Введение к работе
Актуальность темы исследования. ДНК-топоизомераза I типа (топо I) -один из важнейших ферментов метаболизма нуклеиновых кислот, необходимый для нормального протекания в клетке основных генетических процессов. Данный фермент играет ключевую роль в контроле топологического состояния молекулы ДНК, регулируя степень ее суперспирализации путем введения разрыва в одну из цепей нуклеиновой кислоты. Установлено, что ДНК-топоизомераза I может участвовать также в регуляции экспрессии генетической информации, влияя на активность генов посредством изменения топологического состояния соответствующих регуляторных областей. В последние годы наблюдается резкое возрастание интереса к ДНК-топоизомеразам, связанное в первую очередь с идентификацией этих ферментов в качестве первичных мишеней для ряда соединений с противоопухолевым действием. Растительные топо I охарактеризованы в значительно меньшей степени. Мало известно об участии этих ферментов в росте и делении растительных клеток. Неизвестно также, действуют ли ингибиторы топо I, подавляющие рост животных опухолей, сходным образом в отношении процессов неоплазии у растений. В этой связи свойства и механизм действия ДНК-топоизомераз растительного происхождения требуют своего детального исследования.
Большинство исследований топо I производилось на ферментах ядерной локализации. Поскольку растительный геном состоит из трех частично независимых генетических систем, представляется необходимым исследовать ферментативный аппарат, регулирующий функционирование каждой из них. Уже получены данные, свидетельствующие о существовании в хлоропластах топои-зомераз прокариотического типа, что рассматривается как аргумент в пользу эндосимбиотического происхождения этих органелл. В то же время топоизомераза растительных митохондрий изучена недостаточно. На данный момент совершенно неисследованными остаются вопросы участия фермента в митохонд-риальной транскрипции и репликации, а также о возможных путях регуляции его активности in organelle.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение свойств и возможной физиологической роли ДНК-топоизомеразы I ядерной и митохондриальной локализации растений нескольких видов (Zea mays, Scorzon-era hispanica, Daucus carota) на уровне очищенного фермента, изолированных органелл и целых растительных клеток.
В рамках работы были поставлены следующие задачи:
- осуществить выделение и очистку до гомогенности ДНК-топоизомеразы I из ядер и митохондрий кукурузы;
произвести сравнительную характеристику биохимических свойств ферментов ядерной и митохондриальной локализации;
изучить влияние соединений, известных как ингибиторы ДНК-топо-изомеразы І в животных клетках, на релаксирующую активность растительных ферментов различной клеточной локализации и на ростовые характеристики культур клеток растений;
- исследовать возможные пути регуляции активности ДНК-топо-
изомеразы I в растительных органеллах, в частности влияние на фермент ре-
докс-условий.
Научная новизна. Впервые проведено исследование биохимических свойств митохондриальной и ядерной ДНК-топоизомеразы I кукурузы, продемонстрировавшее существование четких различий между данными ферментами. Показано, что топо I митохондрий проявляет иной характер зависимости активности от дивалентных катионов, полиаминов и рН среды, а также обладает отличиями в сродстве к одноцепочечной ДНК.
Продемонстрирован эффект соединений, ингибирующих топоизомеразы животного происхождения, на активность ядерного и митохондриального фермента из клеток Zea mays и Scorzonera hispanica. Впервые обнаружен чрезвычайно высокий уровень подавления роста суспензионной культуры ауксин-независимых клеток Scorzonera hispanica камптотецином -ингибитором топо I, обладающим значительной противоопухолевой активностью в животных клетках. Зафиксировано возрастание активности ядерной и митохондриальной топо І в клетках суспензионной культуры Daucus carota в условиях их активной пролиферации.
Показано, что митохондриапьная ДНК-топоизомераза I обладает четко выраженной зависимостью от редокс-состояния митохондрий, проявляющейся в активации фермента в восстанавливающих условиях и ее подавлении в условиях окисления. Совокупность полученных данных об изменении активности топо I под влиянием редокс-системы глутатиона указывает на вероятное участие этого фермента в редокс-контроле генетических функций в митохондриях.
Теоретическая и практическая значимость работы. Установлено, что такой важный фермент нуклеинового обмена как топо І в генетической системе растительных митохондрий проявляет свойства редокс-чувствительного фермента. Полученные данные о модуляции активности топо I под воздействием биотиола глутатиона открывают новые возможности для изучения механизмов регуляции генетических процессов в органеллах растений in vivo с позиций существования редокс-контроля экспрессии митохондриальных генов.
Результаты экспериментов, проведенных на суспензионных культурах клеток корончатого галла Scorzonera hispanica, демонстрируют возможность
использования культур растительных клеток в качестве системы для скрининга ингибиторов топо I.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Ежегодном симпозиуме "Physical-chemical basis of plant physiology", (Пенза, 1996), на Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999), на Всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999), на международной рабочей конференции по проекту ИНТАС N 97-0522 (Реймс, Франция, 1999), а также на 1-ой Российской электронной конференции по биоинформатике "RECOB-2000".
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатных работах. Одна работа находится в печати.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 180 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 132 страницах, содержит 25 рисунков и 8 таблиц.
