаффинные места связывания (10-20 нМ) на фосфолипидной мембране. Это заключение было далее подтверждено в экспериментах по параллельной титровке факторов (Рис. 9). На основании этих данных мы предположили что фактор Villa служит "якорем" для факторов 1Ха и X. Хотя такая функция фактора Villa ранее предполагалась для фактора 1Ха [145], предположений о подобной роли для фактора X не было.
Затем, мы продемонстрировали, что формирование комплекса VIIIa-Х существенно для функционирования внутренней теназы; это было выполнено путем сравнения фактор VHIa-зависимого связывания фактора X с фосфолипидными везикулами и скорости активации фактора X (Рис. 12). Это было подтверждено определением зависимости наблюдаемой Км активации фактора X от концентрации фактора Villa. Фактор Villa присутствовал в большом молярном избытке (70-500-кратном) по сравнению как с фактором 1Ха, так и с константой их связывания, гарантируя, что весь фактор 1Ха находится в комплексе с фактором Villa. Полученная функция была линейной, с наклоном 1.00±0.12 и начальной (внутренней) Км, равной 8.0±1.5 нМ, что согласуется с гипотезой о регуляции активации фактора X формированием комплекса VIIIа-Х. Наиболее вероятным механизмом такой регуляции представляется доставка фактора X к мембране. Скорость ассоциации фактора X с липидами была выше в присутствии фактора VIII. Используя параллельную титровку концентраций фактора X, фосфолипидов, содержания ФС, мы показали, что при высоких концентрациях фактора Villa система следует механизму свободного субстрата (Рис. 13).
Эти данные позволяют объяснить расхождение предыдущих работ по поводу механизмов доставки субстрата. Во-первых, необходимо рассматривать не только связывание фактора X с комплексом IXa-Villa, но и связывание с фактором Villa на мембране. Во-вторых, предпочтительный путь доставки фактора X может зависеть от условий эксперимента, а именно от концентрации фактора Villa. Подводя итог, результаты данного исследования проясняют роль комплекса VIIIa-Х в сборке фактор Х-активирующего комплекса. Ранее, фактору Villa приписывались две фундаментальные функции в активации фактора X: увеличение каталитической константы реакции и увеличение количества фермента на мембране. Наши данные показывают, что, в дополнение к этим функциям, фактор Villa выполняет функцию увеличения фосфолипид-связанного субстрата (Рис. 14), Порученные данные позволили построить математическую модель внутренней теназы (раздел 3.1.2), которая затем была использована при построении модели каскада свертывания.
Регуляция генерации тромбина. В качестве базовых экспериментальных систем для нашей модели были выбраны тест генерации тромбина и пространственный рост фибринового сгустка. Для исследований регуляции теста генерации тромбина были проведены следующие вычисления: I) определение репрезентативных характеристических показателей свертывания (время свертывания, максимум тромбина и т.д.), анализ их независимости и чувствительности; 2) определение наиболее влиятельных, контролирующих, реакций и веществ в системе; 3) изучение порогового поведения.
Чтобы проанализировать поведение системы, использовались несколько параметров, которые были ранее предложены в экспериментальных работах для характеризации свертывания. В качестве первого шага, их независимость и чувствительность была проверена с помощью корреляционного анализа (Таблицы 3-5). Все параметры разделялись на две группы, в пределах которых они коррелировали: 1) flot, /,ag, /шач; 2)vma\ P[la, //о". Это согласуется с экспериментальными наблюдениями, показывающими эквивалентность /с1 " и /lag [69], корреляцию Р11 и 11атзх [63]. Тем не менее, такой анализ для всех параметров ранее не проводился.
Параметры первой группы были чувствительны к изменениям в константах реакций инициации. Напротив, параметры второй группы были, в основном, независимы от этих изменений, но были чувствительны к константам реакций амплификации свертывания (петли обратных связей, в т.ч. факторы IXa, Villa, XIa). Чувствительность параметров в пределах групп была одинаковой, за исключением fmax, изменения которого были вдвое меньше, чем у /с ct и іts(Таблицы 3,4).
