Исследование свойств ДНК-полимераз из эмбрионов морского вида ежа Sirongylocentrotus Intermedius Терентьев Леонид Леонидович

Содержание к диссертации

стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
Классификация оукариотических ДНК-полимераз 8
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА (X 9
Молекулярный вес ДНК-полимеразы ос 10
Ферментативные свойства ДНК-полимеразыс^ 12
Использование различных матриц ДНК-поли
мера зой (X 13
Последовательность взаимодействия ДНК-
полимера зы (X о субстратами 17
Процессивность ДНК-полимеразы 0^ 17
Внутриклеточная локализация ДНК-полиме
ра зы (X 19
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА J3 21
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА J 25
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА 8 29
РОЛЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ В РЕПЛИКАЦИИ ДНК 30
РОЛЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ В РЕПАРАЦИИ ДНК 36
БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ f 38
ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ МОРСКОГО ЕЖА 40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ hh
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ kh
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 59
Глава I. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРА ДНК-ПОЛИМЕРАЗ В

СУММАРНОМ БЕЛКОВОМ ПРЕПАРАТЕ 59
Глава II.ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДНК-ПОЛИМЕРАЗ

ИЗ ЭМБРИОНОВ МОРСКОГО ЕЖА 64

Выделение ДНК-полимеразы ос 64

Выделение ДНК-полимеразы J5 67
Характеристика физико-химических свойств

ДНК-полимераз 70

Глава III.МАТРИЧНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ 89
Глава ІУ. ПРОШССИВНОСТЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ ИЗ ЭМБРИОНОВ

МОРСКОГО ЕЖА 100

Глава У. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЗАПОЛНЕНИЯ ОДНО ЦЕПОЧЕЧНОГО

ПРОБЕЛА В ДНК МАТРИЦЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ

МОРСКОГО ЕЖА 105

ОБСУВДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ НО

КРАТКИЕ БНВОДН 123

СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ 125

_. 4 -

В диссертации приняты следующие сокращения:

~ 5 -

Введение к работе

Исследование биосинтеза ДНК в клетках эукариот является одной из центральных проблем молекулярной биологии. Согласно современным представлениям, синтез ДНК - сложный и многостадийный процесс, осуществляемый мультиферментным комплексом, состоящим из непосредственно ДНК-полимераз и ряда белковых факторов, выполняющих регуляторную функцию.

ДНК-полимеразы - ферменты, катализирующие рост цепи ДНК, были найдены в экстрактах всех клеток, где был обнаружен синтез ДНК. В настоящее время препараты высокоочищенных ДНК-полимераз получены из дрожжей, клеток беспозвоночных и млекопитающих. В соответствии с основными физико-химическими свойствами: молекулярным весом, изоэлектрической точкой, чувствительностью к сульф-гидрильным реагентам, а также матричной специфичностью, эти ферменты разделены на три класса - ДНК-полимеразы оі, 3 и f*

Несмотря на значительное количество работ, посвященных ДНК-синтезирующим ферментам, большинство исследователей ограничивается констатацией некоторых свойств ДНК-полимераз, необходимых для отнесения ферментов к соответствующему классу. В то же время, наряду с исследованиями физико-химических свойств ДНК-полимераз, значительный интерес представляет молекулярный механизм синтеза ДНК, осуществляемого ДНК-полимеразами, в частности, характер копирования матрицы, процесс взаимодействия ДНК-синтези-рующих ферментов с отдельными участками матрицы-затравки и т.д. Именно эти проблемы определили задачи данной работы, которые были сформулированы следующим образом:

I. Выделить из клеток эмбрионов морского ежа Strongylocen-trotus intermedius две ДНК-полимеразы, исследовать их основные - б - физико-химические свойства и, в соответствии с общепринятой номенклатурой, классифицировать их.

Изучить отдельные этапы взаимодействия выделенных ДНК-полимераз с различными участками матрицы-затравки.

Определить характер копирования матрицы и вычислить значение процессивности для обеих ДНК-полимераз.

Исследовать эффективность заполнения одноцепочечного пробела в матрице-затравке в процессе инкубации с ДНК-полимера-зой oL, J5 и при совместном синтезе, осуществляемом обеими ДНК-полимера зами.

На первом этапе работы в клетках эмбрионов морского ежа S.intermedius было обнаружено присутствие двух ДНК-полимераз: ОС и /3. Ферменты были очищены, исследованы их основные физико-химические свойства и матричная специфичность. Было показано, что максимальная активность ДНК-полимеразы оС проявляется при использовании в качестве матрицы-затравки ДНК, предварительно прогидролизованной панкреатической ДНКазой до появления ~>2.% кислоторастворимых продуктов. Максимальная активность ДНК-полимеразы /3 с матрицей-затравкой ДНК наблюдалась при гидролизе ДНК на 6-8$. ДНК-полимера за 0 была способна т"акже копировать двухцепочечную кольцевую ДНК, содержащую одноцепочечные разрывы.

Результаты исследования взаимодействия выделенных ДНК-по-лимераз с различными участками матрицы-затравки показали, что ДНК-полимераза ОС может независимо связываться с 3 ОН концом затравки и одноцепочечным фрагментом матрицы. ДНК-полимераза 3 взаимодействует только с У- концом затравки, гидроксильным или фосфатным.

ДНК-полимераза о(. копирует матрицу-затравку умеренно про- _ 7 ~ цессивно и не способна заполнять одноцепочечный пробел до конца. ДНК-полимераза В осуществляет синтез ДНК дистрибутивным путём и полимеризует брешь в цепи ДНК полностью. При совместной инкубации ДНК-полимераз происходит полная застройка предшественниками одноцепочечного пробела в ДНК. Скорость заполнения бреши при этом существенно выше, чем в случае одной ДНК-поли-меразы В .

На основании полученных данных предполагается, что различия в механизме синтеза ДНК у ДНК-полимераз оС и В обусловлены функциональной ролью этих ферментов. Сравнительный анализ полученных результатов с литературными данными даёт основание предполагать наличие сходства в организации ферментного аппарата, синтеза ДНК в клетках эукариот.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ДНК-зависимые ДНК-полимеразы ( дезоксирибонуклеозидтрифос-фат:ДНК дезоксирибонуклеотидилтрансферазы КФ 2.7.7.7«-) - ферменты, ковалентно присоединяющие дезоксирибонуклеозидтрифосфа-ты в форме нуклеозидмонофосфатов к растущей цепи ДНК за счёт образования фосфодиэфирной связи между '3^і гидроксилом затравоч-ного и 5^х фосфатной группой полимеризуемого нуклеотидов. Впервые эти ферменты были найдены в клетках Escherichia coli и названы ДНК-полимеразами I, II, III в порядке открытия (і). Несколько позднее было показано присутствие ДНК-полимераз в клетках эукариот (сМ). Как и в клетках е.coli , в эукариотических организмах имеется три типа ДНК-полимераз, различающихся по своим физико-химическим свойствам и биологической роли (5).

Классификация эукариотических ДНК-полимераз

С момента обнаружения в I960 году и до середины 70-х годов в литературе накоплен большой объём информации о ДНК-зависимых ДНК-полимеразах эукариотических клеток. Выделенные из_этих клеток ДНК-полимеразы, наряду с чертами, присущими всем ДНК-поли-меразам, т.е. способностью включать комплементарные дезоксири-бонуклеозидтрифосфаты в форме монофосфатов в копируемую ими матрицу ДНК в присутствии определённых кофакторов, необходимос- тью для инициации синтеза 3 ОН- затравочных групп, направлением полимеризации 5¹ -*-3^ и т.д., имели ряд характерных для каждого фермента особенностей. Для того, чтобы каким-то образом различать эти ферменты, исследователи произвольно называли их в соответствии с физико-химическими свойствами или внутри- клеточной локализацией (б~8). Это затрудняло целенаправленное изучение ДНК-полимераз. Предложенная на международной конференции в Калифорнии в 1975 году единая классификация эукариотичес-ких ДНК-полимераз в определённой степени изменила это положение. Согласно предложенной номенклатуре, все эукариотические ДНК-по-лимеразы в соответствии со своими физико-химическими свойствами и внутриклеточной локализацией были разделены на три класса (9).

ДНК-полимераза о( : фермент с молекулярным весом более 100000, изоэлектрической точкой в кислой области рН, чувствительный к действию реагентов, блокирующих сульфгидрильные группы, проявляющий максимальную активность с "активированной" панкреатической ДНКазой ДНК-матрицей и не способный копировать синтетические полинуклеотиды типа поли (гА)-олиго (dT).

ДНК-полимераза В : низкомолекулярная полимераза (молекулярный вес менее 50000), устойчивая к тиоловым ядам, имеющая изоэлектрическую точку в основной области рН, полимеризующая как "активированную" ДНК, так и различные синтетические полинуклеотиды.

ДНК-полимераза V : белок с изоэлектрической точкой в кислой области рН, с молекулярным весом >100000, более эффективно копирующий полинуклеотиды типа ПОЛИ (гА>олиго (dT) по сравнению с природной ДНК.

Митохондриальная ДНК-полимераза : названа в связи с внутриклеточной локализацией. Является одной из форм Т ДНК-полимера зы (10,II).

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА ОС

ДНК-полимераза (К была первым ДНК-полимеризующим ферментом, выделенным из эукариотических клеток (2). Фермент широко распространён в природе и обнаружен в клетках млекопитающих, птицах, амфибиях, иглокожих, одноклеточных и низших эукариотах (12), а также в растениях (13). Активность всех ДНК-полимераз оі блокируется SH-реагентами: N-этилмалеимидом или п-хлормеркурибен~ зоатом (5). Фермент высокой степени очистки сохраняет свою активность в течение 1-2 месяцев при О С в присутствии В-меркап-тоэтанола (дитиотреитола), фосфата калия, глицерина или сахарозы (1*0. Добавление ДНК к очищенной ДНК-полимеразе стабилизирует её активность при более высокой температуре (15,16). Все исследованные ДНК-полимеразы oL имеют изоэлектрическую точку в области рН 5,2-5,6 (14). Гомогенная ДНК-полимера за, как правило, не содержит ни зндо-, ни экзонуклеазных активностей (5), но способна осуществлять пирофосфоролиз и обмен пирофосфата (17,18).

Молекулярный вес ДНК-полимеразы оС

Способность ДНК-полимеразы оС агрегировать с различного рода белками, а также образовывать димерные и тетрамерные ассоци-аты оказала существенное влияние на определение молекулярного веса фермента. При этом, в случае недостаточно очищенного препарата, обнаруживался широкий спектр ДНК-полимераз ot с различным молекулярным весом (5,12). Данные, полученные на гомогенных препаратах, существенно сузили интервал значений молекулярного веса фермента. Так, из тимуса телёнка выделен гомогенный препарат ДНК-полимеразы оС (19) с константой седиментации 9 S и м_г 500000. По данным электрофореза в полиакриламидном геле с доде-цилсульфатом натрия фермент состоит из четырёх полипептидных цепей с M_r 148000, 59000, 55000 и 48000. Авторы полагают, что - II - описанные ранее формы ДНК-полимеразы ОС с меньшим молекулярным весом являются продуктами частичного протеолиза. Присутствие протеолитической активности, которая уменьшала константу седиментации ДНК-полимеразы с 7,3 S до 5,4 S , обнаружили в ядерной фракции печени крыс (20,), причём в результате протеолиза повышалась удельная активность ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразаoi, выделенная из дрозофилы (21), представляет собой белок с молекулярным весом 280000, состоящий из четырёх субъединиц с м_г 148000 (ОС ), 58000 (J5 ), 46000 ( f ) и 43000 ( S ). Только оС субъединица обладала ДНК-полимеразной активностью. Применяя антитела к интактной ДНК-полимеразе сС и её отдельным субъединицам, авторы обнаружили, что ос субъединица,являющаяся основной полимериэующей* субъединицей, образуется, вероятно, из полипептидов с м_г 185000 и 166000 (22). Аналогичная субъединичная структура ДНК-полимеразы ОС из дрозофилы отмечена в работе (23Л Мехали и др. (24) выделили из клеток регенерирующей печени крысы ДНК-полимеразу с/. , состоящую из пяти субъединиц с м_г 156000, 64000, 61000, 58000 и 54000. Полипептид с м_г 156000 обладал полимеразной активностью и был гомогенным по данным электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Как и в случае с ДНК-полимеразой оС из клеток дрозофилы (21), полимеразная активность в присутствии всех субъединиц значительно возрастала. Фишер и Корн (25) представили данные о выделении из клеток KB гомогенной ДНК-полимеразы о( с молекулярным весом 140000 (ди-мерная форма 280000), состоящей из двух полипептидов с м_г 66000 и 77000, присутствующих в эквимолярных количествах.

Эти и ряд других данных (26-29) дают основание полагать, что ДНК-полимераза <Х представлена основной субъединицей с м_г

I40000-160000, обладающей ДНК-полимеразной активностью, и дополнительными белковыми факторами, в некоторых случаях оказывающими влияние на полимеразную активность. Не исключено, что расхождения в значениях молекулярного веса ДНК-полимеразы <рС вызваны различной степенью нативности фермента, получаемого в процессе очистки. Возможно также существование межвидового различия у этих ферментов.

Ферментативные свойства ДНК-полимера зы с(.

ДНК-полимераза oL для проявления своей активности при использовании в качестве матрицы-затравки природной ДНК нуждается в присутствии четырёх девоксирибонуклеозидтрифосфатов. Исключение из состава инкубационной смеси одного из <штр снижает активность фермента. В реакции полимеризации <ш?Р не могут быть заменены на dNDP или сіШР , не эффективны также rNTP (5,30). Активность ДНК-полимеразы оС абсолютно зависит от ионов двухвалентных металлов Mg²⁺ или Mn²⁺ . Оптимальная концентрация ионов Mg²⁺ в реакционной смеси составляет 4-20 мМ, Мп²⁺ - 0,5-8 мМ (12-14). Уровень активности фермента в присутствии Mg²⁺ в 5-7 раз выше, чем с Мп²⁺ в реакции полимеризации с "активированной" ДНК (14). Оптимум рН ДНК-полимеразы составляет 7,5-8,5. На активность фермента влияет присутствие в инкубационной смеси солей К01 или NaCl , которые в концентрации до 25 мМ проявляют стимулирующее действие, а при более высоких ингибируют реакцию (5,12,14). Однако этот эффект присущ не всем ДНК-поли-меразам оС . Гросс и Краусс (3D сообщили, что ДНК-полимераза оС, выделенная ими из тимуса телёнка, стимулируется K0I в концентрации до 100 мМ. - ІЗ -

Использование различных матриц ДНК-полимеразой оС.

В ряде работ (5,12,14) сообщалось, что ДНК-полимераза ос проявляет наибольшую активность при использовании в качестве матрицы-затравки ДНК, специфически обработанной панкреатической ДНКазой с образованием одноцепочечных участков, содержащих 3 ОН-затравочные концы. При этом максимальная активность фермента проявляется с ДНК, прогидролизованной ДНКазой до появления 2% кислоторастворимых продуктов (3?). Образующаяся в результате подобной обработки матрица содержит одноцепочечные участки ("бреши") размером 80-100 нуклеотидов (33).

Корн и др. (ЗЬ), Фишер и др. (32) обнаружили необычную избирательность фермента к использованию "брешей" различного размера в ДНК матрице и неспособность ДНК-полимеразы с* из клеток КБ застраивать их полностью. В более детальных исследованиях выявлено, что ДНК-полимераза ос может копировать в ДНК "бреши" средней длиной от 10 до 130 нуклеотидов, при этом исключительное предпочтение фермент из КБ клеток оказывал "брешам" размером 30-60 нуклеотидов (35).

Способность ДНК-полимеразы ос заполнять одноцепочечные пробелы в ДНК матрице определяли Ванг и Корн (35) на двух образцах двуцепочечной ДНК фага РМ 2, содержащих бреши со средним размером 35 и 50 нуклеотидов соответственно. Результаты показали, что степень заполнения одноцепочечного пробела в ДНК матрице составляет 50-60$ от степени включения, достигаемой с ДНК-полимеразой фага Т4, которая застраивает бреши полностью (36). Эти данные позволяют предположить, что ДНК-полимераза ос постоянно оставляет незаполненным участок одноцепочечного пробела размером ~>19 нуклеотидов, что хорошо согласуется с отме- ченной ранее ограниченной способностью ДНК-полимеразы заполнять бреши в цепи ДНК 02).

Нативная, термически денатурированная, одноцепочечная и двухцепочечная кольцевые молекулы ДНК не эффективны в качестве субстрата в ДНК-полимера зной реакции (33,37,). Двухцепочечная кольцевая ДНК, содержащая одноцепочечные разрывы, также не поддерживает синтез, осуществляемый ДНК-полимеразой оС (37).

Фишер и Корн (38J продемонстрировали способность ДНК-поли-меразы оС кетализировать реакцию полимеризации на линейных од-ноцепочечных фрагментах ДНК с 3 ОН концами. Авторы показали, что полимераза копирует такие матрицы со значительно меньшей скоростью, чем ДНК с одноцепочечными пробелами. К_т фермента для такой матрицы составляет 10 мкМ нуклеотидов (для ДНК с одноцепочечными пробелами % фермента 30-50 мкШ. Максимальная скорость ДЖ-полимеразной реакции при использовании одно цепочечной ДНК матрицы составляет 10-30$ от скорости на ДНК с пробелами. Продукт реакции полимеризации ковалентно связан с матрицей, образуя шпилечную структуру. Интересно отметить, что 3 ОН конец одноцепочечной ДНК перед реакцией полимеризации не имеет стабильной двухцепочечной конфигурации, а принимает её лишь в результате взаимодействия с ДНК-полимеразой oi .

Кинетический анализ в сочетании с прямыми исследованиями связывания ДНК-полимера зы оС с ДНК (33,37,) показал, что ДНК-по- т т лимераза не взаимодействует с 3 ОН и 5 фосфатными группами, находящимися в области одноцепочечных разрывов, а также на концах двухцепочечных молекул ДНК. Фермент не взаимодействует с двухцепочечной кольцевой репликативной формой I ДНК фага РМ 2, релаксированной формой ІУ, а также с двухцепочечной ДНК.содер- жащей множество одноцепочечных разрывов.

Одноцепочечная кольцевая ДНК фага М 13, как и одноцепочечные фрагменты ДНК М 13, являются сильными конкурентными ингибиторами ДНК-полимеразн ос в реакции с активированной ДНК. При этом взаимодействие ДНК-полимеразы ос с одноцепочечной линейной _{т т}

ДНК, содержащей 3 ОН и 5 фосфатные концы в 3-4 раза выше, чем с одноцепочечной кольцевой молекулой (33). Основываясь на результатах, опубликованных в работах (32-38), Корн и др. (37) предположили, что ДНК-полимераза ос обладает сродством только к одноцепочечным участкам ДНК и не "узнаёт" двухцепочечные, а также 5 фосфатный конец ДНК. 3 ОН затравочный конец узнаётся ДНК-полимеразой оС только после или одновременно со связыванием фермента с одноцепочечным участком. Следует отметить, что информация о взаимодействии ДНК-полимеразы ос с ДНК матрицей получена в основном для фермента, выделенного из КБ клеток, и пока не ясно, насколько этот процесс универсален.

Удобной моделью для исследования взаимодействия фермента с матрицей являются синтетические полинуклеотиды. Одноцепочечные гомополимеры не способны поддерживать активный синтез, осуществляемый ДНК-полимеразой #. (5,14,37). Иная картина наблюдается в случае полидезоксирибонуклеотидов, содержащих комплементарные олигодезоксирибонуклеотидные затравки , типа поли (dA)«(dT)^2-i8* Фермент не копирует одноцепочечные дезоксирибополимеры (поли (dA), поли (dG), поли (dC) и поли (dT) ), а также полирибонуклеотид-ную матрицу с комплементарной ей олигодезоксирибонуклеотидной затравкой типа поли (гА)»олиго (dT). Однако, в случае полиде-зоксирибонуклеотидной матрицы и олигорибонуклеотидной затравки активность фермента резко возрастает. Наиболее эффективной мат- рицей-затравкой в этом случае является поли№).олиго(гА) (38). ДНК-полимераза ск не только поддерживает высокую скорость синтеза на поли^Т)'Олиго(гА) , но и обладает наибольшим сродством к этой матрице. Значительный успех в исследовании взаимодействия ДНК-полимеразы 0( с синтетическими матрицами достигнут в экспериментах, проведённых с ферментом из клеток КБ ОЮ). Эта ДНК-полимераза обладает различным сродством к гомополиме-рам: поли(dT)> поли (dG);> поли (dC);>nПОЛИ(<ІА,йС^ї) >-mMIH(dG,dC,da?)> mwra(dA,dG,dC) . Сродство ДНК-полимеразы о( к матрице зависит от присутствия в инкубационной системе конкурирующих полимеров различного состава. Так, полиса) практически не влияет на копирование активированной ДНК ( %>750 мкМ), но (dA)_/j₀₀»(dO!)₂^ ингибирует эту реакцию ( к^ = 50 мкМ). Одноцепочечная кольцевая ДНК фага у?Х ПЧ сильно ингибирует полимеризацию активированной ДНК ( = 30 мкМ), но почти не действует в случае (dT)₁₀₀»(dA)₂^ ( К^ЧОО мкМ), и исключительно эффективна с (dA)_/j₀₀-(dT)₂e ( Kj^I мкМ). Аналогичные результаты получены для ДНК-полимеразы 0С из клеток HeLa (41). Корн и др. (40) предположили, что, наряду с абсолютным требованием одноцепочечного участка для связывания, ДНК-полимераза о{ способна "узнавать" состав оснований матрицы, и это может обеспечить формальный базис для высокоре-гулируемого процесса взаимодействия фермент-нуклеиновая кислота на специфических последовательностях ДНК.

Взаимодействие ДНК-полимеразы ск с 3* ОН концом затравки достаточно сложно и мало изучено. Исследования в этом плане проведены только с ДНК-полимеразой <Х ^из клеток КБ (38,41). Представлены данные о том, что двухвалентные катионы могут играть важную роль во взаимодействии полимераза-праймер, при этом увеличение концентрации Mg²⁺ приводит к уменьшению сродства фермента к затравочным концам.

Последовательность взаимодействия ДНК-полимеразы ос с субстратами

Субстратами ДНК-полимеразной реакции являются матрица-затравка и <шя?Р . Применяя кинетический метод приближения к стационарному состоянию, было установлено, что ДНК-полимераза &~ из миеломы мыши ihZ) взаимодействует сначала с ДНК, а затем с dNTP и образует тройной комплекс, стационарная концентрация которого очень низка.

При исследовании реакции ДНК-полимеразы ос из клеток KB кинетическим методом и скоростной седиментацией в градиенте концентрации глицерина комплексов ДНК-полимеразы с субстратами было показано, что взаимодействие фермента с матрицей-затравкой и dNTP происходит по строго упорядоченному последовательному механизму (43). Сначала ДНК-полимераза связывается с матрицей, затем с затравкой и, наконец, с dNTP. Связывание dNTP происходит только после образования промежуточного комплекса между ДНК-полимеразой, одноцепочечным участком матрицы и 3 ОН концом затравки. Выбор dNTP строго определяется последовательностью оснований матрицы.

Процессивность ДНК-полимеразы о(.

Синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой ос , можно представить как циклический двухстадииныи процесс, в первой фазе которого происходит связывание Фермента с матрицей-затравкой, а во второй присоединение к матрице комплементарной последовательности соответствующих dNTP . Подобный процесс может протекать тремя способами. Непроцессивный - когда фермент диссоциирует от матрицы после каждого акта каталитического включения dNMP . Про-цессивньщ - когда фермент синтезирует в период между связыванием с матрицей и диссоциацией от неё относительно длинные поли-нуклеотидные фрагменты. Возможен и третий, промежуточный путь, так называемый "квази"процессивный.

В относительно ранних работах было показано, что ДНК-поли-мераза ос относится к непроцессивным ферментам Ой). Однако, Дас и Фуджимура (45), анализируя продукты полимеризации с использованием в качестве матрицы поли (dA)-(dT)io » пришли к выводу, что ДНК-полимераза ос из тимуса телёнка включает за цикл полимеризации "^П нуклеотидов. Кинетический метод определения значения процессивности ДНК-полимераз на природных субстратах, предложенный Бамбара и др. (46), значительно расширил возможности исследователей. Корн и сотрудники (32), используя этот метод, провели количественное измерение процессивности ДНК-полимераэы ОС из клеток КВ. Результаты показали, что фермент осуществляет синтез ДНК по "квази"процессивному способу и включает за период между связыванием и диссоциацией от матрицы ^11 нуклеотидов. Подобные результаты были получены и другими исследователями (23, Ш). Определённые в этих работах значения процессивности являются характерными для субъединицы фермента, обладающей только ДНК-полимеразной активностью. Эта величина может меняться в зависимости от условий проведения реакции, степени очистки фермента, а также от присутствия дополнительных белковых факторов. Интересна в этом отношении работа по определению процессивности

ДНК-полимеразы ос в присутствии ДНК-связывающего белка, который увеличивает значение процессивности до 285 нуклеотидов, а размер вновь синтезируемого продукта - свыше 2000 нуклеотидов (23).

Различные матрицы-затравки также влияют на степень процессивности фермента. Так, если процессивность ДНК-полимеразы ос на активированной ДНК близка к II нуклеотидам, (23,32,47J, то процессивность ДНК-полимеразы ос из тимуса телёнка на одноцепочеч-ной ДНК фага лрХ 174, праймированной фрагментом рестрикции этой ДНК, составляет 150-400 нуклеотидов и зависит от типа прайме-ра (48>.

Внутриклеточная локализация ДНК-полимеразы ос

Вопрос о внутриклеточной локализации ДНК-полимеразы а: и по сей день остаётся дискуссионным. Если при фракционировании клеток стандартными методами с использованием водных растворителей около 90$ активности ДНК-полимеразы оС обнаруживается в цитоплазме (2.49-62J, то в случае применения неводных растворителей или Са ⁺~содержащих сред, основная масса ДНК-полимеразы ot идентифицируется в ядерной фракции (51,53,57,58;. О связи ДНК-полимеразы оС с ядрами свидетельствуют данные по энуклеации клеток с помощью энуклеирующих агентов или физических методов (51). Необходимо отметить, что все перечисленные данные получены при физическом или химическом разрушении клеток, что в определённой степени накладывает отпечаток на достоверность результатов. Браун и др. (59; получили антитела из сыворотки кролика, иммунизированного очищенной ДНК-полимеразой ос. Применяя метод иммуно-флюоресценции, авторы обнаружили, что в фиксированных клетках фибробластов быка основная масса ДНК-полимеразы <х присутствует в перинуклеарной области цитоплазмы. Иммунофлюоресценция цито-пластов и фрагментов кариопластов, полученных энуклеацией клеток цитохалазином В, показала наличие ДНК-полимеразы оС в цито-пластах и отсутствие этого фермента в кариопластах.

Вероятнее всего, в клетках эукариот существует несколько форм ДНК-полимеразы ос , различающихся не только некоторыми физико-химическими свойствами, но и внутриклеточной локализацией. В пользу этого предположения свидетельствует ряд фактов. Филпу-ла и др. (29) обнаружили в водных экстрактах экспоненциально растущих клеток KB три различные формы ДНК-полимеразы ос . При этом 70. общей клеточной активности выпадало на долю цитоплаз-матической ДНК-полимеразы oi , которая ранее была очищена до гомогенного состояния (5). Кроме того, были обнаружены две минорные формы, одна цитоплазматическая {20% активности;, другая {10% активности; - прочно ассоциирована с фракцией клеточных ядер. Подобные результаты были получены Матсукейдж и др.(60;, которые из клеток миеломы мыши выделили три ДНК-полимеразы ос , две из которых присутствуют в цитоплазматической фракции, а одна - в ядерной. Причём, как показали авторы, ядерная ДНК-поли-мераза ос способна образовывать комплексы с некоторыми ядерными структурами и, возможно, с ДНК.

Связь ДНК-полимеразной ативности с гетерохроматином и ядрышком в интактных ядрах печени мыши показана в работе (61;. Молекулярную ассоциацию ДНК-полимеразы с хроматином в эмбрионах морских ежей отмечал Лоэб (62;.

Лоэб и др. (30; описали ДНК-полимеразу ос морского ежа и показали, что большая часть её в неделящихся клетках связана с фракцией цитоплазмы. После оплодотворения и дальнейшего разви- тия эмбрионов морского ежа происходит миграция ДНК-полимераэы oL в ядро (63), и на стадии бластула основная масса активности ДНК-полимеразы ос находится в ядре (64-67;. Миграцию ДНК-полимеразы к репликативным комплексам в ядро отмечали также во время раннего личиночного развития Artemia Сб8).

Механизм регулирования внутриклеточного распределения активности ДНК-полимеразы а. до сих пор остаётся неясным. Однако можно предположить наличие связи между клеточным циклом и локализацией ДНК-полимеразы ос в клетке.

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА J3

Низкомолекулярная ДНК-полимераза впервые обнаружена в клетках ИеЬа (3) и печени крыс (55;. Позднее ДНК-полимераза jB была идентифицирована в тимусе телёнка (69), клетках KB (70; и к настоящему времени найдена почти во всех исследованных объектах (12;. Из тимуса телёнка (69;, клеток KB (70;, гепатомы Новикова (71), миеломы мыши (72; и др. фермент очищен до гомогенного состояния. Процедура очистки, описанная Сталкером и др. (71), включает ряд последовательных стадий: фракционирование сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе, фосфоцеллюлозе, гидроксилапатите и ДНК-целлюлозе. Предложенная схема позволяет очистить фермент в 217000 раз с выходом k6%. Фермент стабилен в течение всей процедуры выделения при 4С и может храниться около года при -196С.

Очищенная ДНК-полимера за J3> свободна от нуклеазных активностей и, в отличие от ДНК-полимеразы оС , не осуществляет пиро-фосфоролиза и обмена пирофосфата (5;. Хотя общим свойством ДНК-полимераз является их устойчивость к сульфгидрильным реаген- там - сильным ингибиторам ДНК-полимераз о( и V , для ДНК-полиме-разы В из гепатомы Новикова (71) и некоторых других отмечено частичное ингибирование их активности N -этилмалеимидом и п-хлор-меркурибензоатом. Фермент проявляет высокую устойчивость к 5 М мочевине, 25$ этанолу или ацетону и стабилен в расворах с рН 4,5-10,5 (12,14).

Все известные ДНК-полимеразы б относятся к основным белкам с изоэлектрической точкой в области рН 8,5-9,5 (5,12,14). Молекулярный вес очищенных ДНК-полимераз 5 из тимуса телёнка, клеток KB, асцитной опухоли крысы составляет 45000 (73). Значения молекулярного веса ДНК-полимераз R , выделенных из других объектов, почти не отличаются (14,74,75). Гомогенная ДНК-полимераза В состоит из одной полипептидной цепи (12). Константа седиментации ДНК-полимераз fi находится в интервале 3-5 s (12-14).

Максимальная активность ДНК-полимеразы р на природных ДНК матрицах проявляется в присутствии всех четырёх dNTP, Фермент способен катализировать включение и одного <Ш?Р в эти субстраты, осуществляя так называемый репаративный синтез (37,74). Фермент нуждается в ионах Щ или Mn , оптимальная концентрация которых 5-Ю мМ и I мМ соответственно (5,12,14,37). Оптимум рН составляет 8,4-9,2 (12,14)- В отличие от ДНК-полимеразы (К , почти все известные ДНК-полимеразы Я стимулируются КС1 в концентрациях 100-200 мМ и NaCl до 50 мМ (5,12,13,69). Неорганический фосфат и пирофосфат сильно ингибируют активность фермента (14).

ДНК-полимера за Я, так же, как и ДНК-полимера за о(, способна копировать различные природные и некоторые синтетические полинуклеотиды (14,37,71,74). При этом уровень активности при использовании этих матриц зависит от наличия в инкубационной

СМесИ ИОНОВ F!g²⁺ ИЛИ №l²⁺.

Активированная панкреатической ДНКазой ДНК является хорошим субстратом для ДНК-полимеразы р , но, в отличие от ДНК-полимера зы ос , наибольшая активность фермента определяется при введении в молекулу ДНК брешей размером 10 нуклеотидов (12,37;. Неоднократно отмечалась способность ДНК-полимеразы В включать в активированную ДНК отдельные дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. (2,26,71,74;. Это включение обусловлено не загрязнением препарата ДНК-полимеразы терминальной нуклеотидилтрансферазой, а способностью фермента осуществлять ограниченный репаративный синтез, протекающий на большом числе 3 ОН концов матрицы. В случае использования в качестве матрицы двухспирального полимера поли f(dA-!D)*(dA-G})J существенного включения не наблюдается (5,18,76). В отличие от ДНК-полимеразы оС , ДНК-полимера за 3 может копировать поли (гА) матрицы в присутствии олиго(dT) затравки. Наибольшая активность фермента проявляется на поли (dA)« олиго (dT) и поли ^С)-олиго (dG) матрицах-затравках (5,71,77).

Уникальным свойством ДНК-полимеразы у? является её способность встраивать dNMP в двухцепочечную ДНК, содержащую одноце-почечные разрывы с 3 ОН концевой группой. Фермент катализирует включение ^15 нуклеотидов на каждый разрыв (35-37). Результаты анализа продуктов полимеризации свидетельствуют о том, что реакция полимеризации, проводимая ДНК-полимеразой J3 с подобным субстратом, осуществляется, вероятно, по механизму смещения цепей.

Эксперименты с использованием в качестве матрицы кольцевой ДНК фага РМ 2 показали, что ДНК-полимераза J3 не имеет существенного сродства к двухцепочечной ДНК. Релаксированная двухцепочеч-ная кольцевая молекула ДНК (форма ІУ) не влияет на активность ~ 24 - фермента в реакции копирования ДНК, содержащей одноцепочечные пробелы или одноцепочечные разрывы фосфодиэфирных связей. Синтетические полинуклеотиды поли (dA) или поли (dT) инертны при добавлении в инкубационную систему, содержащую в качестве субстрата активированную ДНК. Одноцепочечная кольцевая ДНК фага (Р X ПЧ, как и одноцепочечная линейная ДНК, проявляет слабое неконкурентное ингибирование активности ДНК-полимеразы J$ при использовании в качестве матрицы-затравки активированной ДНК. На основании этих данных предполагается, что процесс ингибирования

I не зависит от присутствия 3 ОН концов. Некоторые синтетические гетерополидезоксирибонуклеотиды ингибируют активность ДНК-полимеразы В по смешанному механизму и при использовании их в качестве матриц поддерживают синтез, осуществляемый ферментом. Зти результаты свидетельствуют о способности ДНК-полимеразы В осуществлять самопраймирование определённых матриц в результате связывания с потенциально спариваемыми 3 ОН концами (35,37). Молекулы ДНК, содержащие одноцепочечные разрывы с У- ОН концевой группой, ведут себя кск ингибиторы, конкурентные по отношению к активированной ДНК матрице. Аналогичное действие про- являют молекулы ДНК, имеющие одноцепочечные разрывы с 3 концевым фосфатом и не активные в реакции полимеризации. Константы ингибирования в обоих случаях примерно одинаковы. Зти результаты позволяют предположить, что "узнавание" матрицы-затравки ДНК-полимеразой р) происходит на 3 спаренном конце (35,37).

Процесс полимеризации матрицы ДНК-полимеразой J3 . как показано с помощью кинетического анализа, протекает по упорядоченному Ві-Ві механизму, когда ДНК-полимераза связывается сна-чада с ДНК, а затем с dNTP (72).

Процессивность фермента, определённая Дасом и Фуджимурой на основании анализа продуктов реакции при использовании в качестве матрицы синтетических полинуклеотидов, составляет ~9 нуклео-тидов (45). Результаты, полученные с помощью кинетических методов (46) на природных ДНК субстратах, дают значение процессив-ности, близкое к единице. Косвенным доказательством непроцессив-ной работы Фермента служит способность ДНК-полимеразы А осуществлять полимеризацию на брешах малого размера (12). В отличие от ДНК-полимеразы оС , ДНК-полимераза J3 заполняет бреши в цепи ДНК полностью (78), что, вероятно, обусловлено функциональной ролью фермента.

Как и в случае с ДНК-полимеразой оС , о внутриклеточной локализации ДНК-полимеразы В нет достаточно определённого мнения. В ряде работ (51,52,79) фермент рассматривается как локализованный исключительно в ядрах, хотя разрушение клеток физическими или химическими методами приводит к появлению его активности в цитоплазме (79).

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА J

ДНК-полимераза Y , открытая сравнительно недавно, привлекла пристальное внимание исследователей в связи с некоторым сходством с вирусной обратной транскриптазой. Фермент широко распространён в природе. В клетках его активность обнаруживается в цитоплазме, митохондриях и ядре (10,80,81).

Уровень активности фермента в клетке составляет ~6/ от общей ДНК-полимеризующей активности и примерно соответствует уровню ДНК-полимеразы_у5 . В развивающихся эмбрионах активность ДНК-полимеразы у⁷ может достигать КЪ% от общей ДНК-полимеразной ак- тивности (82). Данных о выделении гомогенных препаратов ДНК-по-лимеразы f на сегодняшний день мало, поэтому большой интерес вызывает работа Ямагучи и др. (82), в которой представлен метод, позволяющий очистить ДНК-полимеразу у из куриных эмбрионов в 1000000 раз. Методика включает: хроматографию на фосфоцеллюло-зе, фракционирование сульфатом аммония, повторную хроматографию на фосфоцеллюлозе, гель-фильтрацию на сефадексе G -200 и хроматографию на гидроксилапатите и ДНК-целлюлозе. Б результате подобной очистки удельная активность фермента возросла до 500000 единиц на мг белка. Выделенную ДНК-полимеразу хранили при температуре -80С. Очищенный фермент имеет константу седиментации 7,3 S , молекулярный вес 180000, состоит из четырёх полипептидных цепей с молекулярным весом 47000 каждая.

ДНК-полимеразы f , выделенные из ряда других объектов,(83-85),очищенные в меньшей степени, подобно ДНК-полимеразе Ы ге-терогенны по молекулярным размерам. Фермент из клеток человека имеет молекулярный вес от 110000 до 300000(86), из тимуса телёнка - 230000-315000 (87). В обоих случаях ДНК-полимераза у обнаруживается в виде нескольких изоформ. Возможно, что в недостаточно очищенных препаратах присутствие незначительных примесей ДНК-полимераз о^ или J3, или продуктов их частичного протеоли-за может создавать видимость различных форм ДНК-полимеразы ^". Исследование физико-химических свойств ДНК-полимеразы V осложняется способностью фермента образовывать агрегаты в растворах с низкой ионной силой (86), что в значительной мере затрудняет определение молекулярного веса этого фермента.

Как и ДНК-полимераза oi , ДНК-полимераза У¹ имеет изозлек-трическую точку в кислой области рН, ингибируется сульфгидриль- ними реагентами и некоторыми другими ингибиторами (5,12,14).

Для проявления своей активности ДНК-полимераза *f требует наличия четырёх сШТР , ионов Mg²⁺ (5-12 мМ) или Mn²⁺ (0,1-0,6 мМ), оптимум рН фермента 8-9 (12,14). В отличие от ДНК-по-лимеразы оС , ДНК-полимераза Т стимулируется высокими концентрациями KCI 200 мМ (5).

Каталитические свойства фермента мало изучены. Известно, что 1^ для дезоксирибонуклеозидтрифосфатов несколько ниже, чем в случае ДНК-полимераз оС и в. Имеются данные, что ДНК-полимераза 1Г способна осуществлять синтез на одноцепочечных пробелах в ДНК размером от 10 нуклеотидов и более. Фермент застраивает матрицу процессивно, при этом значение процессивности может достигать 4000. Скорость полимеризации матрицы составляет 32 нук-леотида в секунду на одну молекуду фермента, что приблизительно соответствует скорости полимеризации ДНК-полимеразы оС и значительно выше скорости ДНК-полимеразы J3 . Подобно ДНК-полимеразе j3, фермент не способен инициировать синтез на гибридной ДНК матрице, содержащей РНК затравку (12). Следует однако,отметить, что представленные результаты получены при исследовании ферментов, выделенных из различных объектов, различной степени очистки и т.д. и далеки от того, чтобы на основании их можно было бы создать целостную картину. До сих пор нет чётких доказательств отсутствия в препаратах ДНК-полимеразы у экзонуклеазных активностей. Не известно, способна ли ДНК-полимераза у осуществлять пирофосфоролиз и обмен пирофосфата.

ДНК-полимераза у, подобно вирусным обратным транскрипта-зам, может.эффективно использовать гомополирибонуклеотидные матрицы типа поли (гА), однако в литературе отсутствуют достоверные данные о способности ДНК-полимеразы 1Г копировать природные РНК. Антисыворотка, приготовленная для вирусных обратных транскрип-таз, не влияет на активность ДНК-полимеразы Т (88.). Другим различием между обратной транскриптазой и ДНК-полимеразой Y является неспособность последней копировать поли 2-0-метиладенилат-ные матрицы, которые весьма эффективно используются обратной транскриптазой (85).

В процессе очистки ДНК-полимеразу у* можно легко отличить от ДНК-полимераз оС и в по ряду критериев. Наиболее характерным свойством ДНК-полимеразы V является способность её использовать наряду с природными матрицами различные синтетические полимеры типа поли (гА), поли (гС),поли (rG), поли (rU)(5,9,I4). По сравнению с ДНК-полимеразой В , ДНК-полимераза Т использует полирибонуклеотиды в 5-Ю раз эффективнее, чем соответствующие дезоксирибонуклеотидные матрицы. Различное влияние KGI на активность эукариотических ДНК-полимераз служит достаточно убедительным критерием для отнесения фермента к тому или иному классу. Так, активность ДНК-полимеразы Т максимальна в присутствии 100-300 мМ KCI и при этом стимулируется фосфатом. В то же время, активность ДНК-полимеразы о( максимальна при 25 мМ KCI, а ДНК-полимераза Р, ингибируется фосфатом. Как и ДНК-полимераза оС, ДНК-полимераза У ингибируется N-этилмалеимидом в концентрации I мМ (5,14). Эти характеристики, вместе с известным молекулярным весом, дают возможность отличить каждую из трёх ДНК-полимераз.

Относительно ДНК-полимераз митохондрий первоначально единого мнения не было. Предполагалось, что митохондрии обладают уникальными ДНК-полимеразами, которые нигде в клетке больше не встречаются, что в митохондриях содержится две ДНК-полимеразы, одна из которых ДНК-полимераза Y¹ (89) и т.д. Сравнительно недавние исследования митохондрий из клеток HeLa показали присутствие только одной У -подобной ДНК-полимеразы (10). Аналогичные результаты были получены на митохондриях из ряда других объектов (90-93).

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА 8

За последние 5-6 лет ДНК-полимераза с ассоциированной 3 -*5 экзонуклеазной активностью была обнаружена и выделена как из клеток низших эукариотов (94-95), так и из клеток ряда млекопитающих (96,97). Обнаруженную полимеразу назвали ДНК-полимеразой 8 в соответствии с рекомендациями, принятыми на конференции в 1975 году (9). Основное отличие от всех эукариотических ДНК-полиме-раз - присутствие в ДНК-полимеразе S 3 -*-5 экзонуклеазной активности, которая не отделяется в процессе очистки. Очистка ДНК-полимеразы 8 из тимуса телёнка, включающая ионообменную, аффинную хроматографии, гель-фильтрацию и др., в 8000 раз, не способствовала отделению нуклеазной активности от активности ДНК-полимера зы (98). Фермент был гомогенным по данным электрофореза. Молекулярный вес, определённый гель-фильтрацией, составлял 200000, константа седиментации 7,5 S . Как и в случае ДНК-полимеразы oL , очевидны расхождения в значениях молекулярного веса, определённых различными методами, что, по всей вероятности, определяется асимметричностью молекулы. Электрофорез белка в присутствии до-децилсульфата натрия показал наличие двух субъединиц с молекулярным весом 49000 и 60000 в соотношении 1:1. Сравнительное исследование (97) отношения ДНК-полимераз oL и S к действию таких _{- зо -} ингибиторов, как афидиколину, агаСТР, ddTTP и N -этилмалеими-ду показало, что как и ДНК-полимераза ot , ДНК-полимераза 8 в равной степени ингибируется агаСТР и афидиколином. Чувствительность к N -этилмалеимиду ДНК-полимеразы S значительно выше. Оба фермента устойчивы К ddTTP.

Б противоположность бактериальным ДНК-полимеразам, ни oL , ни /5 , ни 'f ДНК-полимеразы эукариот не обладают 3* -*-5* экзо-нуклеазной корректирующей активностью (5), которая играет важную роль в обеспечении точности репликации у прокариот (і). Наличие 'у- -+-5¹ окзонуклеазной активности в молекуле ДНК-полимеразы S позволяет несколько пересмотреть представления о процессе копирования ДНК-матрицы ДНК-полимеразами эукариот, а спо-

Т " т собность 3 .-**5 окзонуклеазной активности, связанной с ДНК-по- лимеразой, выщеплять неспаренные нуклеотиды (98) упрощает представление о механизме коррекции в синтезе ДНК.

Однако, несмотря на перечисленные результаты, вопрос о существовании ДНК-полимеразы 8 является достаточно дискуссионным. Во-первых, ДНК-полимераза 8 мало исследована, во-вторых, по основным йизико-химическим свойствам ДНК-полимераза S очень похожа на ДНК-полимеразу oL (5,12,14), в-третьих, способность ДНК-полимеразы oL к образованию комплексов с различными белками, в том числе и нуклеазами, ни у кого не вызывает сомнений.

РОЛЬ ДНК-ПОЛИШРЛЗ В РЕПЛИКАЦИИ ДНК

С тех пор, как стало известно о существовании в клетках эукариот более чем одного типа ДНК-полимераз, перед исследователями встал вопрос о том, какой из этих ферментов осуществляет ре-пликативный, а какой - репаративный синтез ДНК. Биологическая - ЗІ - роль ДНК-полимераз прокариот хорошо изучена в связи с возможностью получения условно летальных мутантов по структурным генам ДНК-полимераз. Для эукариотических ДНК-полимераз в настоящее время доступны лишь непрямые доказательства участия ферментов в том или ином процессе биосинтеза ДНК, хотя в литературе появились сообщения о получении мутантов по репликации ДНК у грибов (99), дрозофилы (100), клеток млекопитающих (.101).

Прежде, чем рассматривать роль ДНК-полимераз б репликации ДНК, целесообразно представить кратко схему процесса, происходящего в репликативной вилке. Репликативный синтез двухцепочеч-ной ДНК осуществляется полуконсервативно. Согласно современной модели (102-104.), репликаидия ДНК инициируется в уникальном сайте, названном "началом репликации". Каждая единица репликации (репликон) имеет одну последовательность, с которой инициируется репликация - "ориджин". Процесс инициации в уникальном сайте достаточно сложен и включает ряд последовательных ферментативных реакций, обеспечивающих образование одноцепочечного разрыва и локального раскручивания цепей ДНК.(I). Свободный конец с 3 гидроксильной группой может служить праймером для репликативной ДНК-полимеразы, или же праймер может синтезироваться на раскрученной области ДНК специфической РНК-полимеразой (праймазой). Праймер может быть синтезирован in situ или на некоторых других локусах ДНК и перенесён к началу репликации. Как только праймер расположится в "ориджине", репликативный комплекс, содержащий ДНК-полимеразу, элонгирует его в 5* -*-3 направлении. При этом образуется репликативная вилка, которая движется от начала репликации одно- или двунаправленно (104) т т Поскольку репликация происходит в направлении от 5^і к 3 концу двухцепочечной молекулы ДНК, вероятно, посредством одного и того же механизма, этот механизм не может действовать синхрон~ но и одновременно на обеих цепях. В зоне вилки временно может существовать асимметричный одноцепочечный участок спирали в той области, где происходит репликация противоположной цепи. Таким образом, синтез ДНК в репликативной вилке можно разделить на две фазы: I. Репликация ДНК в направлении движения репликативной вилки (опережающий синтез,). 2. Репликация в противоположном направлении (запаздывающий синтез.) (10^. "Опережающий синтез" может быть непрерывным. В этом случае, пока протекает процесс элонгации, двойная спираль около вилки раскручивается, создавая одноцепочечную противоположную область. Этот участок реплицируется прерывисто, с образованием промежуточных коротких фрагментов ДНК (фрагменты Оказаки), которые затем объединяются,образуя непрерывную цепь. Фрагменты Оказаки инициируются на множественных и менее специфичных сайтах, когда появляются одноцепочеч-ные области.

Инициация "запаздывающего синтеза" происходит от праймера, синтезированного de novo . Ферментом для синтеза праймера может быть или РНК-полимераза, как наблюдается при синтезе ДНК фага М 13, или специфическая праймаза, такая как белок гена una G E.coli (і).Механизм, который лежит в основе переключения синтеза праймера на синтез ДНК, не изучен. Однако примечательно то, что в зоне ковалентного соединения РНК с ДНК существует выраженная специфичность в отношении рибонуклеотида и дезоксирибонуклео-тида, что.позволяет предположить наличие в матрице определённых и часто повторяющихся последовательностей, дающих сигнал к переключению с транскрипции РНК на репликацию ДНК (I04J.

Как только ДНК-полимераза включается в элонгацию цепи, наиболее эффективным механизмом синтеза ДНК является процессивный, то есть транслокация той же ДНК-полимеразы до конца матрицы. Заполнение пробелов в ДНК, образующихся после выщепления РНКазой РНК праймеров, вероятно, протекает не процессивно. Таким образом, налицо участие в репликации по меньшей мере двух ДНК-по-лимераз, одна из которых синтезирует ДНК процессивно, другая -дистрибутивно. Кроме того, эти ферменты могут различаться по способности функционировать на одноцепочечных участках различной длины.

Первые свидетельства об участии ДНК-полимеразы <Х в процессе репликации ДНК были получены Ченг и Боллумом (18.), которые обнаружили, что в результате стимуляции L клеток к делению происходит возрастание уровня активности ДНК-полимеразы ОС , а уровень активности ДНК-полимеразы J3 существенно не меняется. Аналогичные результаты были получены при определении ДНК-полимераз-ных активностей в регенерирующей печени крыс (105.) и при стимуляции лимфоцитов фитогемагглютинином (106). В этих клетках активность ДНК-полимеразы d увеличивалась одновременно с ростом скорости синтеза ДНК. Исследуя изменение активности ДНК-полимеразы оС в синхронизированных культурах клеток, Спадари и Вейс-бач (107), а затем Чиу и Берил (108) обнаружили увеличение активности ДНК-полимеразы оС. в поздней G I и s фазах клеточного цикла, что свидетельствует о корреляции между изменением активности ДНК-полимеразы < с началом и концом репликативного синтеза. Изменение в активности ДНК-полимеразы о( в процессе пролиферации клеток обнаружено и у других эукариотов. В ходе развития морских ежей (109) и Xenopus laevis (ПО) отмечено зна- - 3k ~ чительное возрастание активности ДНК-полимеразы ОС в процессе созревания икры. В пользу непосредственного вовлечения ДНК-полимеразы ос в процесс репликации свидетельствует тот факт, что в неделящихся клетках, в частности, в зрелой сперме морского ежа, активность ДНК-полимеразы сХ. не обнаруживается.(ill). Заметное уменьшение d.-ДНК-полимеразной активности отмечено при дифференцировке половых клеток мышей (Ц2).

Другой подход к изучению биологической роли ДНК-полимераз -это использование различных ингибиторов, специфически блокирующих активность той или иной ДНК-полимеразы. Применяя ddTTP -ингибитор, влияющий на активность ДНК-полимераз J3 и ff, Эден-берг и др. (ИЗ) отметили участие ДНК-полимеразы d в репликации ДНК вируса SV 40, а Вагар и др.. (114) участие её в репликации ДНК клеток HeLa . Основная функция ДНК-полимеразы ос в процессе репликации ДНК была подтверждена с помощью агаОТР, афи-диколина, N-этилмалеимида и фосфоноацетата (115,116). Особый интерес в этом отношении представляют результаты, полученные с помощью афидиколина, специфически ингибирующего активность ДНК-полимеразы оС и индифферентного к другим ДНК-полимеразам эука-риот (116).

Как уже упоминалось, репликативный синтез ДНК эукариот инициируется с коротких РНК праймеров. Этот факт также говорит в пользу участия ДНК-полимеразы ос в репликации, поскольку из всех очищенных ДНК-полимераз эукариот только ДНК-полимераза ос способна копировать ДНК-матрицу, содержащую в качестве праймера олигорибонуклеотид. Матсукейдж и др. (78) показали, что размер продукта, синтезируемого ДНК-полимеразой OL на ДНК с (гА)^₂-зо в качестве праймера, составляет 3-5 В , что соответствует длине фрагмента Оказаки. ДНК-полимераза оі полимеризует ДНК матрицу процессивно, включая за цикл полимеризации ~\Е1 нуклеотидов (32). В присутствии некоторых белковых факторов значение процессивнос-ти может возрастать (23). Скорость полимеризации цепи ДНК, осуществляемой ДНК-полимеразой #. , и скорость движения репликатив-ной вилки находятся в близком соответствии (115).

Перечисленные аргументы, свидетельствующие в пользу участия ДНК-полимеразы оС в репликации ДНК, не исключают возможности вовлечения в этот процесс других эукариотических ДНК-полимераз. В частности, для элонгации цепи ДНК, на которой протекает непрерывный синтез, более подходит ДНК-полимераза У, значение про-цессивности которой превышает 4000 (12)» тем более, что активность этого фермента была обнаружена в ядрах (5).

Данных об участии ДНК-полимеразы ft в репликации ДНК очень мало. На ранних стадиях развития морского ежа Хобарт и Инфант (67) обнаружили повышение уровня активности ДНК-полимеразы J3 , тогда как уровень активности ДНК-полимеразы ОС оставался постоянным. Зйшлер и др. (117) показали, что ДНК-полимераза В из КБ клеток осуществляет in vitro элонгацию митохондриальной ДНК в D-петле. Матсукейдж и др. (78) представили данные о способности ДНК-полимеразы В удлинять 3-5 S фрагменты ДНК, синтезированные ДНК-полимеразой cL . Непроцессивный характер полимеризации (46), а также способность ДНК-полимеразы 3 работать на одно-цепочечных пробелах размером менее 10 нуклеотидов (35) дают основание полагать, что ДНК-полимераза В принимает участие в заполнении одноцепочечных участков в ДНК после удаления РНК прай-меров и в воссоединении Фрагментов Оказаки.

Сравнительно недавно обнаружены & подобные ДНК-полимеразы, (праймазьО, копирующие одноцепочечную ДНК в отсутствие затравки. Фермент сам синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов фрагмент РНК, служащий затравкой для дальнейшей работы ДНК-полиме-разы (II8-I22).

РОЛЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ В РЕПАРАЦИЙ ДНК

Стабильность генетической информации клеток обеспечивается рядом систем, способных восстанавливать (репарировать) повреждения в цепи ДНК, вызванные физическими или химическими агентами, или нарушениями в процессах метаболизма. Репарация повреждений в ДНК происходит по одному из следующих механизмов (123):

Вырезание (эксцизионная репарация). Повреждённый участок в одной из цепей ДНК вырезается (эта реакция может происходить в темноте, и поэтому процесс называется "темновой репарацией"), а затем образовавшийся пробел заполняется нормальными нуклеоти-дами. При этом в качестве матрицы используется интактная цепь ДНК. 3. Рекомбинация. Фрагмент ДНК с дефектом заменяется в ходе обмена гомологичными участками ДНК.

Наиболее общим способом исправления повреждений в ДНК, вызванных химическими мутагенами, ультрафиолетовым или ионизирующим излучением, является эксцизионная репарация. Модель эксци-зионной репарации (123) включает создание с помощью специфической эндонуклеазы одноцепочечного разрыва вблизи повреждённого участка ДНК, выедание экзонуклеазой повреждённого фрагмента, заполнение ДНК-полимеразой образовавшегося пробела, лигирование одноцепочечных разрывов.

Попытки идентифицировать ДНК-полимеразу, ведущую репаратив-ннй синтез ДНК в эукариотах, основывались на изучении корреляции активности ДНК-полимеризующих ферментов со стадиями клеточного цикла. Поскольку уровень активности ДНК-полимеразы в оставался постоянным на протяжении клеточного цикла (108) и не изменялся в процессе физиологического развития (124), фермент рассматривали как репаративный. При стимуляции культуры лимфоцитов фитогемагглютинином (106) обнаружено два пика синтеза ДНК -репликативный и репаративный, причем возрастание активности ДНК-полимеразы в коррелировало со способностью клеток к репарации. ДНК-полимераза R катализирует in vitro репарацию разрывов в ДНК, стимулированных блеомицином (125). В пользу участия ДНК-полимеразы Й в процессе репарации ДНК свидетельствуют и некоторые каталитические свойства фермента, такие как способность ДНК-полимеразы R работать на одноцепочечных пробелах в ДНК-матрице размером менее 10 нуклеотидов и заполнять брешь до конца (35). Кроме того, непроцессивный характер полимеризации (46) является предпочтительным для репаративного синтеза.

Хюбшер и др. (126) показали, что ДНК-полимераза R может участвовать в репарации УФ-поврежденной ДНК в ядрах нейронов. Однако, поскольку в ядрах нейронов отсутствуют активности ДНК-полимераз о( и V, нельзя исключить участия этих ферментов в репарации ДНК в других эукариотических клетках.

Филипп и др. (127) обнаружили, что ДНК-полимеразы й и о( способны использовать УФ-облученные (dT)^₀₀* (dA)x,c При этом, если на необлученной матрице ДНК-полимераза ос синтезирует короткие продукты, то наличие пиримидиновых димеров в матрице приводит к тому, что фермент копирует её полностью, как и

ДНК-полимеразауЗ . Этот так называемый "обходной синтез" на УФ-облучённой матрице показан также в работе Сі?8Л Миллер и Чина-ульт (129) изучали роль ДНК-полимераз оі и 3 в репаративном синтезе, используя для индуцирования репарации различные агенты. Результаты показали, что обе ДНК-полимеразы участвуют в устранении повреждений в ДНК, однако степень участия ДНК-полимераз в этом процессе зависит от агента, используемого для индукции повреждения в цепи ДНК. Так, ДНК-полимераза 3 главным образом отвечала за репаративный синтез, вызванный блеомицином и карци-ностатином, а ДНК-полимераза ее преимущественно осуществляла синтез после воздействия N-метил- N-нитро- N-нитрозогуанидином или N-нитрозометилмочевиной, алкилирующими агентами, индуцирующими значительно большие повреждения в ДНК, чем блеомицин и карциностатин. Эти и другие данные (130) свидетельствуют о том, что степень вовлечения ДНК-полимераз в репаративный синтез зависит как от количества, так и от типа повреждений в ДНК.

Очевидно, что в репарации ДНК, так же как и в репликатив-ном синтезе, участвует не одна ДНК-полимераза, а целый комплекс ферментов и различных белковых факторов (I3D. В настоящее время энзимология этих процессов изучена далеко не полностью. Не охарактеризованы пока многие белковые факторы, регулирующие процесс репарации, не выяснена степень ответственности ферментов на отдельных этапах устранения повреждений в ДНК.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ J¹

Роль ДНК-полимеразы f в процессе биосинтеза ДНК недостаточно ясна. В настоящее время известно, что ДНК-полимераза у су ществует в двух йормах, одна из которых локализована в ядрах, ~ 39 - другая в митохондриях (10,81,83). Поскольку ДНК-полимера за ^является единственным ДНК-полимеризующим ферментом митохондрий (Ю), детальное исследование репликации митохондриальной ДНК даёт ключ к пониманию роли этого фермента в процессе биосинтеза ДНК. Кольцевая форма молекулы митохондриальной ДНК предполагает иной характер репликации ДНК, отличный от репликации ядерной ДНК. Синтез митохондриальной ДНК начинается с образования D -петли, которая расширяется в поцессе непрерывистой однонаправленной репликации одной из цепей. Копирование этой Н-цепи достигает 2/3 длины генома, прежде чем начинается репликация второй Ь-цепи, которая также носит непрерывистый характер (132). В митохондриях дрозофилы синтез одной цепи митохондриальной ДНК заканчивается на 99^, когда начинает копироваться вторая цепь (133.). Такой механизм репликации называется синтезом со смещением цепи. И поскольку репликацию митохондриальной ДНК катализирует ДНК-полиме-раза Y* , то именно её следует считать ответственной за этот тип синтеза.

Репликация аденовирусной ДНК протекает по аналогичному механизму, когда одна цепь родительской ДНК синтезируется независимо от другой, т.е. процесс репликации включает, по крайней мере на начальном этапе, синтез со смещением цепи (115). Участие ДНК-полимеразы Y в репликации аденовирусной ДНК (134,135,) подтверждает уникальную роль этого фермента.

Репликация и митохондриальной, и аденовирусной ДНК осуществляется без образования интермедиатов типа фрагментов Оказаки, и этому прекрасно соответствуют такие свойства ДНК-полимеразы f , как способность её синтезировать длинные цепи ДНК и высокая степень процессивности (82).

ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ МОРСКОГО ЕЖА

Первые исследования, посвященные ДНК-полимеразам морского ежа, относятся к концу 60-х годов. Лоэб и сотр. (30) представили результаты по выделению и изучению некоторых физико-химических свойств ДНК-полимеразы, составляющей основную массу ДНК-син-тезирующей активности в клетках эмбрионов морского ежа Strongylo-centrotus franciscanus и S.purpuratus . Выделенная ДНК-поли-мераза эффективно копировала активированную панкреатической ДНКазой ДНК в присутствии четырёх дезоксирибонуклеозидтрифосфа-тов и ионов двухвалентных металлов Mg²⁺ или Mn²⁺ , имела оптимум рН 8,0 и молекулярный вес I40000-I50000. Впоследствии фермент был отнесён к классу ДНК-полимераз оі (13б).

В 1977 году были опубликованы результаты по выделению из ядерной фракции эмбрионов морского ежа Hemicentrotus pulcherri-mus ДНК-полимеразы,проявляющей максимальную активность на синтетической полинуклеотидной матрице-затравке поли (йА)-оли-го (dT) (74). Молекулярный вес фермента 50000, коэффициент седиментации 3,0 S . ДНК-полимераза была относительно устойчива к сульфгидрильным реагентам и ионной силе. Оптимум рН свыше 9. На основании этих свойств авторы классифицировали термент как ДНК-полимеразу 3 . Несколько позднее Хобарт и Инфант (75) представили данные о выделении низкомолекулярной ДНК-полимеразы из эмбрионов морского ежа S.purpuratus . ДНК-полимераза эффективно копировала поли (с!А)*олиго (<м?), проявляла устойчивость к SH-реагентам и стимулировалась KGI. Молекулярный вес фермента был меньше, чем у ДНК-полимеразы 3 из эмбрионов H.pulcherrimus (34000), а коэффициент седиментации несколько выше (3,3S ). Выделенный фермент был также отнесён к классу ДНК-полимераз 13.

Вопрос о существовании в клетках эмбрионов морского ежа ДНК-полимеразы f в течение длительного времени оставался дискуссионным. Однако в 1979 году Хабара и др. (137) обнаружили и выделили из эмбрионов морского ежа H.pulcherrimus ДНК-полиме-разу, напоминающую по своим физико-химическим свойствам ДНК-по-лимеразу У из клеток позвоночных.

Присутствие различных типов ДНК-полимераз наблюдали в не-оплодотворённой икре Paracentrotus lividus (138), в икре и эмбрионах S.purpuratus (164,).

В связи с некоторыми особенностями биосинтеза ДНК в развивающихся эмбрионах морского ежа (139) следует уделить внимание локализации ДНК-полимераз морского ежа в клетке и участию их в процессах репарации и репликации.

В икре морского ежа обнаруживается высокий уровень активности ДНК-полимеразы oL , которая практически вся локализована в цитоплазме (63). Шиода и Нагано (140) показали связь её с эндо-плазматическим ретикулумом. После оплодотворения и начала быстрого деления клеток происходит миграция ДНК-полимеразы oL из цитоплазмы в ядро. На стадии ранней бластулы основная масса ДНК-полимеразной активности находится в ядре (65). При этом почти вся ДНК-полимераза OL на этой стадии ассоциирована с ядерной мембраной (140). Изменения в локализации согласуются с изменениями в синтезе ДНК. Первый период синтеза ДНК начинается перед слиянием ядер гамет. Репликация обоих пронуклеусов осуществляется цитоплазматической ДНК-полимеразой ос икры, поскольку в сперме морского ежа ДНК-полимераза оС отсутствует КЩ^)» Даль- t '-ьг::;.' нейший синтез ДНК протекает со скоростью клеточн^го^еления. Происходит увеличение содержания ядерной ДНК на эмбрион и коли- ~ 42 - чественное связывание ДНК-полимеразы со вновь образующейся матрицей, так что отношение ДНК-полимеразной активности к ДНК остаётся постоянным в изолированных ядрах во время раннего развития эмбрионов. Ко времени быстрого синтеза ДНК ДНК-полимераза са становится ядерной.(65). Миграция фермента из цитоплазмы в ядро и одновременное увеличение скорости синтеза ДНК указывает на ре-пликативную функцию ДНК-полимеразы оС. После "Еылупления" скорость клеточного деления уменьшается. Общая активность ДНК-полимеразы ос остаётся постоянно!' на протяжении раннего развития эмбрионов, и перемещение ДНК-полимеразы из цитоплазмы в ядро играет, вероятно, определённую роль в регуляции синтеза ДНК.

Низкомолекулярная ДНК-полимераза 3 обнаружена как в икре, так и в быстро делящихся эмбрионах (74,75). Большое количество фермента находится в цитоплазме икры, и, в отличие от ДНК-полимеразы OL , эта неядерная локализация не изменяется в период быстрого синтеза на стадии бластулы (67). Таким образом, ДНК-полимераза В морского ежа представляет собой первый пример эукарио-тической ДНК-полимеразы^, локализованной преимущественно (более 40%) в цитоплазматической фракции.

Активность ДНК-полимеразы Я стимулируется при оплодотворении и на стадии ранне? бластулы (75). Наиболее вероятной причиной увеличения активности ДНК-полимеразы Я является синтез этого фермента, происходящий в период инициации белкового синтеза после оплодотворения. Второе повышение уровня ДНК-полимеразы В на ранней бластуле совпадает с морфологическими изменениями, представляющими собой первое проявление дифференцировки на стадии, близкой к образованию первичных мезенхимных клеток.

Аналогичных колебаний в уровне активности ДНК-полимеразы В не наблюдалось в культурах клеток млекопитающих, несмотря на то, что они активно делятся.

Из представленного обзора литературы видно, что несмотря на то, что исследованию ДНК-полимераз посвящено довольно много публикаций, работ, касающихся молекулярного механизма синтеза ДНК у эукариот, явно не достаточно. Кроме того, результаты в этом направлении получены только с ДНК-полимеразами из клеток карциномы человека, и поэтому они могут служить лишь основой для дальнейших исследований. Только широкомасштабные исследования деталей синтеза ДНК, осуществляемого ДНК-полимеразами, выделенными из объектов, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы, позволят понять механизм биосинтеза ДНК в клетках эукариот. - Ції -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы, использованные в работе

В работе использовали немеченые дезоксирибонуклеозидтри-фосфаты производства СКТБ БАВ (Новосибирск), Рн]тимидин-5-¹-три-фосфат фирмы " Amersham " (Англия), панкреатическую ДНКазу фирмы " Serva " (ФРГ), микрококковую нуклеазу фирмы "Whorthington " (США), S I нуклеазу и ДНК-полимеразу бага Т4 производства СКТБ БАВ (Новосибирск), экзонуклеазу III E.coli , полученную по методу (141), ДНК из тимуса телёнка фирмы " Koch-Light " (Англия), ДНК из молок лосося производства СКТБ БАВ (Новосибирск), синтетические полинуклеотиды фирмы "P-L Biochemicals " (США) и производства СКТБ БАВ (Новосибирск), одноцепочечную и репликатив-ную форму ДНК бага а?Х 174, полученную по методу (142). Плазмид-ную ДНК Col EI получали по методу (143), активированную ДНК готовили по методу (30).

Получение эмбрионов морского ежа

Яйцеклетки получали путём введения в полость морского ежа I мл 0,5 М KCI. Икру собирали в 100 мл стаканчики, оберегая от прямого воздействия солнечных лучей. Сперму получали, сильно встряхивая морских ежей. Икру из стаканчиков объединяли и отмывали от KCI профильтрованной морской водой. Добавляли сперму и за степенью оплодотворения наблюдали в микроскоп. Оплодотворенные яйцеклетки отмывали морской водой от излишков спермы, разводили до соответствующей концентрации и развивали до стадии 32-64 бластомера при непрерывном перемешивании. Развитие кон- тролировали с помощью микроскопа. Через 4-6 часов мешалку останавливали, осевшие эмбрионы дважды промывали раствором 0,7 М глюкозы в 0,01 М трис-HCI рН 7,6, 0,01 М ЭДТА. Отмытые эмбрионы помещали в жидкий азот и хранили при температуре -19бС.

Приготовление сырого белкового экстракта

Эмбрионы морского ежа, хранившиеся при температуре жидкого азота, размораживали и суспендировали в 0,05 М калий-фосфатном буфере рН 7,4, 0,001 М ЭДТА, 0,3 М NaOl , 0,002 М /5-меркапто-этаноле (объём I л). Полученную суспензию порциями дезинтегрировали импульсами по 10 секунд на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2 (СССР.) в течение 3-5 минут. Температуру суспензии постоянно контролировали. Разрушенные эмбрионы центрифугировали 20 мин при 6000 є . Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость использовали для выделения ДНК-полимераз.

Хроматография суммарного белкового препарата на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

К 50 мл сырого экстракта постепенно добавляли сухой сульфат аммония до конечной концентрации 3,9 М, непрерывно контролируя рН. Образовавшийся белковый осадок собирали, растворяли в 5 мл 0,01 М трис-НСІ рН 7,4 с 0,001 М ЭДТА, 0,001 М /-мер-каптоэтанола, 10$ глицерина. Раствор белка (60 мг) обессоливали на колонке (2x40 см) с сефадексом G -25 грубый. Обессоленный белок наносили на колонку (1,5x8,5 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенную тем же буфером. Хроматографию проводили линейным градиентом концентрации NaCl (0-0,5 М, 2x55 мл) в том же буфере со скоростью 9 мл/час. Объём фракции 2,3 мл.

Во фракциях определяли ДНК-полимеразную активность.

Фракционирование белкового экстракта сульфатом аммония

В полученный из эмбрионов морского ежа белковый экстракт градиентно добавляли при непрерывном перемешивании сухой сульфат аммония до 20$ насыщения и оставляли на 5-6 часов. Образовавшийся осадок отфильтровывали. В Фильтрат добавляли сухой сульфат аммония до 45$ насыщения, оставляли на ночь. Сформировавшийся осадок отделяли ультрацентрифугированием на ультрацентрифуге VAC -602 при 40000 g в течение 2 часов. Высоленный белок использовали для выделения ДНК-полимеразы о( . Надосадочную жидкость подвергали дальнейшему фракционированию (nh^jso^ до 80$ насыщения.Через 10-12 часов после добавления сернокислого аммония высоленный белок отделяли центрифугированием на ульра-центрифуге VAC -602 при 80000 g в течение Ч часов и использовали для выделения ДНК-полимеразы ft . Ни фракция 20$ насыщения сульфатом аммония, ни супернатант после 80$ насыщения не содержали ДНК-полимеразной активности.

Электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез проводили в трубках диаметром 0,6 см и длиной 8 см при температуре 0~4С. Стартовый гель содержал следующие компоненты: 125 мМ трис-HCI буфер, рН 6,8, 2,5$ акриламид, 0,6$ гт^'-метилен-бисакриламид, 0,06$ n,n,n*,R' -тетраметилен-диамин ( ТЕМЕД ), 20$ сахарозу, 5 мкг/мл рибофлавин. В состав разделяющего геля входили: 37,5 мМ трис-HCI буфер, рН 8,9, 7$ акриламид, 0,18$ n,n' -метилен-бисакриламид, 0,03$ ТЕМЕД, 0,07$ персульфат аммония. На гель наносили ДНК-полимеразу и - hi - электрофорез проводили б 10 мМ трис-глициновом буфере, рН 8,3 при токе 2 мА на трубку.

Электрофорез ДНК-полимераз в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия

Электрофорез в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли (Ikh). К образцу фермента добавляли равный объём раствора, содержащего 250 мМ трис-HGI, рН 6,8, 10$ _/?-меркаптоэтанол, 2$ додецилсульфат натрия (МО, 20% глицерин и бромфеноловый синий. Смесь прогревали 2 минуты при Ю0С. Стартовый гель содержал: 3% акрил амид, 0,08$ и^'-метилен-бисакриламид, 125 мМ трис-НСІ, рН 6,8, 0,1$ ДДС, 0,025!? ТЕМЕД, 0,025$ персульфат аммония. В состав разделяющего геля входили: 1% акриламид, 0,18$ N,N' -метиленбисакриламид, 375 мМ трис-HCI буфер, рН 8,9, 0,1% ДДС, 0,025$ ТЕМЕД, 0,025$ персульфат аммония. Электрофорез проводили в плоском слое геля (17x17x0,2 см,) при комнатной температуре в 25 мМ трис-глициновом буфере, рН 8,3, с 0,1$ ДДС в течение 5 часов при 150 в.

Электрофорез ДНК

Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле. В состав электродного буфера входили: 18 мМ трис, 18 мМ НоВОо, 3 мМ ЗДТА, рН 8,3. Электрофорез проводили в течение 2 часов при 150 в. Гель прокрашивали в растворе бромистого этидия 0,5 мкг/мл и положение ДНК регистрировали в ультрафиолетовом свете.

Изоэлектрическое фокусирование ДНК-полимераз

Изоэлектрическую точку ДНК-полимераз определяли на пластин- ~ 48 - ке 5% полиакриламидного геля с 2% амфолинами рН 3,5- 9,5 по методу (145). На пластинку с гелем наносили 50 мкл фермента. Изо-олектрофокусирование продолжали 14-16 часов при 400в и 4С. Для измерения рН и активности ДНК-полимераз гель фракционировали. ДНК-полимеразу элюировали 0,1 М трис-HCI буфером рН 8,0 в течение 14 часов при 0-4С. Б элюате определяли ДНК-полимеразную активность. Для измерения рН фрагменты геля выдерживали в 0,1 М KGI 14 часов.

Анализ седиментационных свойств ДНК-полимераз

Коэффициент седиментации ДНК-полимеразы о(. определяли ультрацентрифугированием фермента в линейном градиенте концентрации глицерина (10-30/), приготовленном на 0,2 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,004 М ЭДТА, 0,01 М у?-меркаптоэтанолом. На градиент объёмом 4,9 мл наслаивали ДНК-полимеразу а в объёме 50 мкл и центрифугировали на ультрацентрифуге УПР-8 в роторе РКС-40 в течение 24 часов при 40000 об/мин и 4С Параллельно в других пробирках градиента в качестве стандарта центрифугировали каталазу (11,0 s ), альдолазу (8,3 s ) и БСА (4,3 s ).

Оедиментационный анализ ДНК-полимеразы 3 проводили в линейном градиенте концентрации глицерина (5-20/D, приготовленном на 0,02 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,001 М ЭДТА, 0,3 М KCI. На градиент объёмом 4,9 мл наслаивали 100 мкл ДНК-полимеразы А . В качестве маркеров использовали растворы альдолази и альбумина из сыворотки человека (3,6 S ). Центрифугировали в ультрацентрифуге К-32, ротор С-45, 18 часов при 30000 об/мин и 0-4С.

Градиенты раскапывали в пробирки. Во фракциях градиента определяли ДНК-полимеразную активность. Положение белков-марке-роЕ регистрировали по оптическому поглощению при 280 нм.

Определение ДНК-полимеразной активности

ДНК-полимеразную активность определяли по количеству меченого Рнітимидинмонофосфата, включившегося в кислотонераствори-мый продукт ДНК.

Инкубационная смесь для ДНК-полимеразы ОС в конечном объёме 150 мкл содержала: по 10 нмоль каждого dNTP С dATP,dGT:P,dCQ?P, ТИ? ), I мкКи pHJTTP, 20 мкг активированной ДНК, 10 мМ MgCl₂ 100 мМ трис-HCI буфер, рН 8,0. Фермент добавляли в объёме 50 мкл.

Инкубационная смесь для ДНК-полимеразы 3 в конечном объёме 150 мкл содержала: по 10 нмоль каждого dNTP ( dATP,dGTP,dCTP, ТТР ;, I мкКи [³н]тТР, 5 мкг активированной ДНК, I мМ MgCl₂ 50 мМ трис-НСІ буфер, рН 8,0, 0,1 М КСІ и фермент.

В обоих случаях реакционную смесь инкубировали I час при 25С, реакцию останавливали добавлением 100 мкл трихлоруксусной кислоты (10/0. Смесь наносили на стеклянные фильтры gp/_c ("Whatman ", Англия) и последовательно промывали Ъ% ТХУ с 1% пирофос-фатом натрия и этанолом. Радиоактивность определяли в толуольном сцинтилляторе. За единицу ДНК-полимеразной активности принимали количество фермента, катализирующего переход в кислотонераство-римую форму 10 пмоль ТМР для ДНК-полимеразы оС ш I пмоль ТМР для ДНК-полимеразы Л за I час при 25С.

Определение эндонуклеазной активности

Инкубационная смесь (100 мкл) содержала следующие компоненты: (I) 0,05 М трис-НСІ буфер, рН 7,5, 2 мкг суперкольцевой ДНК Col EI (Pi I), h мкг ДНК-полимеразы oC или fi . (2) 0,05 M нат-рий-цитратный буфер, рН 5,5, 2 мкг ДНК Col EI (РФ І), ДНК-поли-меразу оС или В . Концентрация MgCl₂ составляла 0, 5, 10 мМ. Реакционную смесь инкубировали 2 часа при 25С и образцы подвергали электрофорезу в агарозном геле.

Определение экзонуклеазной активности

Для определения экзонуклеазной активности активированную панкреатической ДНКазой ДНК застраивали высокомечеными предшественниками с помощью ДНК-полимеразы фага Т4. Инкубационная смесь в объёме 0,5 мл содержала: 20 мМ трис-НСІ буйер, рН 8,2, 2 мМ В-меркаптоэтанол, h мМ MgCl₂, 100 мкг ДНК, 100 мкг бычий сывороточный альбумин, 50 мкМ dATP, dGTP, dCTP, ттр, по h мкКи pHJ dGTP и PhJTTP, фермент. Реакционную смесь инкубировали 3 часа при 37С, прогревали 10 минут при 50С, быстро охлаждали и диализовали против 0,01 М трис-НСІ буфера, рН 7,5, до прекращения появления радиоактивной метки в диализующем растворе. Полученный препарат рн]ДНК давал более 2x10 импульсов в минуту на I мкг.

Экзонуклеазную активность определяли в инкубационной смеси, объёмом 100 мкл, состоящей из 5 мкг рН]ДНК, 4 мкг ДНК-полиме-разы d или уЗ »^- 0»05 М трис-НСІ буфера, рН 7,5 или 0,05 М нат-рий-цитратного буфера, рН 5,5 и MgCl₂ в концентрации 0, 5, 10 мМ. Смесь инкубировали 2 часа при 25С. После инкубации смесь наносили на полоску ионообменной бумаги ДЕ-8І длиной 10 см и бумажную хроматографию проводили в 5% ТХУ с I % пирофосфатом натрия. По окончании хроматографии полоску подсушивали, резали на фрагменты длиной по I см и радиоактивность просчитывали в толу-ольном сцинтилляторе.

Приготовление ДНК, содержащей одноцепочечные пробелы различной длины

Двухцепочечную ДНК фага Ф X 174 (РФ I) мягко обрабатывали панкреатической ДНКазой. Инкубационная смесь объёмом 0,5 мл содержала: 0,05 М трис-НСІ буфер, рН 7,5, 50 мкг ДНК фага а>1 174, 5 мМ MgCl2 » 20 мкг бычьего сывороточного альбумина, 0,01 мкг панкреатической ДНКазы. Реакционную смесь инкубировали при 4 С до перехода всей ДНК в ницированную кольцевую форму II. Переход ДНК из одной формы б другую контролировали электрофорезом в ага-розном геле. Реакцию останавливали добавлением сухого NaCl до концентрации I М. Омесь прогревали 10 мин при 50С и пропускали через колонку (1x15 см.) с сефадексом G -100. Элюирующий буфер содержал 0,01 М трис-НСІ, рН 7,5, 0,001 М ЭДТА. Полученную таким образом ДНК гидролизовали 10 мкг экзонуклеазы III Е.соїі в течение 15, 25, 35, 45, 60 мин в системе, содержащей: 0,05 М трис-НСІ буфер, рН 8,2, 2 мМ MgCi₂ , 5 мМ /?-меркаптоэтанол, 10 мкг БСА, при 20С. Объём смеси 0,5 мл. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до концентрации 2 мМ, прогревали 20 мин при 50С и диализовали против 0,01 М трис-НСІ буфера, рН 7,5, с 0,001 М ЭДТА в течение 15 часов. Полученную таким образом ДНК применяли для определения эффективности использования ДНК-полимеразой с* одноцепочечных пробелов различного размера.

Измерение длины одноцепочечного пробела в ДНК проводили с ДНК-полимеразой йага Т4, как описано в работе (32). Стандартная инкубационная смесь объёмом 100 мкл содержала следующие компоненты: ДНК с одноцепочечными пробелами, 20 мМ трис-НСІ буфер, рН 8,2, 2 мМ /3-меркаптоэтанол, 4 мМ MgCl₂ , 50 мкг БСА, 50 мкМ dATP, dGTP, dCTP, ТТР в системе с полным набором dNTP , и dATP

ТТР в системе с ограниченным набором dNTP . В качестве радиоактивного предшественника в обоих случаях добавляли Рн| ТТР I мкКи на пробу. Реакцию инкубировали до прекращения включения радиоактивной метки в кислотонерастворимьш продукт, примерно 2 часа при 37С. Останавливали реакцию добавлением равного объёма 10# ТХУ. Дальнейшую обработку пробы проводили, как описано ранее. Параллельно обработанную экзонуклеазой III ДНК добавляли в качестве матрицы-затравки в реакцию с ДНК-полимеразой &. Инкубацию проводили в условиях определения активности ДНК-полимеразы ОС . Полная система содержала весь набор dNTP , ограниченная - dATP и ТТР. Результаты, полученные с ДНК-полимеразой о(, сравнивали со значением величины одноцепочечного пробела в ДНК, определённой с ДНК-полимеразой фага Т4.

Приготовление линейной ДНК без одноцепочечных пробелов

ДНК из тимуса телёнка, предварительно прогидролизованную панкреатической ДНКазой на 12$, обрабатывали S I нуклеазой до прекращения появления кислоторастворимых продуктов. Инкубационная смесь объёмом I мл содержала: I мг ДНК, 0,05 М трис-ацетат-ный буфер, рН 4,6, 0,1 М ZnSO^ , 0,15 М NaCl , 5 мкг S I нукле-азы. Смесь инкубировали при 370, реакцию останавливали добавлением 3 мл холодного этанола. Высадившуюся ДНК перерастворяли в 0,01 М трис-HCI буфере, рН 7,5, и использовали для исследования свойств ДНК-полимераз.

Приготовление линейной ДНК, содержащей 3 фосфатные группы

Для приготовления ДНК с У- фосфатными группами 600 мкг ДНК тимуса телёнка гидролизовали микрококковой нуклеазой. йнкубаци- онная смесь в объёме I мл содержала: 50 мМ трис-HCI буфер, рН 9, 2 мМ Mg0i₂ , разные концентрации микрококковой нуклеазы. Смесь инкубировали 20 мин при 37С, охлаждали во льду и добавляли ЗДТА до конечной концентрации 4 мМ. К 0,5 мл реакционной смеси добавляли равный объём I М HCIO_if, центрифугировали при 5000 g 20 мин и в надосадочной жидкости определяли содержание кислотораство-римых продуктов по оптическому поглощению при 260 нм. Вторую али-квоту прогревали 10 мин при 70С для инактивации фермента, охлаждали во льду, диализовали против 0,01 М трио-HCI, рН 7,5, 0,001 М ЗДТА. Эту ДНК использовали для определения матрично~за-травочной активности в ДНК-полимеразной реакции.

Приготовление ДНК с 3 фосфатными концами без одноцепочечных пробелов

ДНК с 3 фосфатными группами, полностью не способную поддерживать активный синтез в реакции с ДНК-полимеразой с<, (примерно на 12$ прогидролизованную микрококковой нуклеазой), обрабатывали SI нуклеазой до прекращения появления киелоторастворимых продуктов. Реакционная смесь содержала в объёме I мл: 500 мкг ДНК, 0,05 М трис-ацетатный буфер, рН 4,6, 0,1 М ZnSO^, 0,15 М NaOl 5 мкг si нуклеазы. Смесь инкубировали при 37С и реакцию останавливали добавлением 3 мл холодного этанола. Высадившуюся ДНК перерастворяли в 0,01 М трис-HCI буфере, рН 7,5 и использовали для изучения свойств ДНК-полимераз.

Исследование процессивности ДНК-полимераз

Процессивность ДНК-полимераз, т.е. число нуклеотидов, которые полимеризуются за период времени между связыванием фермента ~ 5k - с матрицей и диссоциацией от неё, определяли по методу Бамбара (4-6) с использованием в качестве субстрата природной гетеропо-лимерной ДНК. Метод основан на сравнении скорости полимеризации в присутствии ограниченного и полного наборов dNTP.

При большом избытке затравочных концов над молекулами фермента скорость полимеризации в присутствии х dNTP можно выразить уравнением: X - число сДОТР ( х= I, 2, 3 или 4 ) /^ - скорость полимеризации

Е - число активных молекул фермента N- среднее число нуклеотидов, включенных за цикл полимеризации л

7J. - время цикла, т.-е. время, проходящее от момента связывания фермента с матрицей, включающее полимеризацию упорядоченной последовательности &ШТ , передвижение ДНК-полимеразы вдоль матрицы-затравки, диссоциацию от неё и диффузию свободного фермента до повторного связывания с другим затравочным концом. Это выражение приложимо как к синтезу с ограниченным набором сШТР С х= I, 2 или 3 для ДНЮ, так и к синтезу с полным набором сШШР ( х=4 для ДНК). При использовании природной ДНК //, - среднее число нуклеотидов, полимеризуемых с полным набором dNTP, т.е. процессивность полимеризации.

Отношение скорости полимеризации с ограниченным и полным набором dNTP ( P_x:l/ ) для ДНК ^р_*« ⁼_{ъ ж % /Л} «~ 55 **" /V/ в конечном счете можно выразить в значениях, которые можно определить экспериментально или подсчитать. Теоретическое соотношение между процессивностью ( щ ) и коэффициентом скорости радиоактивного включения {R^_:^ ), определяемым из экспериментальных данных, можно представить в виде графика, используя уравнение, предложенное Бамбара с -$}(&}(<- "^ls'"^}

Д/ - процессивность j$_x - вероятность добавления доступного нуклеотида в любой до ступный участок ДНК. Значение S% определяется присутству ющими в инкубационной смеси dNTP и составом оснований ма трицы . I - фактор коррекции, который вводится в связи с тем, что толь ко один из dNTP является меченым. / определяется как доля, составляющая меченый dNTP по отношению ко всем включённым dNTP в реакции с ограниченным набором дезоксирибонуклеозид- трифосфатов, делённая на долю, которую составляет меченый dNTP по отношению ко всем dNTP в реакции с полным набором де зоксирибонуклео зидтрифосфатов. Зная состав оснований ДНК, используемой в качестве матрицы, мож но подсчитать *5_Х и L для любого набора dNTP , используемых в реакции на данном матрице. RХ-'Ь можно вычислить из следующего уравнения: D¹ - О -S- п х;ь - отношение метки, включенной в реакции с ограниченным С х= I, 2 или 3 ) и полным ( х= k) набором dNTP. _%fr hi їй ~ "относительное время цикла", вводится как фактор кор рекции в связи с тем, что молекулы ДНК-полимеразы в ре акции с ограниченным и полным набором dNTP могут пере мещаться от одного затравочного конца к другому с раз личной частотой. Относительное время цикла подсчитывается из соотношения скорос тей реакций, проводимых в присутствии ингибитора, который может увеличивать время цикла, не воздействуя на механизм полимериза ции сам по себе. Сравнивая степень ингибирования реакции с огра ниченным набором dNTP со степенью ингибирования реакции со все ми четырьмя dNTP , получали фактор коррекции "относительное вре мя цикла". п

Т_х _ PtjJ /)(/1, - относительное время цикла р - скорость реакции с ограниченным (/^) или полным (/ ) набором dNTP А - скорость реакции в присутствии ингибитора с ограниченным (/J / ) или полным набором dNTP (/^/ ). Используемый ингибитор должен быть конкурентным б отношении ДНК, т.е. Бзаимодействовать с ДНК-полимеразой как неактивная матрица, удлиняя время диффузии фермента от 3 концов, способных поддерживать синтез ДНК, к следующим, увеличивая, таким образом, время цикла. Ингибитор должен быть неконкурентным по отношению к dNTP , так чтобы последовательный процесс присоединения нуклео-тидов, и, следовательно, процессивность не изменялись в присутствии ингибитора. ~ 57 -

Определение средней длины матрицы, доступной ДНК-полимеразе на каждом 3 конце матрицы

Измерение средней длины матрицы проводится в условиях избытка молекул фермента над затравочными концами и подсчитываетоя из соотношения степеней включения в реакциях с ограниченным и полным наборами <шшр. _с*/а

,_х/ г - отношение степеней включения метки в реакциях с ограниченным и полным наборами <ШТР

Л* $ь ~ максимальное число нуклеотидов, которые могут быть до- X^f " j бавлены к 3 концу ДНК матрицы в реакциях с ограниченным и полным набором <штр соответственно Jf, - "средняя эффективная длина матрицы" /, - фактор коррекции меченого dNTP , зависит от состава ос- нований матрицы

Среднюю эффективную длину матрицы можно вычислить из следующего уравнения:

Л /Ч \, &

Это уравнение решается методом последовательного приближения.

Контрольные эксперименты по определению средней длины одно цепочечного пробела проводили с ДНК-полимеразой фага ТЧ. Фермент является наиболее пригодным для этой цели, поскольку он не способен осуществлять полимеризацию на одноцепочечных разрывах и заполняет брешь в цепи ДНК полностью. Численное значение сред- него размера одноцепочечного пробела в ДНК матрице, застаиваемого ДНК-полимеразой фага Т4, вычисляли по уравнению, предложенному Фишером и др. (32).

Л , Л. (_±Л

Определение концентрации ДНК

Концентрацию ДНК определяли по оптическому поглощению при 260 нм.

Определение концентрации белка

В процессе очистки ДНК-полимераз концентрацию белка в препаратах определяли по оптическому поглощению, используя формулу:

Г мг/мл J = 1,55 i>280 - 0,76 1>2бо » ^г#^{е D}280 ^{и D}260 ~ экстинк-ция исследуемого раствора при 280 и 260 нм соответственно, измеренная в кювете с длиной оптического пути, равной I см, а в остальных случаях по методу Лоури (145)

Статистическая обработка

Экспериментальные результаты подвергали статистической обработке в соответствии с рекомендациями (146). ~ 59 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Похожие диссертации на Исследование свойств ДНК-полимераз из эмбрионов морского вида ежа Sirongylocentrotus Intermedius

Создание и исследование свойств новых генетических систем на основе элементов лактозного оперона Escherichia coli Скороходова Александра Юрьевна

Исследование свойств рекомбинантных модульных транспортеров для направленной внутриклеточной доставки фотосенсибилизаторовГилязова Динара Гафуровна

Получение рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммунобиологических свойствГатыпова Екатерина Викторовна

Исследование взаимосвязи между биологическими свойствами и структурой белка оболочки вируса табачной мозаики Кошкина Татьяна Евгеньевна

Разработка рекомбинантных вакцин-кандидатов против весенней виремии карпа и исследование их иммуногенных и протективных свойствВоронова Ольга Сергеевна

Изучение свойств ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5 Голикова Лариса Николаевна

Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариотМакарова Алена Владимировна

Дизайн, конструирование и изучение свойств поли-CTL-эпитопного Т-клеточного иммуногена - кандидата ДНК-вакцины против ВИЧ-1/СПИДБелавин Павел Александрович

Исследование свойств растительной ДНК-топоизомеразы I ядер и митохондрий в системах in vitro и in vivoТарасенко, Владислав Игоревич

Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториевДаниленко, Алексей Валерьевич