Введение к работе
Актуальность работы. Для высших растений характерно образование так называемых "вторичных" соединений, к которым относятся фенольные соединения, синтезирующиеся практически во всех клетках (Harborne, 1980; Запрометов, 1993). Установлено участие этих веществ в формировании клеточных стенок, дыхании, фотосинтезе, аллелопатии, а также защите растений от стрессовых воздействий (Лукнер, 1979; Запрометов, 1996). Они имеют и важное практическое значение. На окислительных превращениях фенольних соединений основаны технологические процессы в пищевой и легкой промышленности. В медицине широко применяются лекарственные препараты, изготовленные на их основе, которые обладают капилляроукрепляющим, противовоспалительным, антисклеротическим, противолучевым и противоопухолевым действием (Барабой, 1976, 2001; Запрометов, 1993; Куркин, 1996; Тюкавкина, 2004; Плотников, 2005).
В последнее время большое внимание исследователей обращено на растения тисса (род Taxus), обладающие способностью к синтезу уникального соединения - таксола (таксоидов), успешно используемого в терапии онкологических заболеваний (Guy, Scott 1996; Guillemard, 1999; Borekdohalska 2000; Huang, 2000; Lee, Kim 2001). Фармо-кинетические особенности таксола проявляются в способности блокировать анафазу митотического деления, связываясь с цитоскелетом раковой клетки (Bicamumpaka, 1998; Pradier, 1999, Miller, 1999; Барабой, 2001). Таксоиды представляют собой дитерпеноиды, в структуре которых присутствует 3-(М-метиламино)-3-фенилпропаноиловая структура, являющаяся производным фенольной природы. Следовательно, их биосинтез осуществляется при участии как изопреноидного, так и фенольного метаболизма. Взаимосвязь этих метаболических путей уже отмечалась в литературе (Пасешниченко, 1995). Однако данных о фенольных соединениях и их образовании в растениях тисса крайне мало (Орлова, 1977; El Moclafor, 1996; Das, 1993; Kawamura, 2000).
Поскольку растения тисса относятся к реликтовым видам и имеют ограниченный и труднодоступный ареал распространения в природе (Гумбатов 1989; Александрова, 1999), большое практическое значение приобретает инициация из них каллусных и суспензионных культур, как возможных источников биологически активных и лекарственных препаратов.
Целью настоящей работы являлось изучение фенольного метаболизма у двух представителей рода Taxus - тисса ягодного (1. скщащ/lfr\{\tfj%icc& ~~ канадского (Т. canadensis Marsh.), значительно отзияаювдйсйі Зоїшорфогва
ЦНБ имени Н.И. Желгзнова Фонд нау
Фонд научаыи литергтуры
физиологическим характеристикам, а также у инициированных из них каллусных культур
В связи с этим были поставлены следующие задачи
1 Изучить образование и состав фенольных соединений листьев стеблей
и корней тисса ягодного и тисса канадского
2 Исследовать изменения в образовании мономерных и полимерных
форм фенольных соединений и активности А-фенилаланинаммиак-тиазы
(ФАЛ) в процессе вегетации побегов тисса ягодного и тисса канадского
3 Выяснить внутритканевую и внутриклеточную локализацию
фенольных соединений в различных органах тисса
4 Получить каллусные кутьтуры тисса ягодного и тисса канадского и
гоучить их способность к сшггезу фенольных соединений
5 Исследовать изменения в содержании составе и локализации
фенольных соединений в процессе пассирования клеток тисса ягодного и
тисса канадского в устовиях in vitro
Научная новизна. Впервые проведено изучение фенольного метаболизма растений тисса (Т baccata L иТ canadensis Marsh ) значительно отличающихся по морфо-фгаиологическим характеристикам, и его изменений в условиях in vitro
Показано, что тисе ягодный характеризуется более высокой способностью к накоплению фенольных соединений (особенно флавоноидов) по сравнению с тиссом канадским При этом в обоих случаях содержание полифенов было выше в тистьях и стеблях растений, чем в корнях
Фенолъные соединения тисса представлены фенилпропаноидами и флавоноидами - флаванами (катехинами и проантоцианидинами), а также флавонолами В надземных органах растений состав фенольного комішекса более разнообразен, чем в подземных, преимущественно за счет образования флавонолов, которые не синтезируются в корнях
Показано, что образование суммы растворимых фенольных соединений, флавонолов, флаванов, проантоцинидинов и лигнина меняется по мере роста растений тисса, что в большей степени выражено в побегах первого года вегетации При этом активность ФАЛ, «ключевого» фермента биосинтеза полифенолов, не является критерием биосинтетической способности тканей
Выяснено, что инициация каллусных культур тисса зависит от онтогенетического состояния эксплантов и от содержания в них фенольных соединений Формирование каллусных клеток более интенсивно происходит
на эксплантах зимнего периода вегетации, по сравнению с таковыми летнего периода вегетации.
Показано, что в условиях in vitro фенольний метаболизм клеток тисса меняется. Это проявляется и на количественном их уровне и на качественном составе. Во время первых циклов культивирования содержание фенольных соединений в каллусных культурах значительно выше, чем в тканях интактного растения (особенно у культур тисса ягодного). По мере дальнейшего пассирования уровень фенольных соединений либо продолжает увеличиваться, что характерно для культур тисса ягодного, или может снижаться, что отмечалось у культур тисса канадского. При этом значительное содержание фенольных соединений в каллусных клетках приводит к их гибели (каллусы тисса ягодного).
Установлено, что накопление фенольных соединений в каллусных культурах тисса обусловлено активацией ФАЛ, уровень которой во всех случаях был в 3-7 раз выше, чем в исходных тканях.
Показано, что растворимые фенольные соединения (флавоноиды и фенилпропаноиды) накапливаются в вакуолях, а также в специализированных клетках - вместилищах (фенол-запасающие клетки) как в тканях интактного растения, так и в каллусных культурах. Иногда они обнаруживаются и в межклетниках. Полимерные формы фенольных соединений (лигнин) откладываются в клеточных стенках. В каллусных культурах прослеживается прямая взаимосвязь между их способностью к синтез фенольных соединений и числом клеток-вместилищ.
Научно-практическое значение. Полученные данные вносят значительный вклад в понимание особенностей образования фенольных соединений в растениях, в частности у представителей рода Taxus и инициированных из них каллусных культурах. Установление высокой способности молодых тканей тисса (побеги первого года вегетации) к накоплению фенольных соединений может быть использовано в оценке качества растительного сырья. Важное значение принадлежит и результатам о том, что высокий уровень фенольных соединений в культурах in vitro приводит к их гибели. Это еще раз свидетельствуя о разнообразной роли этих представителей вторичного метаболизма в жизни растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной ботанической конференции "Botanicgarden"(Freiburg, 2002), на V и VI Международных симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва-Пущино, 2003, 2005), V съезде
Общества физиологов растений России (Пенза 2003) VI Симпозиуме по фенолышм соединениям (Москва, 2004), региональной конференции ОФР (Орел, 2006) расширенном семігааре таборатории липидного и фенольного метаболизма ИФР РАН (Москва, 2006)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи
Структура и объем диссертации Диссертация состоит го введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования результатов и их обсуждения заключения, выводов и списка титературы Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц и 44 рисунка Список литературы содержит 361 источник, из которых 251 на иностранных языках
