Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Молекулярная биология ВИЧ-1 10
1.2. Проблемы создания вакцины против ВИЧ-1 14
1.2.1. Антигенная изменчивость ВИЧ-1 15
1.2.2. Проблемы тестирования вакцин 16
1.2.3. Значение иммунных механизмов в защите от ВИЧ-инфекции 17
1.2.4. Механизмы иммуносупрессии и имуннопатологии при ВИЧ-инфекции 19
1.3. Традиционные стратегии вакцинации 21
1.3.1. Стратегии вакцинации, основанные на использовании аттенуировашюго вируса 22
1.3.2. Стратегии вакцинации, основанные на использовании инактивированного вируса 22
1.3.3. Стратегии вакцинации, основанные на использовании рекомбинантных вирусных белков 23
1.4. Новые нетрадиционные стратегии вакцинации, основанные на использовании синтетических полиэпитопных иммуногенов 24
1.4.1. Системы доставки вакцинных конструкций на основе использования плазмидной ДНК 24
1.4.2. Системы доставки вакцинных конструкций на основе использования живых рекомбинантных векторов 25
1.4.3. Дизайн полиэпитопных иммуногенов 27
1.4.4. Синтез генов, кодирующих полиэпитопные иммуиогены 30
1.5. Вакцинный иммунитет и клиническое заболевание 31
1.6. Биологическое тестирование CTL-вакцип 32
1.6.1. Тестирование иммуногенности вакцин 32
1.7. Заключение по обзору литературы 34
2. Материалы и методы 36
2.1. Клетки, плазмиды, ферменты, питательные среды, олигоиуклеотиды 36
2.2. Экспрессия гена TCI в клетках E.coli 36
2.3. Трансфекция COS- клеток 37
2.4. ОТ-ПЦР РНК, выделенной из COS клеток 37
2.5. Получение поликлональной сыворотки к белку TRX-TCI 37
2.6. Определение ВИЧ-антигениости рекомбинантных белков GST-TCI и TRX-TCI методами ФА и иммуноблот-гибридизации 38
2.7. Получение плазмиды для клонирования гена ТСІ в эукариотической системе 38
2.8. Иммунизация мышей 39
2.9. Определение пролиферации Т-лимфоцитов 39
2.10. Определение титров антител с помощью ИФА 40
2.11. Определение количества CTL с помощью реакции ELISPOT 40
3. Результаты 41
3.1. Дизайн искусственного иммуногена, содержащего множественные CTL-эпитопы основных антигенов ВИЧ-1 41
3.2. Конструирование искусственного гена 46
3.3. Конструирование рекомбинантных плазмид для экспрессии гена ТСІ в прокариотической и эукариотической системах 58
3.3.1. Получение рекомбинантных плазмид, эксирессирующих ген ТСІ в Е.соН 58
3.3.2. Получение рекомбинантной плазмиды, экспрессирующих ген ТСІ в эукариотической системе 59
3.4. Анализ экспрессии гена по определению синтеза специфической мРЫК 65
3.5. Иммунохимическое исследование продукта гена ТСІ 66
3.6. Исследование иммуногенностй плазмидной ДНК, кодирующей белок ТСІ 66
3.6.1. Оценка количества цитотоксических Т-лимфоцитов иммунизированных животных 67
3.6.2. Оценка пролиферативной активности спленоцитов иммунизированных животных 68
3.6.3. Исследование титров антител в сыворотках крови иммунизированных животных 70
4. Обсуждение 72
Выводы 77
- Проблемы создания вакцины против ВИЧ-1
- Вакцинный иммунитет и клиническое заболевание
- Определение титров антител с помощью ИФА
- Исследование иммуногенностй плазмидной ДНК, кодирующей белок ТСІ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и его возбудитель, вирус ВИЧ-1, были открыты более 20 лет назад, и сейчас это заболевание продолжает распространяться по всему миру, охватывая как развитые, так и в развивающиеся страны. По данным ВОЗ общее количество заболевших в мире достигло уже более чем 40 млн. человек. Из них только в 2005 году около 5 млн. человек стали вновь инфицированными (htip://wwvv.unaids.org). Более 25 млн. человек уже умерли от СПИДа.
Наиболее эффективным средством предотвращения и даже искоренения многих вирусных инфекций являются вакцины, как это было продемонстрировано с вирусами оспы, полиомиелита, желтой лихорадки и кори. Несмотря на значительные усилия и инвестиции всего мирового сообщества, в случае ВИЧ-1 инфекции эффективной профилактической или терапевтической вакцины пока создать не удалось. Разработка безопасной и эффективной анти-ВИЧ/СПИД вакцины затруднена из-за ряда факторов, среди которых высокая генетическая вариабильность ВИЧ-1, недостаток знаний иммунных механизмов защиты, отсутствие релевантных и предсказуемых моделей и сложность проведения эффективных испытаний, особенно в развивающихся странах.
Известные стратегии создания вакцины против ВИЧ-1 основаны на использовании различных форм вирусного антигена, включая инактивированный вирус, модифицированный вирус, аттенуированный живой вирус, нативные белки, гениоинженерные пептиды, а также рекомбинантные бактерии, вирусы и плазмидные ДНК [1]. Каждая из этих стратегий была опробована, однако проблемы создания анти-ВИЧ-1 -вакцины до сих пор не решены. Традиционные подходы создания вакцин, основанные на использовании аттенуированного или инактивированного вируса, в случае ВИЧ-1 вообще не рассматриваются, так как в настоящее время не ясно, как получить безопасный аттенуированный вирус, а в случае убитого патогена всегда остается вероятность контаминации препарата вирусной нуклеиновой кислотой. Кроме того, использование цельновирионной вакцины или вакцины на основе отдельных белков вируса нежелательно из-за того, что отдельные фрагменты ВИЧ-1 могут подавлять иммунную систему хозяина. Уже идентифицированы пептиды ВИЧ-1, которые стимулируют антител-зависимое усиление инфекции, вызывая развитие иммунопатологии, приводят к возрастанию количества супрессорных клеток и ингибируют протективный ответ, перекрестно реагируют с белками клеток хозяина и являются потенциальными онкогенами [2].
Хотя точно не известно, какой тип иммунного ответа коррелирует с защитой от ВИЧ-1 у человека, тем не менее, многочисленные прямые доказательства, полученные в исследованиях на животных, и косвенные данные, полученные у людей, предполагают, что в контроле ВИЧ-1 инфекции у людей и SIV инфекции у macaques важную роль должны играть как клеточные, так и гуморальные механизмы защиты, включая CD4+ и CD8+ Т клетки, освобождаемые ими цитокины и хемокины, а также антитела с широким спектром нейтрализующей активности [3-7].
Несмотря на то, что в последнее время разрабатываются новые обещающие подходы, нацеленные на индукцию нейтрализующих антител [8], акцент многих исследователей сместился в сторону индукции клеточного иммунитета [9-13], так как появились убедительные доказательства, что ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ CTL), ассоциированные с ВИЧ-инфекцией, являются важными медиаторами противовирусного иммунитета и, следовательно, ВИЧ-специфические CTL могут быть важным компонентом эффективной вакцины против ВИЧ-1 [14,15]. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что в плазме ВИЧ инфицированных индивидуумов обнаружена достоверная обратная корреляция между частотой ВИЧ специфических CTL и количеством вирусной РНК [4]. Предполагается, что CTL могут защищать от ВИЧ-инфекции, так как CTL убивали ВИЧ-инфицированные клетки до того, как они нарабатывали новые вирионы [7], и, кроме того, CTL освобождали хемокины, которые ингибировали ВИЧ-инфекцию [5,6].
Учитывая стремительное распространение эпидемии СПИДа во всем мире, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение и требует создания новых подходов к разработке эффективных анти-ВИЧ вакцин и систем их доставки. Один из наиболее обещающих подходов связан с идентификацией Т- и В клеточных эпитопов в белках вируса и созданием на их основе синтетических полиэпитопных вакцин [10,16-20]. Такие вакцины будут свободны от многих недостатков, свойственных вакцинам на основе живого аттенуированного или целого инактивированного патогена, а так же на основе отдельных вирусных белков. Цель исследования
Целью данной работы явилось конструирование искусственного гюли-СТЪ-эпитопного Т-клеточного иммуногена (TCI), кандидата для использования в качестве эффективной и безопасной ДНК-вакцины против ВИЧ-1.
Задачи исследования
В ходе выполнения данной работы решались следующие задачи:
1) Проектирование поли-СТЬ-эпитопного иммуногена;
2) Синтез гена, кодирующего целевой белок;
3) Получение рекомбинантных плазмид для экспрессии целевого гена как в прокариотической, так и в эукариотической системах;
4) Доказательство антигенной специфичности и иммуногенности продуктов экспрессии целевого гена в составе рекомбинантных плазмид.
Практическая значимость работы
Сконструированная в данной работе рекомбипантная нлазмида pcDNACI является ДНК-вакцинным компонентом двух созданных во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД «Сал-ВИЧ Д» и «КомбиВИЧвак». В настоящее время проведены доклинические испытания кандидатных вакцин «КомбиВИЧвак» и «Сал-ВИЧ Д». Показано, что обе вакцины индуцируют формирование ВИЧ-специфического гуморального и клеточного ответов и не оказывают негативного воздействия на функцию основных физиологических систем организма. Полученные при иммунизации животных сыворотки обладали вируснейтрализующей активностью in vitro. В Министерстве здравоохранения и социального развития РФ и ФГУ НЦ ЭСМП проведена предрегистрационная экспертиза комплекта разработанных документов на вакцины «КомбиВИЧвак» и «САЛ-ВИЧ Д», экспертиза наименования МИБП и их лекарственной формы выпуска. В настоящее время в ГИСК им. Л.А. Тарасевича проводится экспертиза представленных документов на две кандидатные вакцины, экспертиза результатов их доклинического исследования, экспертиза качества серий вакцин и оценка воспроизводимости методик. Публикации
1. Ильичев А.А., Карпенко Л.И., Некрасова Н.А., Лебедев Л.Р., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Белавин П.А., Серегин С.С, Данилюк И.К., Бажан СИ. Использование различных систем доставки ВИЧ-1 ДНК-вакцины, кодирующей поли-CTL -эпитопный иммуноген /ЛЗестник РАМН- - 2005- - №1. - С. 41-44.
2. Bazhan S.I., Belavin PA., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Aborneva IV., Ilyichev A.A. Designing and engineering of DNA-vaccine construction encoding multiple CTL epitopes of major HIV-1 antigens. Vaccine, 2004, V. 22, P. 1672-1682.
3. Бажан СИ,, Белавин НА., Серегин СВ., Данилюк Н.К., Бабкина И.Н., Карпенко Л.И., Некрасова Н.А., Лебедев Л.Р., Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Ильичев А.А., академик РАН Сандахчиев Л.С Конструирование искусственного иммуногена, кандидата ДНК-вакцины, кодирующей множественные CTL-эпитопы ВИЧ-1. Доклады Академии наук, 2004, Т. 395, №6, С. 108-110.
4. Бажац СИ., Белавин П.А., Серегин СВ., Бабкина И.Н., Данилюк Н.К., Сандахчиев Л.С. Искусственный белок-иммуноген TCI, содержащий множественные CTL-эпитопы основных антигенов ВИЧ-1, искусственный ген TCI, кодирующий полиэпитопный белок-иммуноген ТСТ. Приоритет от 22.04.02г. Заявка №2002110800. Патент РФ №2238946, выданный 27.10.04 г.
5. Карпенко Л.И., Бажан СИ., Некрасова НА., Белавин П.А., Данилюк Н.К., Серегин С.В,, Бабкина И.Н., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Бойченко М.Н., Воробьев А,А., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С Рекомбинантная плазмидная ДНК pcDNACI, обеспечивающая экспрессию искусственного гена TCI в клетках эукариот, и рекомбииантный аттенуированпый штамм бактерий Salmonella enteritidis Е-23/pcDNACI как кандидат для конструирования живой ДНК-вакцины против вируса иммунодефицита человека. // Приоритет от 17.04.03 г. №2003111095. Решение о выдаче патента от 28.09.04 г. Апробация работы
Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: о Basic Science for Biotechnology and Medicine, Novosibirsk, Russia, September 3-7, 2006 о XVI International AIDS Conference, Toronto Canada, 13-18 August 2006 о International conference " Biotechnology and medicine , Moscow, 14-17 March 2006 о First Russian-German Workshop on Infection and Immunity, Berlin, Germany, 7 September 2005 о UK/Russian Seminar on Biothechnology: Policy Issues, International Partnerships &
Commertial Opporumitis". At the Crown Plaza Hotel, the Royal Mile, Edinburg, 16 21 October 2001 о XIlh Symposium on HIV Infection, Toulon, June 14-16, 2001 о The Increasing Threat of Infectious Diseases Ol, Bergendal, Sollentuna, Sweden, June 11-13,2001 о 5 International Conference on Molecular Biology, Moscow, June 21-26, 2001 о IVh ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on Basic Science in ISTC Activities, Novosibirsk, 23-27 April, 2001 о 7-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ", Санкт Петербург, 24-28 мая 1998 о 8-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ", Санкт Петербург, 19-24 мая 2000 о Международная конференция "Оценка спонсируемых биологических исследований в России в новом тысячилетии", Новосибирск, ГНЦ ВБ "Вектор", 2-4 сентября 1999.
Проблемы создания вакцины против ВИЧ-1
Вирус иммунодефицита человека является этиологическим агентом СПИДа. В настоящее время этот вирус, а также множество вакцинных конструкций и стратегий их применения против ВИЧ достаточно хорошо охарактеризованы и изучены. Вместе с этим проблема профилактики и лечения СПИДа остается нерешенной, так как существующие вакцины являются пока еще мало эффективными. По последним данным ВОЗ сейчас в мире 40.3 млн. человек живут с вирусом ВИЧ-1. Из них взрослых- 38 млн., детей-2.3 млн. Умерло от СПИДа в 2005 году-3.1 млн, человек. Всего же начиная с 1981 года, когда был выявлен ВИЧ-1, умерло 25 млн. человек по всему миру. Основные способы борьбы с эпидемией ВИЧ-1 в мире - превентивные меры. Они уменьшают риск заражения вирусом. Тем не менее, на сегодняшний момент, задача создания вакцины против ВИЧ-1 является самой насущной. В настоящее время в мире 17 кандидатов вакцины находятся в фазе I испытаний и четыре вакцины в фазе ІЛІ (вакцина на основе аденовирусного вектора Merck, стимулирующая антиВИЧ клеточный иммунитет находится на стадии lib). Только одна вакцина (NIH/Department of Defense s ALVAC vCP 1521 canary pox vector/AIDS VAX prime-boost vaccine) находится в фазе III (испытания в Таиланде). Безусловно, необходима эффективная вакцина, чтобы остановить распространение СПИДа во всем мире. Однако, разработка ВИЧ-вакцины является неординарной научной задачей, и сама возможность создания вакцины все еще остается дискутируемой проблемой. Сложность разработки вакцины определяется в первую очередь свойствами вируса иммунодефицита человека, его биологией. ВИЧ распространяется в основном двумя путями - половым и через кровь при использовании препаратов крови или инструменты, загрязненные кровью ВИЧ-инфицированных больных (риск вертикального пути заражения (от матери к плоду) можно уменьшить, следуя рекомендациям гинекологов и хирургов). Следовательно, эффективная вакцина должна индуцировать как системный, так и мукозальный иммунные ответы для предотвращения заражения через кровь и слизистые барьеры. Более того, ВИЧ, возможно, передается как в свободном, так и ассоциированным с клеткой (cell-associated) видах. В силу того, что свободный вирус элиминируется посредством связывания антителами, а клеточно-ассоциированиый вирус - путем активации клеточного иммунного ответа, вакцина должна «включать» оба пути иммунного ответа на инфекцию, чтобы предотвратить заражение ВИЧ-1. Наибольшее беспокойство вызывает го, что в инфицированных клетках наблюдаются высокие уровни репликации вируса.
Постоянно протекающая вирусная репликация означает, что получить иммунную защиту против вируса пе простая задача. Можно выделить несколько причин, которые препятствуют разработке надежных вакцин к ВИЧ-1: 1) высокая антигенная изменчивость ВИЧ-1; 2) отсутствие экспериментальных моделей ВИЧ-инфекции на животных; 3) отсутствие ясного понимания, какой иммунный ответ (индукция антител, или цитотоксических Т-лимфоцитов) играет ведущую роль в предотвращении или сдерживании инфекции; 4) способность ВИЧ-1 индуцировать иммуносупрессию и иммунопатологию. Ответы на эти вопросы являются критическими для создания эффективной вакцины против ВИЧ-1. Рассмотрим отмеченные проблемы создания вакцины подробнее. 1.2.1. Антигенная изменчивость ВИЧ-1 Высокая частота генетической изменчивости ВИЧ [41] - важнейший аспект, который нужно учитывать при создании вакцины против СПИД. Эта изменчивость очевидна на уровне даже одного инфицированного организма, и (несоизмеримо выше на глобальном популяционпом уровне). Из-за того, что механизм репликации вируса работает не точно, новые мутации вносятся (виртуально) в каждый, вновь образующийся вирион. Из-за того, что каждый день в организме инфицированного могут синтезироваться миллиарды уникальных вирусных частиц вирусную популяцию в организме можно считать «роем» или квази-видом. Вирусы могут так изменяться, что отдельные антитела могут нейтрализовать один вириои, но не другой в одном и том же инфицированном организме. На глобальном уровне, генетическое разнообразие вируса проявляется в четких субтипах ВИЧ-1 или изолятах, которые кластеризуются эпидемиологически в различных географических регионах. Вирус иммунодефицита неловка первого типа (ВИЧ-1), вызывающий синдром приобретенного иммунодефицита, характеризуется большой степенью генетической гетерогенности [42]. Существующая в настоящее время классификация ВИЧ-1, основанная на различиях в нуклеотидных последовательностях геномов, выделяет три основные группы ВИЧ-1 - М, N и О. ВИЧ-1, относящиеся к группе О, имеют ограниченное распространение в Восточной Африке [43]. В 1998 г. в Камеруне были выявлены варианты ВИЧ-1, значительно отличающиеся от ранее описанных вирусов. Эти варианты были объединены в новую группу - N [44]. Группа М включает абсолютное большинство вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в мире [45]. В результате проведения филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена env вирусы, относящиеся к группе М, были подразделены по крайней мере на 11 субтипов, обозначенных буквами от А до L [46].
Исследования последних лет показали, что значительную роль в увеличении генетического разнообразия ВИЧ-1 играет рекомбинация - обмен протяженными фрагментами между различными геномами вируса [47]. Более того, было показано, что некоторые варианты вирусов, являющиеся рекомбинаитными формами (Circulating Recombinant Forms - CRF s), играют значительную роль в развитии пандемии ВИЧ-1. К таким CRF относятся CRF01_AE [48], CRF02_AG [49], CRF03_AB [50], CRF04_cpx [51], CRF05_DF [52], CRF06_cpx [53]. Описаны также рекомбинантные формы ВИЧ-1, играющие основную роль в локальных эпидемиях - CRF07_BC, CRF08_BC, CRF09_cpx, CRF10_CD, CRFll_cpx, CRF12J3F, CRF13_cpx, CRF14_BG (www.hiv.lanl.gov). 1.2.2. Проблемы тестирования вакцин Отсутствие адекватных экспериментальных моделей для изучения инфекции, вызываемой ВИЧ-1, является одной из причин, сдерживающих разработку и тестирование вакцины против ВИЧ-1. ВИЧ-1 является членом обширного семейства лентивирусов приматов. Несколько видов африканских нечеловекообразных приматов эндемично поражаются видоспецифическиими вирусами, известными как simian immunodeficiency viruses (SIV) [54]. Интересно, что эти SIV обычно не вызывает заболевания у своих хозяев (host species). Недавно было показано, что изолированная популяция диких шимпанзе инфицирована вирусами очень похожими на ВИЧ-1 [55]. Эти вирусы шимпанзе, вполне возможно, произошли благодаря рекомбинации отдельных изолятов SIV. Такой ВИЧ-подобный вирус не вызывает (обычно) заболевания у шимпанзе, но считается, что в процессе зооноза инициировал эпидемию СПИДа. При рассмотрении очень тесных взаимоотношений внутри различных лентивирусов приматов, становится понятно, что СПИД может развиваться у большого количества видов приматов после инфекции селектированными STVs. Некоторые изоляты SIV, выделенные от африканских видов обезьян могут инфицировать и вызывать СПИД у азиатских видов макак [56]. В лабораторных условиях были созданы химерные вирусы, экспрессирующие гены env ВИЧ-1 в составе SIV. Некоторые из этих химерных вирусов, отнесенные к simian human immunodeficiency viruses (SHIV), также вызывают СПИД у азиатских обезьян [57]. Можно сделать вывод, что SIV- и SHIV-инфицированные макаки являются удобной моделью при изучении патогенеза СПИДа и вакцинных стратегий для предотвращения ВИЧ инфекции. 1.2.3. Значение иммунных механизмов в защите от ВИЧ-инфекции Создание вакцины против ВИЧ-1 требует ясного понимания механизмов иммунного контроля репликации ВИЧ-1. Размножение ВИЧ-1 у пациентов с острой инфекцией протекает следующим образом. Резкий «взрыв» размножения происходит в течение нескольких недель после заражения. В последующие недели почти всегда сохраняется частичная репликация вируса. Это ограниченное ингибирование вирусного распространения является следствием частично успешного антивирусного иммунного ответа. Исследованы иммунные механизмы, которые участвуют в этом процессе.
Вакцинный иммунитет и клиническое заболевание
На сегодняшний день не существует вакцин, которые бы обеспечивали 100% защиту от инфекции ВИЧ-1. Тем не менее, успехи в разработке новых подходов к созданию вакцинных стратегий на примере нечеловекообразиых обезьян позволяют надеяться, что проблема создания вакцины против ВИ4-1 может быть решена. Показано, что обезьяны, иммунизированные плазмидыой ДНК, содержащей CTL иммуноген, и/или живым рекомбинантным вектором, могли формировать частичный контроль над вирусной репликацией [165,166]. CTL память, образованная вакцинацией, быстро реагирует на репликацию вируса, ослабляя рашшй пик размножения вируса и значительно уменьшает общую вирусную нагрузку. Как результат такого уменьшения вирусной репликации, у вакцинированных мартышек значительно замедляется развитие клинического заболевания. Следует иметь в виду, что модели вирус-хозяин у нечеловекообразных обезьян и у человека отличаются. Можно считать, что низкий уровень репликации вируса у пациентов предполагает и более низкий уровень секреции вируса и, следовательно, пониженный уровень передачи вируса [167]. Если это так, то использование CTL-вакцин может замедлять распространение вируса в человеческой популяции. Вакцина, обладающая свойствами понижения уровня передачи вируса и понижения репликации вируса имеет большое значение особенно в тех районах мира, где недостаточно развита медицинская инфраструктура и низкое финансирование здравоохранения. Однако в последнее время появились сведения об ограничениях использования CTL-вакцин, по крайней мере, у нечеловекообразных обезьян. У вакцинированных обезьян, с наличием ранней SHTV и SIV репликации и получающих мягкий клинический курс в последствии наблюдается резкое повышение вирусной репликации и клиническое ухудшение [168,169]. Во всех этих случаях вирусы мутировали так, что позволило им избежать узнавания имеющимися CTL. Такие мутантпые вирусы становятся преобладающими у больных животных и не могут быть контролируемы CTL ответом. Они приводят к ослаблению иммунитета и, в конце концов, к летальному исходу. Таким образом, также как и в случае вакцин, индуцирующих В-клеточный ответ, избегание вирусом CTL ответа может быть основной причиной неудач при использовании CTL-вакцин.
Остается надежда на то, что накопление таких мутаций у ВИЧ-1 будет медленным в случае если иммунитет, полученный вакцинацией, сможет удержать вирусную инфекцию на низком уровне репликации. 1.6. Биологическое тестирование CTL-вакцин Как уже отмечалось, одной из причин, сдерживающих создание вакцины против ВИЧ-1, является отсутствие адекватных экспериментальных моделей. В настоящее время только шимпанзе, ближайшие родственники человека, могут быть инфицированы ВИЧ-1. Однако эти животные вряд ли являются подходящей моделью для изучения ВИЧ-инфекции. Поэтому в настоящее время акцент делается на использование экспериментальных моделей SIV и SHIV, которые позволяют моделировать ВИЧ-инфекцию на других non-human приматах. Понимание иммунологической основы защиты в модельных системах SIV, SHIV и ВИЧ-1 важно для биологического тестирования любых вакцинных кандидатов. 1,6.1- Тестирование иммуногенности вакцин Задача изучения иммуногенности вакцинных кандидатов несколько упрощается, так как в данном случае могут также использоваться мелкие животные, в частности, мыши. Однако при использовании экспериментальных моделей для тестирования иммуногенности CTL-вакцины, содержащей эпитопы, рестриктированные молекулами HLA I класса, необходимо, чтобы в состав вакцины были включены дополнительные CTL-эпитопы, распознаваемые и представляемые молекулами МНС I класса мышей и обезьян. В качестве примера можно привести результаты тестирования иммуногенности рекомбинантных анти-ВИЧ-1 полиэпитопных CTL-вакцин, созданных Ханке и соавт. [9.10]. Как уже упоминалось выше, для доставки и экспрессии этих вакцин использовались две системы доставки: либо плазмидная ДНК, либо модифицированный вирус Ankara (MVA). Чтобы оценить иммуногенность вакцинных кандидатов, оптимальные дозы, маршруты и протоколы вакцинации на мышах BALB/c и обезьянах Macaque rhesus, в состав иммуногенов были включены, кроме двадцати HLA-эпитопов, один мышиный CTL-эпитоп (H-2d) и три эпитопа Macaque rhesus (Manu-AOl, Manu-A02, Manu-BOl). Было показано, что при иммунизации мышей обе вакцины индуцировали специфические CTL-ответы и продукцию у-интерферона как при внутривенной, так и при внутримышечной инъекции. При этом внутривенный маршрут введения по сравнению с внутримышечным оказался более иммуногенным. Кроме того, в этих исследованиях было показано, что предшествующее введение модифицированного вируса Ankara снижало иммуногенность последующей вакцинации.
Оказалось, что наиболее эффективным протоколом вакцинации для индукции Т-лимфоцитов и продукции у-интерферона является режим, при котором животные сначала праймируются ДНК-вакциной, а затем бустируются MVA. Наконец, комбинированный режим вакцинации (ДНК - MVA) обезьян Macaque rhesus индуцировал у этих животных высокий уровень циркулирующих CTLs, который был сопоставим с уровнем, наблюдаемым у обезьян, инфицированных SIV [148]. Авторы отмечают, что дальнейшая оптимизация этого метода в отношении его использования на non-human обезьянах находится в процессе разработки. Таким образом, в данных исследованиях был выявлен режим вакцинации для эффективной индукции CTLs, который позволяет оценить роль этих лимфоцитов в контроле инфекций, вызываемых S1V и ВИЧ-1. Рациональная разработка вакцин, индуцирующих ответы CD8+ лимфоцитов у человека требует создания вакцинных конструкций, индуцирующих специфические ответы на каждый включенный элитой". Для тестирования иммуногенноети таких вакцинных конструкций крайне желательно использование подходящей экспериментальной модели. Как по экономическим, так и научным причинам тестирование множества плазмидных конструкций, кодирующих целевые иммуногены, в различных условиях требует, чтобы эксперименты были выполнены на мышах. Использование мышей, экспрессирующих молекулы HLA 1-го класса, дает возможность тестирования вакцинных кандидатов, разрабатываемых для человека, так как предшествующие исследования показали сходство репертуара TCDS+ У HLA-трансгенных мышей и человека [170,171]. В частности, работа Ishioka G.Y. и коллеги [172] продемонстрировала индукцию CTL CD8+ на множественные детерминанты после иммунизации ДНК плазмидой, содержащей минигенную конструкцию, кодирующую детерминанты, рестрнктнрованные HLA-A2.1 и All-аллелями. Кроме того, мыши обладают другими многочисленными уникальными экспериментальными преимуществами, которые позволяют проводить детальный анализ, обеспечивающий понимание в проектировании улучшенных вакцин. Основываясь на современных данных, можно сделать вывод, что безопасная и эффективная вакцина против СПИДа должна удовлетворять следующим требованиям: 1) Вакцина должна вызывать индукцию специфических антител. Индуцируемые антитела должны быть специфичны как к вариабельным, так и наиболее консервативным эпитопам и обладать вирус-нейтрализующей активностью, блокируя ипфекционность различных изолятов ВИЧ непосредственно в местах их размножения. Вакцина не должна вызывать индукцию антител, усиливающих инфекцию. В частности, поскольку антитела к внешней части gpl60, которые не являются нейтрализующими, могут потенцировать инфекцию, облегчая его проникновение в клетку через Fc рецепторы или рецепторы комплемента, при конструировании вакцины необходимо избегать использования эпитопов, индуцирующих ненейтрализующие антитела к внешней части этого белка. 2) Вакцина должна вызывать стойкий и надежный системный ответ ТЫ-хелперов. Этот ответ должен быть направлен против эпитопов, представляемых наиболее распространенными антигенами МНС II класса.
Определение титров антител с помощью ИФА
В качестве антигенов для проведения ИФА использовали белок TCI и смесь рекомбинантных белков Gag и Env вируса ВИЧ-1. В работе использован 96-луночный планшет CORNING. Антиген в концентрации 1 мкг/лунку и в объеме 50 мкл адсорбировали 15 часов при 4 С. Для титрования использовали разведение сывороток, начиная с 1:10 до 1:2560. В работе использован коньюгат антител кролика против IgG мыши с пероксидазой хрена («Sigma», США). При постановке реакции ELISPOT на первом этапе проводили сорбцию анти-INF-y МАТ с концентрацией 5 мкг/мл на лунку 96-луночного планшета ImmimoSpot М200. После инкубации в течение 12 ч при 4С каждую лунку дважды промывали раствором PBS и блокировали средой RPMI 1640, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку в течение 2 ч. В качестве клеток-эффекторов использовали спленоциты иммунизированных животных в концентрации Ю мл. Для стимуляции продукции INF-y суспензией клеток использовали белок TCI (1 мкг/мл) и два пептида: N15 (DRVIEWQGAYRAIR), N16 (KQIINMWQEVGKAMYA), для оценки неспецифической продукции использовали пептид ЕНЕС (отрицательный контроль). Клетки культивировали в присутствии 5% COi при 37 С в течение 24 ч. INF-y-секретирующие клетки визуализировали, используя 0,5 мкг/мл биотинилированнных анти- INF-y антитела и 0,25 мкг/мл конъюгата Avidin-HRP, Окрашивание производили добавлением субстратов для пероксидазы (4-хлор-1 -нафтол, диаминобензидин фосфат). Реакцию останавливали удалением реагентов, лунки промывали 3 раза дистиллированной водой. Подсчет количества ЮТ-у-продуцирующих клеток осуществляли с помощью микроскопа. Известно, что ВИЧ-1 индуцирует CD8+ CTL ответы путем представления своих антигенов совместно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, МНС) I класса на поверхности инфицированных клеток. При этом вирусные антигены распознаются специфическими Т лимфоцитами не как полноразмерные белки, а как короткие пептиды (8-12 а.о.), ассоциированные со специфическими молекулами МНС I класса [179,180]. Эти короткие антигенные эпитопы появляются из вирусных цитоплазматических белков в результате протеасом-опосредуемого процеесинга [181,182]. Взаимодействие пептидов с молекулами МНС имеет определенную специфичность, в результате чего только некоторые пептиды могут представляться определенным типом МНС молекул.
Так как распределение HLA-аллелей варьирует для популяций различных географических регионов, то создание эффективных вакцин против ВИЧ-1 требует индукции CTL-иммунных ответов, специфичных для подтипов вирусов, циркулирующих в данном географическом регионе. Аминокислотные последовательности CTL-эпитопов, вовлеченных в индукцию ВИЧ-1-специфичных CTL-ответов у инфицированных индивидуумов, суммированы в базе данных Los Alamos HIV Molecular Immunology Database. Для конструирования CTL-иммуногена, кандидата в ДНК-вакцину, были выбраны те из них, которые удовлетворяют следующим критериям: 1. Выбранные эпитопы индуцируют как CD8 CTL, так CD4 Th и являются представителями трех основных подтипов ВИЧ-1 - А, В и С, циркулирующих на территории России, США и Западной Европы. 2. Эпитопы выбирались из основных вирусных белков-антигенов Env, Gag, Pol и Nef. 3. Учитывались CD8+ CTL-эпитопы, которые в совокупности рестриктированы десятью различными оптимально подобранными аллелями HLA 1 класса. Как известно этого достаточно, чтобы покрыть генетическое разнообразие антигенов МНС I класса в популяции практически любого географического района [10,183,184]. Так как распределение HLA-аллелей варьирует для популяций различных географических регионов, то для предсказания CTL-эпитопов в рассмотрение принимались те пептиды, которые связываются с наиболее распространенными HLA аллелями, которые встречаются в мировой популяции в 20% случаев (см. табл. 1). К таким HLA-шшелям относятся следующие молекулы: HLA-A1, HLA-A2, HLA-A 0201, HLA-A 0205, HLA-А2.1, HLA-A3, HLA-A 1101, HLA-B7, HLA-B 3501, HLA-Cw+0301, HLA-Cw 0401. 4. Выбранные эпитопы не должны индуцировать аутоиммунные антитела, для чего в последовательностях белков ВИЧ-1 были идентифицированы районы, которые имеют локальное сходство с белками человека и соответствующие эпитопы были исключены из числа кандидатов в состав полиэпитопной вакцины [185].
Эпитопы, удовлетворяющие этим критериям, перечислены в таблице 2. Оказалось, что большинство выбранных CTL-эпитопов картируются в последовательностях нативных вирусных белков как частично, а иногда и полностью перекрывающиеся пептиды, которые в белках Env, Gag, Pol и Nef локализованы в нескольких непрерывных областях (табл. 3). Причем некоторые районы, кроме CTL-эпитопов (CDS CTL), содержат также Т-хелперные эпитопы (CD41). Именно эти антиген-активные районы выбраны в данной работе для проектирования целевого Т-клеточного иммуногена TCI. Кроме того, эти районы (все кроме лротеинкиназы и обратной транскиптазы) содержат также ряд В-кпеточных эпитопов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами (рис. 3-7). Это позволило предположить, что белок TCI будет являться активным в отношении ВИЧ-1 -позитивных сывороток. Общий дизайн ТС1-иммуногена представлен на рис. 8. Фактически целевой белок представляет собой упорядоченную последовательность фрагментов белков р17. р24, gpl20, gp41, Pol и Nef, указанных на рис. 8 и в таблице 3. При этом порядок расположения фрагментов практически не имеет никакого значения, поскольку целевой иммуноген должен представляться иммунной системе в виде коротких пептидов, ассоциированных с молекулами МНС 1 класса (см. выше). Длина белка TCI составляет 392 а.о. Белок содержит более восьмидесяти эпитопов (как CD8+ CTL, так и CD4+ Th), рестриктированных аллелями HLA I и II классов. Чтобы была возможность исследовать CTL-ответы, индуцируемые ДНК-вакциной на экспериментальных животных, в состав целевого иммуногена включены дополнительные эпитопы, представляемые молекулами МНС I класса мышей и обезьян Macaque rhesus (рис. 8). В качестве матрицы использовали либо протяжённый участок кДНК ВИЧ-1 (штамм HIV-1/EVK [174]), на котором локализованы выбранные перекрывающиеся CTL-эпитопы конкретного белка, либо частично комплементарные олигонуклеотидыые праймеры. Полученные ПЦР-фрагменты ДНК I, II и III гена TCI клонировали в составе векторной плазмиды pFH123 [173] по участкам рестрикции ВатШ и Sail в клетках E.coli XLl-blue. Эта плазмида несёт специфический полилинкер, содержащий сайты для SII-эядоиуклеаз рестрикции (в данном случае нами была использована Fold рестриктаза), позволяющая получать после стадии промежуточного клонирования ДНК с уникальными заранее запланированными «липкими» 5 -концами. В результате были получены рекомбинантные плазмиды pFH-I, pFH-II и pFH-III, содержащие фрагменты гена TCI. Для получения плазмиды pFHCI, содержащей целевой ген TCL использовали описанный выше вектор pFH123/BawHI-Sa/I., а также три фрагмента гена TCI, выделенные из плазмид pFH/I (ВатШ-Fokl - фрагмент), pFH/П (Fokl-Fokl - фрагмент) и pFH/III (Fo/d-Sall - фрагмент). В этом случае измененная структура 5 -концов фрагментов I, II и III гена TCI позволила легко осуществить их однозначную сборку с получением полноразмерного гена TCI на последнем этапе клонирования. Последовательность синтезированного гена TCI была подтверждена секвенированием.
Исследование иммуногенностй плазмидной ДНК, кодирующей белок ТСІ
Чтобы доказать, что целевой ген экспрессирует эпитопы ВИЧ-1, ген TCI был клонирован в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов pGEX-2T и рЕТ-32а (рис. 11-12). Антигенные свойства искусственного белка TCI, связанного как с GST, так и TRX белками, были исследованы в ИФА с использованием панели ВИЧ-1 позитивных сывороток больных (10 образцов) и панели ВИЧ-1 негативных человеческих сывороток (10 образцов донорской крови). Оба химерных белка 100% выявлялись на панели позитивных сывороток и не связывались пи с одной из негативных сывороток. Это подтверждает, что белок TCI обладает ВИЧ-1 антигенной активностью. Антигенные свойства белка TCI были исследованы также и с помощью иммуноблот-гибридизации (рис. 15) с МКА 29F2 и 30А6, которые связываются с эпитопом EPFRDYVDRFYKTL, локализованном как в белке р24 ВИЧ-1, так и белке TCI. Из представленных данных видно, что продукты экспрессии с плазмиды рЕТ-ТС1 (белок TRXC1) и плазмиды pGEXCl (белок GST-ТСГ) связываются с МКА к р24 ВИЧ-1, следовательно, эти белки имеют общий эпитоп с белком р24 (рис. 15Б). Этот вывод подтверждается также результатами, представленными на рис. 15В. Сыворотка кролика, иммунизированного белком TCIRX. реагирует не только с обоими рекомбинантными белками TRX-ЇСІ и GSTCI, но и узнает природный белок р24 ВИЧ-1. 3.6. Исследование иммуногенности плазмидной ДНК, кодирующей белок TCI Для оценки иммуногенности плазмидной ДНК, кодирующей поли-CTL-эпитопный иммуноген TCI использовалась рекомбинантная гшазмида pcDNACT. При этом исследовали следующие параметры иммунного ответа: ответ CTL, пролиферативный ответ лимфоцитов и титры антител. Ответ CTL оценивали по выявлению IFN-y-продуцирующих лимфоцитов в реакции ELISPOT. Полученные результаты представлены в рис. 16. Анализ иммуногенности конструкций позволяет сделать следующие выводы. Во-первых, плазмидная ДНК, кодирующая белок TCI способна индуцировать специфические CTLs у иммунизированных животных в ответ на стимуляцию спленоцитов in vitro как полноразмерным белком TCI, так и отдельными эпитопами (пептидами N15 и N16). Во-вторых, при иммунизации животных pcDNACI наблюдается четко выраженный дозозависимый эффект. Доза плазмидной ДНК 100 мкг вызывает более ранний, более высокий и более пролонгированный ответ CTL по сравнению с дозой 20 мкг.
Двукратная иммунизация животных (бустированных плазмидой pcDNACI, доза 50 мкг) приводит к выраженному увеличению CTL ответов. Особенно это оказалось заметным в группе животных, праймированных той же плазмидой при дозе 100 мкг. Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали по реакции бласттрансформации. Анализ полученных в ходе проведенного эксперимента результатов свидетельствует о том, что спленоциты, выделенные от иммунизированных животных, обнаруживают прирост пролиферации как на белок TCI, так и на пептиды N15 и N16 по сравнению с пролиферацией контрольной группы животных, иммунизированных векторной плазмидой pcDNA3.1 (рис. 17). Как и в случае CTL-ответов, увеличение дозы вакцинации или вторичная иммунизация животных вызывают увеличение пролиферативной активности спленоцитов. Отметим, что у всех иммунизированных животных на всех сроках наблюдения не выявлено какой-либо выраженной пролиферации при активации лимфоцитов in vitro гетерогенным антигеном (ЕНЕС). В то же время при стимуляции лимфоцитов, выделенных от иммунизированных животных, митогеном (конканавалином А) пролиферативный ответ лимфоцитов оставался высоким у всех животных на всех сроках наблюдения, что может свидетельствовать о том, что вводимые препараты не вызывают супрессии иммунной системы (данные не приводятся). После ДНК-иммунизации животных рекомбииантной плазмидой pcDNACI титры антител оценивали в реакции ИФА с использованием ряда антигенов, в том числе белка TCI, смеси рекомбинантных белков Gag и Env, а также лизата вируса ВИЧ-1 (см. рис. 18). Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы: 1) При иммунизации мышей плазмидой pcDNACI происходит наработка специфических антител, которые связываются как с белком TCI, так и с нативными (рекомбинантными) белками (Env, Gag) и лизатом ВИЧ-1. 2) Титры антител ко всем антигенам увеличивались, начиная с 7-Ю дня после иммунизации, и достигали максимальных значений к концу периода наблюдений (48-55 сутки). 3) У двукратно иммунизированных животных титры антител были примерно в два раза выше, чем у однократно иммунизированных животных. Успех создания вакцины против ВИЧ-1 многие исследователи в настоящее время связывают с конструированием искусственных вакцинных конструкций, индуцирующих CTL-ответы на множественные CTL-эпитопы ВИЧ-1 [9-11,20,186].
Для доставки поли-СТЬ-эпитопных ДНК-вакцин обычно используют небелковые технологии такие, как аттенуированные вирусные вектора[20,187], бактериальные векторные системы [188] или плазмидиые ДНК [9-11,20,186]. Значительные усилия в настоящее время сфокусированы на создании и тестировании новых вакцинных конструкций, обеспечивающих эффективную экспрессию, процессинг и освобождение детерминант при ДНК-иммунизации [186,189]. Вместе с этим эффективная вакцина, кроме индукции высокого уровня ответов цитотоксических Т-лимфоцитов на отобранные эпитоны, должна также обеспечить иммунный ответ против достаточно широкого спектра CTL-эпитопов определенной HLA-спсцифичности. Известные в настоящее время искусственные поли-СТС-эпитопные ДНК-вакцины кодируют не более 20 CTL-эпитопов ВИЧ-1, т.е. не более 5% от всех идентифицированных в настоящее время CTL-эпитопов (см. Los Alamos HIV Molecular Immunology Database), что не может гарантировать высокую эффективность вакцины против ВИЧ-1. Созданная в данной работе ДНК-вакцинная конструкция кодирует белок, который состоит из 392 а.о. Целевой ТС1 иммуноген содержит около 80 эпитопов (как СТЖ CTL, так и CD4 Th), которые в совокупности рестриктированы десятью различными HLA-аллелями. Чтобы исследовать CTL-ответы, индуцируемые ДНК-вакциной на экспериментальных животных, в состав целевого иммуногена включены дополнительные эпитопы, представляемые молекулами МНС I класса мышей и обезьян Macaque rhesus. Наиболее распространенная стратегия проектирования полиэпитопых конструкций основана на объединении эпитопов в "бусоподобную" конструкцию, в составе которой эпитопы представлены в виде линейно упорядоченной структуры [12,13,189]. В данной работе предложена альтернативная стратегия основанная на объединении эпитопов в виде перекрывающихся пептидов [10] согласно их расположению в нативных вирусных белках (в тех случаях, когда это возможно). В результате последовательность TCl-иммуногена была спланирована таким образом, что составляющие его фрагменты представляют собой кластеры перекрывающихся CTL-эпитопов, которые соответствуют достаточно протяженным и непрерывным 73 аминокислотным последовательностям нативных вирусных белков Env, Gag, Pol и Nef. При этом перекрывание эпитопов позволило минимизировать общую длину иммуногена. Синтез гена TCJ проведен комбинированным способом с использованием ПТДР, специально рассчитанных «гибридных» олигонуклеотидов-праймеров и кДНК ВИЧ-1. Для доказательства, что искусственный белок TCJ является иммуноактивным в отношении ВИЧ-1-позитивных сывороток, ген, кодирующий полный набор эпитопов, клонирован в составе двух экспрессирующих плазмид в клетках E.coli. Присутствие фрагментов белков ВИЧ-1 в структуре белкового иммуногена подтверждено с помощью ИФЛ с использованием панелей ВИЧ-1-позитивных сывороток, моноклональных антител к белку р24, а также иммуноблот-гибридизации. Для оценки иммуногенности ДНК-вакцинной конструкции ген, кодирующей поли-СТЪ-эпитогшый иммуноген TCI, был клонирован в плазмиде pcDNACI.
