Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Противовирусные вакцины 11
1.1.1. Цельновирионные вакцины 14
1.1.1.1. Живые аттенуированные вакцины 14
1.1.1.2. Инактивированные вакцины 20
1.1.2. Вакцины на основе вирусных антигенов 22
1.1.2.1. Живые генно-инженерные поливалентные вакцины 27
1.1.2.2. ДНК-вакцины 29
1.2. Мукозальные вакцины 34
1.2.1. Иммунитет слизистых оболочек 34
1.2.2. Съедобные вакцины на основе трансгенных растений 42
1.2.2.1. Перенос генов из бактерий рода Agrobacterium в растения 43
1.2.2.2. Экспрессия чужеродных генов в растениях 52
1.2.2.3. Противовирусные вакцины на основе трансгенных растений 56
2. Материалы и методы 70
2.1. Материалы 70
2.1.1. Реактивы, наборы реактивов, ферменты 70
2.1.1.1. Наборы реактивов 70
2.1.1.2. Реактивы 70
2.1.1.3. Ферменты имаркеры молекулярных весов 72
2.1.2. Оборудование и материалы 72
2.1.3. Бактериальные штаммы, плазмиды 73
2.1.4. Буферы, растворы, среды 73
2.1.4.1. Буферы 73
2.1.4.2. Растворы для трансформации клеток Е. coli 74
2.1.4.3. Растворы для выделения плазмидной ДНК 74
2.1.4.4. Питательные среды 75
2.1.5. Список праймеров 75
2.1.6. Наборы для проведения ИФА 76
2.1.7. Растения 77
2.2. Методы 77
2.2.1. Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции 77
2.2.2. Лигирование 78
2.2.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli 79
2.2.4. Трансформация клеток is. coli 79
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК в аналитических количествах 80
2.2.6. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК 81
2.2.7. Полимеразная цепная реакция 81
2.2.8. Введение в З'-ОН конец фрагмента ДНК a-32P-dNTP и a-33P-dNTP81
2.2.9. Гибридизация 81
2.2.10. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК 82
2.2.11. Очистка реакционной смеси для секвенирования 82
2.2.12. Анализ продукции TBI-HBsAg в тканях трансгенных растений 83
2.2.13. Иммунизация мышей 84
2.2.14. Анализ продукции антител у иммунизированных мышей 85
2.2.15. Статистическая обработка данных ИФА 86
3. Результаты и обсуждение 87
3.1. Конструирование плазмиды растительной трансформации 87
3.2. Получение плазмиды pBIN TBI-HBS 92
3.3. Перенос плазмиды pBIN TBI-HBS в клетки агробактерии 97
3.4. Создание трансгенных растений 98
3.5. Анализ интеграции целевого гена в геном растений 99
3.6. Анализ продукции белка TBI-HBsAg в трансгенных растениях... 100
3.7. Конструирование плазмиды для ДНК-вакцинации 103
3.8. Анализ иммуногенности плодов трансгенных томатов 106
4. Заключение 116
5. Выводы 121
6. Благодарности 125
7. Список литературы
- Живые аттенуированные вакцины
- Оборудование и материалы
- Получение плазмиды pBIN TBI-HBS
- Анализ интеграции целевого гена в геном растений
Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирусы ВИЧ и ВГВ являются возбудителями социально значимых, опасных заболеваний.
Два миллиарда человек из числа живущих сейчас в мире в течение жизни были заражены вирусом гепатита В. Около 350 миллионов из них остаются хронически носителями вируса, а это около 5% населения планеты. Носитель в течение многих лет может заражать гепатитом В здоровых людей, у него высок риск развития цирроза или рака печени. Ежегодно регистрируется 4 миллиона случаев острого гепатита В и около одного миллиона смертельных исходов. Около 300000 новых случаев заболевания происходят ежегодно несмотря на наличие вакцины. Ситуация обстоит особенно остро в странах, эндемичных по этому заболеванию. Как правило, это развивающиеся страны. Такие государства не могут позволить себе массовую закупку лицензированных парентеральных вакцин из-за их значительной стоимости. Инъекционные вакцины имеют ограниченную пригодность, а в условиях жаркого климата многих стран дорого и трудно поддерживать необходимый режим хранения. Вирус гепатита В по-прежнему ответственен за существенную заболеваемость и смертность на планете.
По данным ВОЗ, от синдрома приобретенного иммунодефицита ежегодно умирает 2-3 млн. человек. К настоящему времени ВИЧ инфицировано около 40 млн. человек; 22 млн. людей уже умерло. Хотя активная пропаганда способов профилактики снизила темпы распространения ВИЧ в развитых странах, ежедневно на Земле заражаются примерно 15 тысяч человек.
Известно, что вакцинация - наиболее эффективный путь защиты от вирусных заболеваний. В настоящее время международные эксперты и правительства большинства стран рассматривают вакци-нопрофилактику как наиболее доступный и экономически эффективный способ снижения смертности, увеличения ожидаемой продолжительности жизни и достижения активного долголетия во всех социальных группах развитых и развивающихся стран. Вакцины ежегодно предотвращают до трех миллионов смертей. За XX столетие средняя продолжительность жизни людей увеличилась примерно на 30 лет, что в немалой степени обусловлено массовой вакцинацией.
В этой связи, разработка новых вакцин против ВИЧ и ВГВ является необходимой мерой для предотвращения дальнейшего развития этих грозных заболеваний. При этом немаловажное значение должны иметь такие преимущества новых вакцин как низкая себестоимость, безопасность, эффективность, простота хранения и использования, а также доступность. Всем этим требованиям отвечают новейшие разработки в области съедобных вакцин на основе трансгенных растений.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, содержащий антигенные детерминанты вирусов гепатита В (ВГВ) и иммунодефицита человека (ВИЧ), изучение плодов этих томатов в качестве кандидаткой съедобной вакцины против ВГВ и ВИЧ.
Для этого потребовалось решение следующих задач:
-
Создание в системе Е. coli рекомбинантной плазмиды на основе бинарного агробактериального вектора, которая несет последовательность гена TBI-HBS и способна интегрировать часть своей ДНК в геном растения. Трансформация полученной плазмидой агробакте-рии и отбор клонов агробактерии, содержащих плазмидную ДНК.
-
Получение трансгенных растений томата и подтверждение встройки гена TBI-HBS в геном отобранных растений.
-
Анализ продукции целевого белка TBI-HBsAg в полученных трансгенных растениях.
-
Анализ иммуногенности против ВГВ и ВИЧ плодов трансгенных томатов в эксперименте кормления ими мышей.
-
Получение гибридной плазмиды pcDNA-TBI-HBsAg, кодирующей целевой химерный белок TBI-HBsAg и обладающей свойствами ДНК-вакцины. Изучение влияния дополнительной ДНК-вакцинации на мышей, энтерально иммунизируемых плодами трансгенных томатов.
Научная новизна и практическая значимость работы. ВОЗ и различные другие социальные организации указывают на потребность в новых технологиях получения дополнительных вакцин против инфекционных болезней, что позволило бы увеличить глобальную иммунизированность населения и понизить стоимость вакцин.
Огромное значение придается безыгольной доставке вакцин и их термостабильности, как ключевым элементам в достижении этой цели.
В настоящей работе впервые выбрана стратегия создания съедобной вакцины на основе трансгенных растений томата.
Впервые при разработке съедобных вакцин использована химерная конструкция антигена, одновременно сочетающая свойства антигенных белков двух различных вирусов. Используя гибридный ген TBI-HBS, кодирующий синтез поверхностного антигена ВГВ и искусственного иммуногена ВИЧ, получили генетическую конструкцию, в которой целевой белок TBI-HBsAg находится под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты в составе бинарного агробактериального вектора. Созданная плазмида pBIN_TBI-HBS была использована для получения трансгенных растений томата.
Иммунизацию лабораторных животных проводили энтераль-ным введением водной взвеси порошка сушеных плодов трансгенного томата. Результаты экспериментов на лабораторных животных, впервые доказали возможность получения специфического антительного иммунного ответа при кормлении животных плодами трансгенных томатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Генетические конструкции, кодирующие химерный иммуно-генный против вирусов ВГВ и ВИЧ белок TBI-HBsAg - плазмиды pBIN_TBI-HBS HpcDNA-TBI-HBsAg.
Кормление мышей плодами трансгенного томата, экспресси-рующего белок TBI-HBsAg, приводит к развитию мукозального и системного антительных ответов против ВГВ.
Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи в реферируемых изданиях. Результаты работы представлены на международных конференциях: 9-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ" (Санкт-Петербург, 2001), International Symposium on Plant-Derived Vaccines and Antibodies: Potential and Limitations, (Annecy, France 2004), 15th International AIDS Conference (Bangkok, Thailand 2004), 13-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ" (Санкт-Петербург, 2005), Международный междисциплинарный симпозиум (Судак, Крым,
Украина 2005), 14th International Symposium on HIV and Emerging Infectious Diseases. (Toulon, France 2006), Третья международная конференция "Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехноло-гии для медицины" (Новосибирск, 2006).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Заключение» и «Выводы». Работа изложена на 151 страницах, содержит 25 рисунков, 4 таблицы. Библиография включает 238 литературных источников.
Живые аттенуированные вакцины
Основные типы противовирусных вакцин, лицензированных для клинического использования, содержат живые аттенуированные или инактивированные вирусы. Под термином живые противовирусные вакцины, как правило, подразумевают препараты аттенуированных штаммов вирусов, которые утратили свойства патогенности, но не утратили способность размножаться в организме вакцинируемого. Вакцинная инфекция обычно не сопровождается клинической картиной заболевания и приводит к формированию иммунитета к патогенным штаммам вируса.
Противооспенная вакцина - первая вакцина для крупномасштабного применения — содержит живые частицы вируса осповакцины, являющегося близким родственником вируса натуральной оспы, но неспособного в подавляющем большинстве случаев вызвать заболевание у человека. Впоследствии идея использования живых организмов для создания защитного иммунитета у человека пригодилась при создании вакцин против таких возбудителей, как вирус желтой лихорадки, кори, эпидемического паротита (свинки), полиомиелита, краснухи, ветряной оспы, аденовирусов и ротавирусов.
Живые ослабленные микроорганизмы можно использовать в качестве эффективной вакцины благодаря присущим им трем главным элементам, необходимым для формирования устойчивого иммунитета: - антиген(ы)-мишень(и), обеспечивающие формирование иммунологической памяти; - ассоциированные с патогеном молекулярные комплексы, стимулирующие врожденный иммунитет (адъювантный эффект); - присущая микроорганизмам способность проникать в организм. В результате иммунная система реагирует на ослабленного возбудителя вакцины как на полноценный патоген.
Во всех случаях, кроме осповакцины, штаммы происходят от вирусов ; человека. Такие вирусы являются мутантами исходных патогенных штаммов. Аденовирусные вакцинные штаммы (типы 4 и 7) представляют собой дикие типы вирусов человека, вызывающие бессимптомную инфекцию благодаря способу их введения и ограничению репликации в месте введения, где болезнь не развивается (Chanock et al., 1966). Одним из наиболее широко используемых вакцинных штаммов является встречающийся в природе аттенуированный вирус полиомиелита, который был идентифицирован по отсутствию вирулентности при его введении в головной и спинной мозг обезьян (вирус полиомиелита тип 2, штамм 712) (Sissons and Oldstone, 1980). Остальные вакцинные вирусы получены серийными пассажами на неприродном хозяине, ведущими к появлению мутантов, размножение которых в организме человека частично ограничено местом введения и (или) органом-мишью. Аттенуированные таким образом мутанты вируса краснухи или вирусов полиомиелита типа 1 и 3 отобраны путем пассирования в культуре клеток почек обезьян (Fenner, 1974; Sabin and Boulger, 1973). Вакцинные штаммы вируса желтой лихорадки (штамм 17D) и вируса кори получены в культуре клеток куриного эмбриона, в то время как для аттенуации вируса паротита использовали сами куриные эмбрионы (Fenner, 1974).
При работе с вирусами желтой лихорадки и полиомиелита перспективные вакцинные штаммы оценивали по их аттенуации у экспериментальных животных. Штамм 17D вируса желтой лихорадки обладает пониженным сродством к печени обезьян, и это указывает на то, что мутант может оказаться в нужной степени аттенуированным и для человека (Theiler and Smith, 1939). Это предположение было подтверждено во время последующих клинических испытаний. Аналогичным образом при введении в спинной мозг обезьянам была определена нейровирулентность встречающихся в природе и пассированных в культуре ткани штаммов вируса- полиомиелита (Sabin, 1957; Sabin and Boulger, 1973). Эту систему выбрали потому, что у обезьян клетки спинного мозга более пермиссивны в отношении нейролитического действия вируса полиомиелита, чем у человека (Sabin, 1957; Sabin and Boulger, 1973). Сначала определили наименее вирулентные для обезьян штаммы, а затем их клонировали и реклонировали методом бляшек, чтобы получить потомство с возможно более низким уровнем нейровирулентности. Полученные вирусы проверяли на добровольцах в клинических испытаниях, где была показана их удовлетворительная аттенуация и иммуногенность.
Оборудование и материалы
На 20 мкл реакционной смеси брали: рестрикционный буфер (десятикратный) - 2 мкл; плазмидная ДНК - от 0,3 до 1 мкг; вода - до конечного объема 20 мкл. Добавляли 2-10 единицы эндонуклеазы рестрикции. Инкубировали в течение 1 часа при оптимальной для фермента температуре. Наносили 10-15 мкл реакционной смеси на 1-1.5% агарозный или 4-10% полиакриламидный (в зависимости от ожидаемой длины рестриктов) гель для проведения электрофореза. При необходимости, инактивировали фермент прогревом в течение 20 мин при 65 или 80С , либо путем обработки фенолом-хлороформом и переосаждением ДНК этанолом.
Учитывали, что препараты эндонуклеаз рестрикции поставляются в буфере для хранения, содержащем 50% глицерин. Концентрация глицерина в реакционной смеси в процессе гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции не должна превышать 5% (т.е. объем добавленного препарата фермента должен быть не больше 1/10 части от объема реакционной смеси). Поэтому в случае, когда для достижения исчерпывающего гидролиза ДНК требовалось большее количество фермента, увеличивали объем реакционной смеси до 30-50 мкл, либо увеличивали время инкубации до 2-4 часов.
При необходимости гидролизовать препаративное количество плазмидной ДНК (10-20 мкг) увеличивали объем реакционной смеси вплоть до 400 мкл, а так же брали эндонуклеазу рестрикции в количестве не менее 5 единиц активности на 1 мкг ДНК.
Реакционная смесь содержала 0,2 мкг вектора, гидролизованного соответствующими эндонуклеазами рестрикции, 0,2 мкг фрагмента ДНК, также гидролизованного соответствующими эндонуклеазами рестрикции, ед.а. ДНК-лигазы фага Т4, 1/10 (от объема реакционной смеси) лигазного буфера 10х. Объем реакционной смеси, как правило, брали равным 30 мкл. Реакцию проводили в течение ночи при 4С.
Культуру клеток из музейной культуры высевали штрихом на твердую среду, ночь (14-16 часов) инкубировали в термостате при 37С. Затем отдельную колонию пересевали в 5 мл среды LB и инкубировали 14-16 часов в термостатированной качалке (180 об/мин, 37С). Утром 500 мкл этой культуры засевали в 50 мл LB и подращивали до оптической плотности D560 = 0.8. Переносили в пробирки от ротора JA-20 центрифуги J2-21 (Beckman), охлаждали во льду в течение 30 минут. Центрифугировали клетки при 4С 3000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант тщательно удаляли, осадок аккуратно ресуспендировали в 15 мл буфера RF-1. Держали во льду 15 минут и осаждали клетки при 4С и 3000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант тщательно удаляли. Осадок очень мягко ресуспендировали в 3 мл буфера RF-2 и инкубировали во льду 15 минут. Клетки расфасовывали в 1,5 мл охлажденные пробирки по 100 мкл и сразу помещали в низкотемпературный холодильник на -70С.
Эффективность трансформации проверяли, выбрав плазмиду с известной концентрацией и разбавив ее до 10" мкг/мкл. Уровень плазмидной трансформации обычно составлял 10 колоний/мкг ДНК.
В реакцию трансформации брали 100 мкл компетентных клеток, которые предварительно оттаивали во льду, и добавляли 10 мкл охлажденной лигазной смеси. Мягко перемешивали и ставили в лед на 30 минут. Затем клетки подвергали тепловому шоку при температура 42С в течение 2 мин, после чего охлаждали во льду 10 мин. Клетки высевали на чашки Петри с LB/arap, содержащие 25-100 мкг/мл ампициллина, 60 ИПТГ и X-Gal. Инкубировали в термостате при 37С в течение 16 часов.
Получение плазмиды pBIN TBI-HBS
Перенос готовой конструкции pBIN_TBI-HBS в клетки Agrobacterium tumefaciens агробактерии LBA4404 проводили с помощью трансформации методом замораживания-оттаивания совместно с сотрудниками СИФИБР СО РАН. Селекцию трансформированных колоний проводили на агаризованной среде YEP с добавлением рифампицина (селекция на присутствие хелперной плазмиды) и канамицина (селекция на наличие бинарного вектора pBINplus/Ars). Проверку трансформированных клонов агробактерии осуществляли с помощью ГЩР-скрининга. Известно, что плазмидная ДНК, выделенная из агробактерии, с малой эффективностью вступает в реакцию гидролиза ферментами рестрикции. Поэтому из отобранных с помощью ГЩР-скрининга агробактерии выделяли плазмидную ДНК, ею трансформировали штамм Е. coli XLl-Blue. После получения колоний Е. соИ и культивирования материала одной из них, плазмидную ДНК выделяли, подвергали ПЦР-анализу и гидролизу ферментами рестрикции с целью проверить наличие целевой конструкции (Рис. 18). В том случае, когда картина рестрикции плазмидной ДНК, выделенной из Е. соИ и ПЦР совпадали с ожидаемой, то и соответствующие трансформированные агробактерии несли целевую конструкцию. При этом ПЦР-анализ проводили с помощью праймеров № 5 и № 6. Таким образом, для последующего переноса целевого фрагмента ДІЖ в растения была отобрана клональная культура агробактерии штамма LBA4404, трансформированная плазмидой pBIN_TBI-HBS. Агробактериальная культура получила название LBA_TBI-HBS.
Эксплантаты для агробактериальной трансформации сотрудники СИФИБР получали из стерилизованных семян томата сорта Вентура в виде 15-20-дневных проростков (Pozueta-Romero et al., 2001). Трансформацию растений осуществляли уколом иглы, инфицированной агробактериями LBA_TBI-HBS, в раневую поверхность от удаления верхушечной почки (метод «фламинго»). Всего было трансформировано более 2000 эксплантов томата. Проростки без инфицирования агробактериями служили контролем. Инфицированные и неинфицированные агробактериями проростки культивировали in vitro в течение 15-20 суток на среде MS (Murashige and Skoog, 1962) или на специальной среде (Angenon et al., 1994), с добавлением 50 мг/л канамицина и 200 мг/л цефотаксима. Через 3-4 недели получали 900 регенерантов томата, выживших и давших корни на селективной среде с -канамицином. Регенеранты, сформированные в раневом наплыве апекса, отделяли от экспланта и переносили на такую же среду, но с меньшим содержанием цефатаксима (100 мг/л), помещали для культивирования в световую комнату с температурой 24-26С и освещением 3500-4000 лк., Далее, выжившие на селективной среде регенеранты доращивали в сосудах с почвой, а позже высаживали в гидропонные условия на фитотроне или в изолированную теплицу до получения плодов (поколение То).
Селекция на канамицине показала, что контрольные проростки не образовывали корней, останавливали рост и погибали.
Для получения поколения Ті из зрелых плодов томатов поколения То брали семена, из которых получали 7-дневные проростки, культивируемые на среде 1/2 MS с добавлением 100 мг/л цефотаксима. Затем у этих проростков отрезали корень и переносили их на ту же среду с добавлением 50 мг/л канамицина. Проростки, образовавшие корни в течение 2-2,5 недель на среде с канамицином, отбирали и переносили для доращивания и акклиматизации в специальные сосуды с водой. Через 2 недели растения переносили в вегетационные сосуды для выращивания при повышенной влажности воздуха. Затем растения высаживали в изолированную теплицу до получения плодов (поколение Ті). В результате получили 7 растений поколения Ть растения обозначили: 11-1, 11-2, 13-1, 13-2, 13-3, 13-4,4.
Из листьев растений выделяли ДНК по Ласснеру с использованием СТАВ (Lassner et al., 1989). Для подтверждения наличия встройки гена NPTII использовали олигонуклеотидные праймеры № 7, № 8 (ожидаемый размер ампликона - 487 п.н.), а для подтверждения присутствия целевого гена TBI-HBS использовали праймеры № 9 и № 10 (ожидаемый размер ампликона -498 п.н.). По данным ПНР-анализа встройка искомых генов была выявлена у растений 11-2, 13-1, 13-2, 13-4 и 4 в поколении Т0 и Т\. Длины ампликонов соответствовали ожидаемым - 487 п.н. для фрагмента NPTII (Рис. 18А) и 498 п.н. для фрагмента TBI-HBS (Рис. 18 Б). Таким образом, анализ подтвердил наличие целевого (TBI-HBS) и маркерного (NPTII) генов в тканях томата поколений Т0 и Т].
Анализ интеграции целевого гена в геном растений
С целью изучения иммуногенности плодов трансгенных томатов было проведено два эксперимента по энтеральнои иммунизации мышей. Первый из них - ориентировочный послужил базой для второго основного эксперимента.
В первом эксперименте было четыре группы мышей, которых иммунизировали свежими плодами трансгенных растений томата с содержанием HBsAg 50-100 нг/г свежего веса плода (Рис. 19). Группы I, II получали плоды трансгенных растений 13(1), 13(2), III группа получала плоды нетрансгенного томата, а контрольная группа IV получала только стандартный рацион, без томатов. Перед кормлением томатами мышей выдерживали 8 часов без пищи и воды. Животным экспериментальных групп (без изоляции отдельных животных) свежие плоды томата давали вместо стандартного рациона на 0, 7, 14 и 21 сутки по 3-6 г на 1 особь. Для анализа брали по 4 особи из каждой группы перед кормлением томатами на 0, 7, 14, 21, 28 и 42 сутки эксперимента.
В первом эксперименте плоды томата поедались мышами добровольно. При таком кормлении оказалось трудно иммунизировать всех мышей рассчитанным стандартным количеством целевого антигена. Разные мыши поедали плоды томата в разных количествах.
ИФА на антитела к HBsAg в сыворотке и фекалиях мышей проводили с использованием готового набора производства ЗАО "Вектор-Бест" D-0562, в котором рекомбинантный HBs-антиген иммобилизован на поверхности лунок полистиролового планшета, а комплекс "антиген-антитело" выявляют с помощью конъюгата рекомбинантного HBsAg с пероксидаза хрена. Набор рассчитан на определение любых типов антител к HBsAg независимо от их видового происхождения.
ИФА на антитела к TBI также в сыворотке и фекалиях мышей проводили с использованием набора производства ЗАО "Вектор-Бест" D-0172, в котором рекомбинантные антигены к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 иммобилизованы на поверхности планшета, а также входят в состав конъюгата. Любые специфические антитела, исследуемой сыворотки крови одновременно взаимодействуют с рекомбинантными антигенами иммобилизованными как на поверхности планшета, так и входящими в состав конъюгата. Набор рассчитан на определение любых антител к ВИЧ.
Для анализов забирали по 4 особи из каждой группы перед кормлением томатами, на 7, 14, 21, 28 и 42 сутки эксперимента. Образцы, взятые в один день, объединяли. На 14 сутки в фекалиях животных группы II удалось обнаружить антитела к HBsAg в концентрации 129 мМЕ/мл и антитела к белкам ВИЧ. Это указывало на формирование антительного ответа слизистой кишечника на целевой белок TBI-HBsAg в тех отдельных случаях, когда, возможно, мыши съедали дозы антигена, превышающие субиммуногенные (более 100 нг, (Warzecha et al., 2003)). В сыворотке крови животных группы II также были обнаружены антитела к HBsAg на 14 и 28 сутки от начала эксперимента в концентрациях 60 и 85 мМЕ/мл соответственно. У животных группы I содержание антител к HBsAg в концентрации около 105 мМЕ/мл было обнаружено в сыворотке крови только на 42-е сутки (Таблица 3). Ни в одном из образцов двух контрольных групп не было выявлено HBsAg-специфичных антител.
Первый эксперимент на животных показал принципиальную возможность получения специфического иммунного ответа при поедании плодов трансгенных томатов.
Для дальнейшего изучения иммуногенности подобной кандидатной съедобной вакцины на основе плодов трансгенного томата был проведен второй / эксперимент по оральной иммунизации мышей. На этот раз были взяты плоды бурой стадии созревания с высокими содержанием HBsAg, не менее 200 нг HBsAg на 1 г СВ (Рис. 20), эти плоды были лиофильно высушены, перемолоты и объединены в единую гомогенную смесь. Это позволило многократно і использовать в эксперименте по иммунизации стандартный порошок-образец. Изучали 3 группы мышей линии BALB/c. Две экспериментальные группы животных трижды получали препараты плодов трансгенного или нетрансгенного томата, по запланированной схеме иммунизации, а контрольная группа получала только стандартный рацион без томатов (Рис. 24) и (Таблица 4, дни иммунизации томатом выделены жирным шрифтом).
Препараты смесей сушеных плодов томатов разводили дистиллированной водой до концентрации 100 мг сухого томата в 1 мл и вводили животным экспериментальных групп по 1 мл принудительно в пищевод через катетер. ; Такой способ приготовления плодов и кормления был выбран с целью максимальной стандартизации эксперимента. По результатам ИФА, в вводимой нами смеси количество HBsAg составляло не менее 200 нг/мл. Такая доза была, например, в 2 раза выше эффективной оральной дозы, установленной для иммуногенного белка самосборки L1 вируса папилломы человека и приблизительно в 10 раз меньше, чем при оральной иммунизации чистым L1 белком (Gerber et al., 2001; Warzecha et al., 2003).
