Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Теоретическое обоснование получения трансгенных растений с новыми заданными признаками (обзор литературы) 16
1.1. Создание растений, устойчивых к насекомым-вредителям 18
1.2. Подавление экспрессии генов в генетической инженерии и биотехнологии растений 24
1.2.1. Использование антисмысловых РНК для подавления экспрессии генов в растениях 26
1.2.2. РНК-интерференция у растений 30
1.2.3. Применение РНК-интерференции в генетической инженерии растений 33
1.2.4. Создание растений, устойчивых к фитопатогенам 36
1.2.5. Изменение пищевых качеств трансгенных растений 38
1.2.6. Изменение метаболизма в трансгенных растениях 41
1.3. Конструирование трансгенных растений-продуцентов целевых белков 44
1.3.1. Рекомбинантные белки, экспрессируемые в растениях 46
1.3.2. Экспрессия рекомбинантных антител в трансгенных растениях 48
1.3.3. Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях 56
1.4. Получение свободных от дополнительных генетических маркеров растений 64
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования 67
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 67
2.2. Растения 67
2.3. Микробиологические среды 68
2.4. Среды для культивирования растений и протопластов 68
2.5. Реактивы, растворы и ферменты 68
2.6. Конструирование плазмид для трансформации растений 68
2.7. Трансформация растений 71
2.8. Анализ трансгенных растений 72
Глава 3. Создание и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям 81
3.1. Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений с различными вариантами гена 81
3.2. Анализ инсектицидной активности полученных трансгенных растений 85
3.3. Комбинированное использование регулируемых промоторов и технологии прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях 91
3.4. Конструирование плазмид с геном CrylA(b), пригодных для трансформации широкого круга хозяев 96
Глава 4. Подавление экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК и РНК-интерференции 100
4.1. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum L. с помощью антисмысловых РНК.. 100
4.2. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях с помощью двуцепочечных РНК 103
4.3. Фенотипические изменения трансгенных растений Nicotiana tabacum L., содержащих антисмысловую форму гена hmgl 113
Глава 5. Создание и исследование трансгенных растений Nicotiana tabacum L., экспрессирующих агробактериальные гены биосинтеза фитогормонов 128
5.1. Физиолого-биохимические особенности растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген изопентенилтрансферазы ipt 128
5.2. Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы iaaM. 140
5.3. Влияние суперпродукции ауксинов и цитокининов на фотосинтез, рост и развитие трансгенных растений табака 152
5.4. Подавление экпрессии агробактериальных онкогенов в трансгенных растениях с помощью антисмысловых РНК 156
Глава 6. Получение и анализ трансгенньгх растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) 163
6.1. Создание и молекулярно-генетический анализ растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты 164
6.2. Получение и анализ растений картофеля Solarium tuberosum L., содержащих ген HBsAg под контролем промоторов CaMV 35SS и
гена пататина ВЗЗ 172
6.3. Выделение и характеристика HBs-антигена, синтезируемого трансгенными растениями табака и картофеля 178
6.4. Тканеспецифическая экспрессия гена HBsAg в клетках трансгенных растений и культуры тканей Nicotiana tabacum L 186
6.5. Получение и анализ безмаркерных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В 194
Заключение 200
Выводы 205
Список литературы
- Использование антисмысловых РНК для подавления экспрессии генов в растениях
- Среды для культивирования растений и протопластов
- Комбинированное использование регулируемых промоторов и технологии прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях
- Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях с помощью двуцепочечных РНК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важных задач молекулярной биологии и генноинженерной экспериментальной биологии растений является получение растений с новыми заданными свойствами. В настоящее время с помощью методов метаболической инженерии и стратегии РНК-интерференции получены и исследуются трансгенные растения с измененным метаболизмом и устойчивостью к фитопатогенам, отличающиеся синтезом новых ценных биологически активных соединений для медицины, сельского хозяйства и различных промышленных технологий.
Экспрессия в трансгенных растениях генов, кодирующих ключевые ферменты биохимических путей, позволяет получить информацию о механизмах, регулирующих тот или иной метаболический путь. Направленное ингибирование таких генов предоставляет не менее ценную информацию о функции гена и позволяет изучить роль связанной с ним стадии метаболического пути. Трансформация растений генами, ответственными за синтез клеточных метаболитов, позволяет получать растения со сверхэкспрессией важных биологически активных соединений. С другой стороны, подавление экспрессии этих генов с использованием антисмысловых и интерферирующих РНК предоставляет возможность получать растения с измененными физиолого-биохимическими характеристиками и создавать растения, устойчивые к фитопатогенам.
Получение трансгенных растений - продуцентов вакцин является одним из перспективных направлений генетической инженерии. В 1990 году Всемирная Организация Здравоохранения выступила с предложением о необходимости создания вакцин нового поколения. Новые вакцины должны быть безопасны, недороги, удобны в использовании и не требовать особых условий хранения. В настоящее время разрабатываются технологии производства субъединичных вакцин нового поколения на основе трансгенных растений. Трансгенные растения могут стать альтернативой для получения дешевых и безопасных вакцин по сравнению с их традиционными продуцентами. Растительные клетки имеют энзиматические системы посттрансляционной модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуногенные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ. Показано, что растения, синтезирующие вирусные и бактериальные антигены, имеют перспективы применения в качестве съедобных вакцин. В настоящее время в мире создаются и исследуются трансгенные растения в качестве продуцентов вакцин против различных возбудителей болезней человека, в том числе и вакцины против вируса гепатита В. Однако коммерческие вакцинные препараты на основе трансгенных растений до сих пор не созданы и на этом пути предстоит еще решение задач фундаментальной и прикладной генетической инженерии.
На пути применения трансгенных растений для сельского хозяйства, промышленных технологий и медицины стоят задачи получения биологически и экологически безопасных трансгенных растений. Получение биологически безопасных трансгенных растений, не содержащих селективных или репортерных генов, является одной из актуальных задач современной биотехнологии растений.
Разработка векторных конструкций, методов трансформации растений и экспериментальных моделей для системного анализа трансгенных растений с новыми биологически активными соединениями имеет важное значение как для молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений, так и для применения таких растений в сельском хозяйстве и фармакологии.
Цель и задачи исследования. Цель работы - получение и анализ трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения, для повышения устойчивости растений к патогенам, получения растений с новыми физиолого-биохимическими признаками, а также для получения растений - продуцентов вакцин.
В соответствии с целью были определены следующие задачи:
-
получение и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям;
-
использование стратегии РНК-интерференции для получения растений с новыми свойствами;
-
получение растений - продуцентов вакцин против гепатита В;
4) особое внимание уделено разработке приемов получения трансгенных растений с
повышенной биологической безопасностью.
Научная новизна работы. Разработаны и получены новые векторные генетические конструкции для трансформации растений генами, кодирующими синтез различных биологически активных соединений, а также антисмысловых и двуцепочечных РНК под контролем конститутивных, индуцибельных и тканеспецифичных промоторов. Впервые проведен комплексный анализ полученных трансгенных растений. Исследована устойчивость трансгенных растений с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryAI(b), экспрессируемым под индуцибельным промотором TR1' агробактериальной маннопинсинтазы, к ряду насекомых-вредителей. Впервые показана устойчивость і?ґ-растений к действию табачного трипса Thrips tobaci и паутинного клеща Tetranychus urticae. Проанализированы прививочные варианты растений, у которых трансгенную часть с генами nptll и Ы под контролем индуцибельных промоторов TR1' и TR2' представлял только привой или подвой. Показано, что особенности индукции и экспрессии этих генов в трансгенной части растений не отличаются от своей специфичности в целых трансгенных растениях. Установлено, что продукты чужеродных генов локализованы только в трансгенной части растений.
Показана эффективность применения антисмысловых РНК и РНК-интерференции для полного ингибирования активности неомицинфосфотрансферазы II в протопластах и растениях Nicotiana tabacum.
Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие гетерологичный ген hmgl из Arabidopsis thaliana, кодирующий ключевой фермент метаболизма изопреноидов З-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазу. Впервые показано, что введение в растения антисмысловой формы гена приводит к замедлению их роста in vivo, изменению окраски и морфологии цветков, а также мужской стерильности.
Исследованы физиолого-биохимические характеристики трансгенных растений с агробактериальными генами биосинтеза цитокининов ipt и ауксинов iaaM. Повышенный синтез цитокининов изменял морфологию и биохимию растений, а также положительно влиял на фотосинтез /рґ-растений и устойчивость к стрессовым факторам (холоду, пониженной
освещенности, засоленности, условиям фотоингибирования). Растения с повышенным синтезом ауксинов претерпевали значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств.
С целью получения растений, устойчивых к агробактериальному раку, получены двойные трансформанты растений табака, несущие антисмысловые копии генов iaaM и ipt под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. При заражении трансгенных растений, несущих антисмысловые копии онкогенов, вирулентными штаммами A. tumefaciens С58 (pTiC58) и А6 (рТіАб) показано существенное вплоть до полного ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM. Проведенные исследования являются предпосылкой для получения сельскохозяйственно важных растений (виноград, плодовые культуры), невосприимчивых к агробактериальному раку.
Проанализирована возможность применения растений и культуры клеток с геном поверхностного антигена вируса гепатита В {HBsAg) под контролем различных промоторов в качестве продуцентов вакцины против гепатита В. Оптимизирована экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях. Разработаны методы выделения и очистки HBsAg из клеток трансгенных растений.
С помощью сконструированного специализированного вектора и разработанного метода отбора трансформантов созданы растения табака и томата с повышенной экспрессией гена HBsAg без дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам (без «генетического мусора»). Теоретическая и практическая значимость.
Разработанные и изученные экспериментальные модели перспективны для исследования механизмов подавления экспрессии генов в растениях с помощью антисмысловых РНК и РНК-интерференции.
Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых способов защиты растений от насекомых-вредителей и фитопатогенных бактерий.
Полученные результаты расширяют и углубляют представление о регуляторной роли фитогормонов (цитокининов и ауксинов) в растениях. Положительное влияние повышенного синтеза цитокининов может найти применение в биотехнологии растений.
Показана возможность использования трансгенных растений и клеточных культур для биосинтеза поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Уровень синтеза HBs-антигена в полученных растениях табака, картофеля и томатов достаточен для проведения доклинических испытаний на лабораторных животных. Разработаны методы выделения и очистки HBsAg из растений, что поможет в создании препарата вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений.
Сконструирован специализированный вектор и разработаны приемы получения трансгенных растений табака и томатов с повышенной экспрессией гена HBsAg, не содержащих дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Использованные методические подходы свидетельствуют о принципиальной возможности проведения отбора трансформированных растений без дополнительных селективных или репортерных генов и получения растений без этого "генетического мусора".
Результаты проведенного исследования используются в научно-исследовательской работе лаборатории биотехнологии растений Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Результаты исследований могут быть использованы различными сельскохозяйственными институтами, а также МГУ им. М.В. Ломоносова, Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Институтом фундаментальных проблем биологии РАН, Институтом общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, НПО «Табак» (г. Краснодар).
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на международных конференциях «Биология культивируемых клеток и биотехнология» (1988, 1997, 2008), всесоюзных конференциях «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1988, 1990), Международной конференции "Problems and Methods in Molecular and Cell Biology and Biotechnology" (Болгария, Каварна, 1990), всесоюзных планово-отчетных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Москва, 1992, 1993), II и III всесоюзных симпозиумах "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993, 1995), IV Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994), международном симпозиуме "Molecular Responses of Plants to Biotic and Abiotic Stresses" (Хельсинки, 1996), Международном симпозиуме"Мо1еси1аг Mechanisms of Stress Responses in Plants" (Москва, 1998), Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999), III Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), симпозиумах «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2004, 2007), Международной научно-практической конференции «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества» (Минск-Нарочь, 2005), X Международном съезде «Фитофарм-2006» (С.-Петербург, 2006), IV Съезде Общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006), VI Съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008).
Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в 1985-2008 гг. в лабораториях молекулярно-генетических взаимодействий микроорганизмов с растениями (ИБФМ РАН) и биотехнологии растений (ФИБХ РАН). На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований, ГНТП «Новейшие методы биоинженерии», Министерством науки и образования РФ (№ ЦФ 26-2002-8), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека», Программой Президиума РАН «Поддержка инноваций и разработок».
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность профессору Я.И. Бурьянову, в лаборатории которого были выполнены приоритетные исследования, положенные в основу настоящей работы. Благодарю всех соавторов по публикациям, которые оказывали неоценимую помощь на разных этапах работы. Благодарю за многочисленные ценные советы и дружескую поддержку всех сотрудников лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН.
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 122 печатные работы, из них 17 статей в рецензируемых журналах (одна из них принята в печать) и 8 статей в научных сборниках и других изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного
текста, содержит таблиц и рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы,
описания методов исследования, 4 глав собственных исследований, выводов,
библиографического списка, включающего источника, из них иностранных.
Использование антисмысловых РНК для подавления экспрессии генов в растениях
До открытия РНК-интерференции основным инструментом подавления экспрессии генов была технология антисмысловых РНК. Антисмысловые конструкции обычно состоят из инвертированной по отношению к промотору кодирующей последовательности гена. Эффективность таких конструкций для подавления экспрессии генов не всегда высокая, обычно у 5-20% полученных трансформантов наблюдается уменьшение накопления мРНК -мишени (Baulcombe, 1996; Wesley et al., 2001). Степень супрессии мРНК может варьировать у разных линий трансформантов от полного отсутствия до почти 100%-ного ингибирования (Bourque, 1995). Кроме того, ингибирование сильно зависит от гомологии между антисмысловой РНК и мРНК. Чем менее идентичны друг другу были последовательности, тем менее выражена супрессия мРНК (Elomaa et al., 1996). Показано, что в растениях ингибирование с помощью антисмысловых РНК происходит не на транскрипционном, а на посттранскрипционном уровне (Bourque, 1995).
Первые работы по использованию антисмысловых РНК появились в середине 80-х годов - сначала на протопластах, а затем на целых растениях. Антисмысловые РНК сперва применяли для подавления экспрессии маркерных генов хлорамфениколацетилтрансферазы, нопалинсинтазы, неомицинфосфотрансферазы, гигромицинфосфотрансферазы, фосфинотри-цинацетилтрансферазы (Ecker a. Davis, 1986; Зинкевич и др., 1988; Delauney et al., 1988; Sandler et al., 1988; Cornelissen a. Vandewiele, 1989). Затем стратегию антисмысловых РНК стали использовать для получения трансгенных сельскохозяйственных культур с более длительным хранением плодов, для получения растений, устойчивых к действию фитовирусов, для исследования процессов фотосинтеза, биосинтеза в растительной клетке различных метаболитов (Hamilton et al, 1995; Knight et al., 1996; Marshall et al., 1996; Waterhouse et al., 1998).
Существует большое количество публикаций, посвященных применению стратегии антисмысловых РНК для решения различных исследовательских задач. В огромном многообразии работ по данной тематике можно выделить несколько основных областей: идентификация функции гена (табл. 2), направленное изменение метаболических путей (табл. 3), улучшение свойств культурных растений (табл. 4).
Со временем исследователи обнаружили присутствие большого количества двуцепочечных siPHK в растениях, трансформированных антисмысловыми конструкциями. Это подтвердило гипотезу о том, что гомологичное спаривание смысловых и антисмысловых РНК приводит к образованию dsPHK in vivo, и такие dsPHK являются инициатором замолкания генов (сайленсинга).
Явление РНК-интерференции у растений было продемонстрировано в том же 1998 году, в котором была открыта РНК-интерференция у нематод, за счет экспрессии трансгенов с инвертированными повторами или за счет одновременной экспрессии смысловых и антисмысловых трансгенов (Waterhouse et al., 1998). Затем несколько групп исследователей получили почти абсолютную супрессию различных эндогенных и трансгенных мРНК у более 90% трансформантов, используя комплементарные последовательности генов, разделенные негомологичным линкером или интроном (Chuang a. Meyerowitz, 2000; Smith et al., 2000).
Суть РНК-интерференции можно проиллюстрировать в эксперименте по введению в растения трансгена, содержащего комплементарные друг другу части гена, разделенные спейсером или интроном (рис. 1). В клетке РНК считывается с трансгена и образует шпильку, где стебель -двуцепочечная РНК, а петля - одноцепочечная РНК, не принимающая участия в РНК-интерференции. На первом этапе двуцепочечная РНК разрезается ферментом Dicer на более коротіше 21-25 членные РНК, так называемые малые интерферирующие РНК (siPHK). Их длина специфична для каждого организма. Белки семейства Dicer являются РНКазами Ш типа (Carmell а. Наппоп, 2004). У арабидопсиса Arabidopsis thaliana 4 таких белка (Matzke a. Birchler, 2005). Процесс нарезания dsPHK на siPHK протекает в присутствии АТФ. Молекулы siPHK содержат на 3 -концах гидроксильные группы, на 5 -концах фосфатные группы, а также по 2 выступающих нуклеотида на 3 -концах. Именно такая структура обеспечивает участие siPHK в дальнейшем процессе. Следующая стадия - это распознавание и фрагментация РНК-мишени. siPHK связывается с группой белков, образуя комплекс RISC (RNA-induced silencing complex). В его состав входят ферменты хеликаза и белок семейства Argonaute (Vaucheret et al., 2004). Хеликаза раскручивает цепь siPHK и в комплексе остается только антисмысловая нить РНК. Такой комплекс распознает и связывает мишень мРНК за счет комплементарности с siPHK. Далее белок Argonaute разрезает молекулу мРНК примерно посередине, то есть действует как эндонуклеаза (slicer), расщепляя мРНК-мишень по механизму РНКазы Н (Hutvagner а. Simard, 2008). Получившиеся в результате куски мРНК теряют свою стабильность и деградируют. У растений также существует фермент РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp), который синтезирует двуцепочечную РНК на матрице мРНК, используя в качестве затравки антисмысловую цепь siPHK (амплификация siPHK) (Baulcombe, 2004). Вновьсинтезированные
Краткая схема РНК-интерференции. hpPHK шпилькообразующая РНК; dsPHK - двуцепочечная РНК; siPHK - малая интерферирующая РНК; Dicer - фермент, разрезающий dsPHK на siPHK; RISC - комплекс белков, участвующих в деградации мРНК (Waterhouse а. Helliwell, 2003). двуцепочечные РНК разрезаются ферментом Dicer, давая начало новому пулу siPHK. В комплексах RISC могут участвовать не только siPHK, но и микроРНК (miPHK) длиной около 22 нуклеотидов (Yang et al., 2007). В отличие от siPHK, miPHK кодируются собственными генами и вырезаются из шпильки в составе транскрипта.
Сейчас стратегия РНК-интерференции почти полностью заменила стратегию антисмысловых РНК в растениях. Разработаны эффективные конструкции для ингибирования экспрессии генов в растениях (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000). Показано, что наиболее эффективна для РНК-интерференции следующая структура: смысловая и антисмысловая РНК образуют стебель двуцепочечной РНК за счет комплементарности, а между ними должен находиться спейсерный участок одноцепочечной РНК. Шпилькообразная структура РНК, получающаяся в результате транскрипции таких конструкций, должна содержать как минимум 100-нуклеотидную dsPHK для эффективной индукции сайленсинга в растениях. Наиболее эффективными считаются конструкции с длиной двуцепочечного участка более 300 нуклеотидов. Использование шпилькообразующих структур для РНК-интерференции в растениях считается очень эффективным - у 70-100% трансформантов происходит подавление экспрессии генов-мишеней (Wesley et al., 2001).
Среды для культивирования растений и протопластов
В работе использовали растения табака Nicotiana tabacum L. сорта Самсун, картофеля Solanum tuberosum L. сорта Дезире, томата Lycopersicon esculentum Mill, сорта Субарктик Пленти. Стерильные растения выращивали in vitro в 0.2-1.0 л культуральных сосудах при температуре 24-26С, 16-часовом световом дне, освещенности 2 клк и влажности 65% на среде МС (Murashige a. Skoog, 1962) без фитогормонов. При культивировании трансгенных растений в среду добавляли селективный антибиотик сульфат канамицина (50 мг/л) либо гигромицин (10 мг/л). Выращивание растений in vivo проводили на станции искусственного климата "Биотрон" в условиях закрытого грунта. Перед посадкой в почву корни растений тщательно отмывали от агара и ополаскивали розовым раствором марганцовокислого калия.
Для культивирования Е. coli использовали среду LB (Маниатис и др., 1984), A. tumefaciens - YEB (Walkerpeach a. Velten, 1995), Methylovorus mays -среду К (Доронина, 1999).
Для культивирования растений и их эксплантов использовали среду МС (Murashige a. Skoog, 1962). Среда MSD4x2 для побегообразования на листовых дисках (Draper et al., 1988) содержала основные компоненты среды МС с добавлением фитогормонов 6-бензиламинопурина (БАЛ) - 1 мг/л и нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0.1 мг/л. Протопласты культивировали на среде КЗ (Nagy a. Maliga, 1976).
Все реактивы отечественного производства имели квалификацию не ниже "хч". В работе использовали агарозу фирмы «BioRad» (США); реактивы для электрофореза в полиакриламидном геле фирм «BioRad» (США) и «Serva» (Германия), додецилсульфат натрия (SDS), этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), бромистый этидий, протеиназу К фирмы "Serva"; трис-HCl, лизоцим, бычий сывороточный альбумин (BSA), ксиленцианол, бромфеноловый синий фирмы "Sigma" (США), изопропилтиогалактозид (IPTG), сефадекс G-50 («Pharmacia», Швеция), бромо-4хлоро-индолил-р-В-галактопиранозид (X-GAL) фирмы
BRL (Германия). В работе использовали эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигазу фага Т4 производства Fermentas (Литва), ДНК-полимеразу Taq (USB, США; СибЭнзим, Россия). При получении ДНК-зондов применяли набор "DNA Multiprime Labelling System" (Amersham, Англия). Для синтеза ДНК-зондов использовали радиоактивные [а-32Р]-дАТФ и [у-32Р]-дАТФ с удельной активностью 3000 Ки/ммоль (ИВЭ, Обнинск) и дезоксинуклеозид-трифосфаты, синтезированные группой технологии синтеза нуклеиновых кислот (ФИБХ РАН, Пугцино).
Для выращивания растений in vitro использовали растворы гормонов: 6-бензиламинопурина (БАЛ), нафтилуксусной кислоты (НУК), индолилуксусной кислоты (ИУК), индолилмасляной кислоты (ИМК), 2-4-Д, зеатинрибозида («Sigma», США). Для селекции бактериальных штаммов и трансформированных растений использовали коммерческие препараты антибиотиков канамицина, гигромицина, ампициллина, рифампицина, тетрациклина, стрептомицина, цефотаксима.
Генетические конструкции для трансформации растений получали с применением стандартных методов генетической инженерии(8атЬгоок et al., 1989). Плазмидную ДНК выделяли по методу Бирнбойма и Доли (Birnboim а. Doly, 1979) либо с помощью наборов Zyppy Plasmid Miniprep Kit («ZymoResearch», США). Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили согласно рекомендациям фирм-поставщиков. Нужные фрагменты ДНК после разделения в агарозном или полиакриламидном гелях выделяли, как описано (ICRO Practical Course, 1988). Для первичного скрининга трансформантов E.coli использовали процедуру лизиса бактериальной суспензии в геле (Sekar, 1987). Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 20-50 мкл при следующих условиях: 94 С - 5 мин; 25-30 циклов: 94С - 1 мин, 55-60С - 0.5-1 мин, 72С - 1-2 мин, затем 72С - 7 мин на
амплификаторе GeneAmp PCR System2400 («Perkin-Elmer», США). Полученные ПЦР-продукты клонировали в вектор pBluescript KS+. Нуклеотидную последовательность определяли по Сэнгеру (Sanger et al., 1977) с помощью набора для секвенирования («Amersham», Англия).
Перенос плазмид в A. tumefaciens осуществляли методом прямой трансформации клеток очищенной плазмидной ДНК (An et al., 1988) либо методом электропорации на приборе фирмы «BioRad» (США). Плазмидные ДНК в A. tumefaciens идентифицировали, выделяя в небольших количествах (An et al., 1988), а затем проводили гибридизацию на фильтрах по Саузерну для анализа вставки (Маниатис и др., 1984). Меченый ДНК-зонд для гибридизации на фильтрах по Саузерну получали, используя набор "Multiprime DNA labelling systems" (Amersham, Англия).
Комбинированное использование регулируемых промоторов и технологии прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях
Высокая степень защиты полученных нами трансгенных растений от повреждения некоторыми насекомыми-вредителями по-видимому связана с использованием индуцибельного промотора TR1 . Имеются данные, что двойной промотор гена маннопинсинтазы TRP-2 индуцируется в листьях растений после их раневого повреждения (Langridge et al., 1989; Teeri et al., 1989). При этом экспрессия генов с этого промотора может значительно возрастать и промотор становится сравнимым по силе с промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S). Кроме того, экспрессия генов с маннопинсинтазного промотора регулируется содержанием гормонов в тканях и различна в разных органах растения (Langridge et al., 1989; Teeri et al., 1989; Saito et al., 1991; Feltkamp et al., 1995).
С целью характеристики маннопинсинтазного промотора проведен анализ экспрессии гена nptll в различных органах растений без индукции, а также в условиях индукции промотора в листьях с помощью их механического повреждения. Проанализировано четыре линии трансгенных растений табака с геном Ы на содержание NPTII в неповрежденных листьях, стеблях и корнях (табл. 11). Уровень экспрессии гена nptll с промотора TR2 оказался различным в разных органах растений. Максимальный синтез NPTII наблюдался в корнях, наименьший - в листьях трансгенного табака. Уровень синтеза NPTII в корнях был в 10-17 раз выше, чем в интактных листьях. Это коррелирует с данными, полученными ранее при использовании репортерных генов люциферазы и Р-галактозидазы (Langridge et al., 1989; Teeri et al., 1989; Saito et al., 1991).
Поскольку экспрессия генов с маннопинсинтазного промотора должна резко возрастать после поврелсдения, был проведен анализ ферментативной активности NPTII в клетках интактных и поврежденных листьев. Активность NPT II значительно возрастала в экстрактах из поврежденных листьев через 24 ч после повреждения (табл. 11; рис. 7).
В интактных листьях чужеродный белок практически не синтезировался, в то время как в поврежденных листьях наблюдалась ферментативная активность NPTII (рис. 7). Эти данные подтверждаются количественным анализом активности белка в экстрактах из интактных и поврежденных листьев трансгенных растений. Возрастание активности NPTII в листьях наблюдалось уже через час после их повреждения. Активность фермента в поврежденных листьях через сутки была в 6-15 раз выше, чем в неповрежденной ткани (табл. 11). Ответ на индукцию был локализован в месте повреждения. Особенность локальной индукции промоторов некоторых специфических генов может оказаться важным и полезным свойством при создании трансгенных растений, в которых конститутивный синтез белка нежелателен. При повреждении листьев насекомыми индукция промотора
TR1 будет приводить к резкому возрастанию синтеза инсектицидного белка в области поврежденной ткани и вызывать гибель вредителей.
С помощью применения тканеспецифических и индуцибельных промоторов для экспрессии чужеродных генов можно отчасти решить проблему наличия чужеродных белков в трансгенных растениях, употребляемых в пищу человеком и животными. Наряду с этим можно использовать трансгенные растения в качестве только подвойной или привойной части (Рукавцова и др., 1996). Сочетание этих двух подходов перспективно для биотехнологии растений. Полученные трансгенные растения с геном Ы прививали на обычные растения либо их использовали в качестве подвоя (рис. 8). Через 4-6 недель после прививки проводили анализ активности NPTII в листьях и корнях растений (рис. 9).
Синтез белка значительно возрастал в листьях трансгенной части растения после их механического повреждения (дорожки 2, 7). В то же время активность NPTII отсутствовала в нормальной, нетрансгенной части растений - как в корнях (дорожка 5), так и в листьях (дорожки 3, 4, 8, 9). В корнях трансгенных подвоев наблюдали конститутивный синтез NPTII (дорожка 10). Активность фермента не зависела от подвойного или привойного положения трансгенной части растений, причем миграции NPTII в нетрансгенную часть привитых растений не обнаружено. Таким образом, в трансгенных привитых растениях для ряда чужеродных белков может отсутствовать их транспорт в нетрансгенную часть. Исследованный подход может быть применен в тех случаях, когда требуется синтезировать в определенной части растения какой-либо не транспортируемый чужеродный белок, не влияющий на изменение вторичного метаболизма растения (как в случае с дельта-эндотоксином В. thiiringiensis). В тех лее случаях, когда продуктами введенных генов являются ферменты, участвующие в биосинтезе низкомолекулярных соединений, следует учитывать возможность транспорта этих соединений из трансгенной части растения в нетрансгенную.
Наши данные подтверждаются экспериментами Беффа с соавт. (1995), применившими метод прививок для характеристики природы устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным бактериям Psendomonas tabaci (Beffa et al., 1995). Полученные растения табака экспрессируюшие субъединицу А1 холерного токсина, оказались в гораздо меньшей степени чувствительны к P. tabaci, что объяснялось накоплением в клетках больших количеств салициловой кислоты и конститутивным синтезом ряда PR-белков. Показано, что независимо от того, была ли трансгенная часть привойной или подвойной, синтез салициловой кислоты и PR-белков в нетрансформированной части растения не происходил.
Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях с помощью двуцепочечных РНК
Нами проведен анализ основных групп изопреноидных соединений в трансгенных растениях. Группы анализируемых изопреноидов были выбраны с учётом имеющихся данных о локализации двух путей биосинтеза изопреноидов в растениях, а именно цитоплазматического (ацетатно-мевалонатного) и хлоропластного (МЕР-пути) и специфичности связанных с ними метаболитов (Пасешниченко, 1998). Представителями группы растительных стеринов, выбранными для анализа, были ситостерин, стигмастерин и холестерин - мажорные соединения, концентрация которых в тканях достигает 1% от сухого веса. Альтернативный МЕР-путь, локализованный в хлоропластах, ассоциирован с синтезом фотосинтетических пигментов (Пасешниченко, 1998). В этой группе соединений мы проанализировали количество хлорофиллов а и & и суммарных каротиноидов в листьях растений, растущих как in vitro, так и в закрытом грунте.
Измерения показали, что во всех типах растений, культивируемых in vitro, содержание растительных стеринов, определяемых в работе, достоверно не различалось. Суммарное количество стеринов было одинаковым во всех трех вариантах растений. У растений со «смысловой» копией гена hmgl, выращенных в закрытом грунте, наблюдали повышение количества стеринов на 21% по отношению к контролю. Количество хлорофиллов а и Ъ, а также каротиноидов не изменилось ни в одной группе растений, что свидетельствует о том, что предшественники хлоропластных изопреноидов не синтезируются на мевалонатном пути.
Проведена световая микроскопия препаратов листьев растений, растущих в закрытом грунте. Сравнение фотографий срезов листьев показало, что листья контрольных растений имели рыхлую структуру, более крупные клетки, наличие воздушных полостей (рис. 27а). Листья трансформантов с антисмысловой копией гена hmgl отличались более плотной структурой ткани, клетки близко прилегали друг к другу (рис. 276). Трансформанты со смысловой ориентацией гена занимали промежуточное положение (рис. 27в). Таким образом, в клетках растений с антисмысловой формой гена происходило нарушение процессов растяжения клеток. Интересно, что подобные эффекты в структуре тканей отмечены и у мутанта арабидопсиса по гену hmgl (Suzuki et al., 2004). Предполагалось, что они могут быть связаны с нарушением экспрессии генов, регулируемых брассиностероидами. Однако экспрессия таких генов не менялась. Возможно, наблюдаемые изменения связаны с нарушением синтеза других стероидов, в частности тритерпеноидов и атипичных стероидов (Suzuki et al., 2004).
Полученные нами данные были подтверждены результатами аналогичных работ других авторов. Так, введение в растения Arabidopsis thaliana гомологичного гена hmgl в прямой ориентации не вызывало заметных фенотипических эффектов (Re et al., 1995). Хотя синтез мРНК гена hmg значительно возрастал и, как следствие, ферментативная активность 3-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазы повышалась, но количество основных изопреноидов в клетках трансгенных растений оставалось прежним. Таким образом, повышенный синтез мевалоновой кислоты не оказывал влияния на синтез конечных продуктов изопреноидного пути. Авторы объяснили этот факт наличием сложной многоуровневой системы регуляции экспрессии ОМГР в высших растениях. В работе Дэйла с соавт. (Dale et al, 1995) был раскрыт механизм регуляции активности ОМГР A. thaliana. Она осуществляется путем прямого фосфорилирования по аминокислотному остатку Ser577 с участием фермента ОМГР-киназы А (в работе использовали фермент из Brassica olearacea). Таким образом, синтез фермента, кодируемого клонированным гомологичным геном, целиком зависел от механизмов, которыми регулируется активность аналогичного эндогенного фермента. Сверхсинтез белка не приводил к появлению большого количества фермента ОМГР в активной форме. По-видимому, синтез гетерологичного фермента способен обойти механизмы регуляции, от которых зависит активность собственного фермента, что показано в работе Чаппелла с соавторами (Chappell et al.,1995), трансформировавших растения табака укороченным геном ОМГР хомячка.
В работе Годой-Хернандес с соавторами (Godoy-Hernandes et al., 1998) растения табака были трансформированы конструкциями, содержащими ген hmgl Arabidopsis thaliana, снабженный транспортным пептидом рибулозобифосфаткарбоксилазы. В растениях со смысловой формой гена не происходило сверхсинтеза изопреноидов, однако в растениях с геном hmgl в антисмысловой ориентации происходило значительное (до 50%) подавление синтеза растительных стероидов. Некоторые из растений не образовывали семян и по размерам были ниже контрольных. Однако такого же изменения морфологии цветков, как в нашей работе, отмечено не было.
