Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из характерных особенностей высших растений является их способность к синтезу так называемых "вторичных соединений". Важное место среди них принадлежит чрезвычайно разнообразным по своей структуре фенольным соединениям, свойственным практически всем растительным тканям.
Фенольные соединения в недалеком прошлом считали конечными продуктами обмена ( метаболическими"отходами"), тогда как сейчас, в свете современных взглядов на физиологию, биохимию и молекулярную биологию растений, их относят к необходимым и активным клеточным метаболитам. Установлено их участие во многих окислительно-восстановительных процессах, в регуляции ряда ферментативных реакций , в процессах фотосинтеза, роста, развития и репродукции, а также в построении клеточных стенок, защите растений от механических повреждений и внедрения патогенов , в качестве сигнальных компонентов при взаимодействии с микроорганизмами и др. ( Курсанов, 1952; Запрометов, 1964, 1993; Oettmeier et. al., 1972; Harborne, 1982, 1994; Rhodes, 1985; Heilemann et.al, 1988; Matern, Kneusel, 1988; Strack, 1988).
Фенольные соединения имеют и важное практическое значение. На их окислительных превращениях основаны технологические процессы в ряде отраслей пищевой промышленности. В медицине они используются в качестве лекарственных препаратов капилляроукреп-ляющего, противовоспалительного, антисклеротического, противолучевого, противоопухолевого и иного действия (Запрометов, 1964; Барабой, 1976; Минаева, 1978).
В образовании фенольных соединений принимают участие шикиматный и ацетато-малонатный (поликетидный) пути биосинтеза. По шикиматному пути из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата происходит образование простейших фенольных соединений (протокатеховой и галловой кислот) и ароматических аминокислот (L-фенилаланина, L-тирозина, L-триптофана). Эти аминокислоты в дальнейшем используются как на синтез белка, так и фенольных соединений, а также и некоторых других веществ ( Davis, 1955; Запрометов, 1974; Crawford, 1975; Boudet et.al., 1985). До 60% всей биомассы растений синтезируется с использование углерода шикиматного пути (Jensen, 1986). Помимо шикиматного пути,
используемого, главным образом, для синтеза фенилпропаноидов и лигнина, в образовании фенольных соединений, а именно флавоноидов, принимает участие и ацетато-малонатный путь , связаный с метаболизмом жирных кислот. Из малонил-КоА ( с промежуточным образованием поликетвда) образуется кольцо А молекул флавонидов, а из продуктов шикиматного пути - кольцо В (Grisebach, 1962; Запрометов, 1964).
В изучении биосинтеза фенольных соединений к настоящему времени достигнуты значительные успехи : выяснены основные этапы, выделены и исследованы многие ферменты, принимающие участие в этих процессах, а также изучена их внутриклеточная локализация (Запрометов,1964,1993; Gross,1981; Hah 1brock,1981; Grisebach, 1984; Hrazdina, Wagner,1985; Haslam.1986; Harborne,1989).
В тоже время до сих пор не ясны механизмы регулирующие накопление фенольных соединений в тканях и клетках растений, а также причины приводящие к изменениям в их образовании. Имеющийся по этому вопросу фактический материал носит большей частью эмпирический характер и ограничивается, главным образом, данными по отдельным их классам , не касаясь рассмотрения всей совокупности синтезируемых в клетках фенольных соединений ( как мономерных, так и полимерных ). Знание же количественных закономерностей образования разнообразных по своей структуре фенольных соединений и выяснение первопричин возникновения изменений в этих процессах имеет существенное теоретическое и практическое значение.
Для изучения этих вопросов успешно используются клеточные культуры растений, сохраняющие способность к синтезу некоторых характерных для интактного растения фенольных соединений (Butcher, 1977; Dicosmo, Towers, 1983; Hinderer, Seitz, 1988; Stafford, 1991). Удобство этих культур определяется достаточной их однородностью, быстрым ростом , отсутствием влияния других тканей и органов , а также всего растения в целом (Бутенко, 1964). Стерильные условия выращивания культур позволяют строго контролировать режимы их питания и воздействия других факторов (освещение, температура и т.п.).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение особенностей фенольного метаболизма растительных клеток, отличающихся уровнем структурной организации, и поиск
факторов, определяющих их биосинтетическую способность, используя для этого обладающие интенсивным фенольным метаболизмом растения чая , а также инициированные из них гетеротрофные и фотомиксотрофные каллусные культуры. Были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать особенности фенольного метаболизма, в листьях и стеблях растений чая, используя для этой цели определение активности ключевого фермента этого процесса, а именно L-фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ), а также образование мономерных ( фенилпропаноиды, флавоноиды) и полимерных (лигнин) фенольных соединений и изучение их состава.
-
Выяснить изменения в фенольном метаболизме происходящие при введении листа и стебля чайного растения в культуру in vitro.
-
Выяснить влияние некоторых эпигенетических и генетических факторов на способность каллусных культур чайного растения к образованию фенольных соединений.
-
Изучить действие света на фенольный метаболизм каллусных культур чайного растения и оценить вклад хлоропластов в синтез различных классов фенольных соединений.
Научная новизна исследований. Впервые проведено изучение особенностей образования различных классов фенольных соединений (фенилпропаноидов, флавоноидов, лигнина) у тканей и клеток растений, отличающихся уровнем их структурной организации , на примере растений чая, характеризующихся специализированным обменом направленным на синтез и накопление веществ фенольной природы, а также инициированных из него гетротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур.
Выявлены различия в фенольном метаболизме листьев и стеблей 3-листных побегов чайного растения . В листьях интенсивность образования фенольных соединений выше, чем в стеблях, что особенно. четко проявляется в отношении образования фенилпропаноидов и флавоноидов (катехинов и флавонолов) и в значительно меньшей степени лигнина. При этом уровень активности ФАЛ не является критерием биосинтетической способности тканей чайного растения к синтезу фенольных соединений.
Показано, что введение листьев и стеблей чайного растения в культуру in vitro и выращивание их в гетротрофных (темновых) условиях приводит к- значительным изменениям в фенольном
;
метаболизме , что проявляется , как в ослаблении синтеза мономерных фенольных соединений (фенилпропаноидов и флавоноидов) на фоне увеличения синтеза полимерных ( лигнин) форм, так и в изменении качественного состава.
В каллусных культурах комплекс мономерных фенольных соединений значительно беднее по сравнению с исходными эксплантами, приближаясь к таковому корней исходного растения. В нем присутствуют, главным образом, типичные для чайного растения флаваны ( как катехины, так и проантоцианидины), а также оксибензойные кислоты, но теряется способность к образованию галловой кислоты, галлоильных эфиров катехинов и флавонол-гликозидов.
Лигнин каллусных культур, по своему строению также отличается от такового интактных растений и приближается к более простому типу лигнина, близкому к лигнину травянистых растений.
Доказано, что в каллусных культурах чайного растения способность . к синтезу фенольных соединений , особенно фенилпропаноидов и флавоноидов, зависит от состава их клеточных популяций. В случае преобладания у них характерных для интактного растения клеток с диплоидным набором хромосом (2п=30) способность к синтезу мономерных фенольных соединений выше, чем у культур содержащих клетки более высокого уровня плоидности (три- и тетра-плоидные).
Впервые показано, что образование еще одного класса характерных для чайного растения флавоноидов, а именно флавонолов ( агликоны кверцетин и кемпферол), происходит лишь после длительного выращивания калллусных культур в условиях освещения и формирования в них хлоропластоз, что свидетельствует об их участии в образовании этих фенольных соединений. Установлена зависимость образования фенольных соединений от количества хлоропластов и их ультраструктурной организации.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты имеют прежде всего теоретическое значение, расширяя наши представления о механизмах регуляции синтеза фенольных соединений в клетках растений.
Получение каллусных культур чайного растения, выяснение особенностей образования в них катехинов, установление влияния плоидности на биосинтетическую способность клеток, , а также
селекция штаммов, сохраняющих достаточно высокую способность к синтезу флаванов.в том числе и катехинов, обладающих Р-витаминной активностью, может найти применение в промышленной биотехнологии.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и демонстрировались на III, IV, V Всесоюзных симпозиумах по фенольним соединениям (Тбилиси, 1976; Ташкент, 1982; Таллин, 1987); IV, V и VII Всесоюзных (Международных) конференциях "Культура клеток растений и биотехнология" (Кишинев, 1983; Новосибирск, 1988; Москва, 1997); Международном симпозиуме "Качество чая - здоровье человечества" (Китай, 1987); IV Всесоюзном симпозиуме "Ультраструктура растений" ( Киев, 1988); VI конгрессе Федерации общества физиологов растений (Югославия, 1988); конференции " Фотосинтез и продукционный процесс" (Саратов, 1989 ); II, III съездах Всеоюзного общества физиологов растений ( Шнек, 1990 ; Санкт-Петербург, 1994 ); III, IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995, 1997), ежегодных симпозиумах "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996; Москва, 1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 40 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием объектов и методов исследования, трех глав с изложением и анализом результатов, заключения и выводов. Работа содержит 12 таблиц, 46 рисунков и список цитируемой литературы, включающий 300 ссылок, в том числе 240 иностранных.
