Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Фенольные соединения высших растений
1.1.1. Структура фенольных соединений 7
1.1.2. Биосинтез фенольных соединений 13
1.1.3. Функции фенольных соединений 16
1.2. Образование и локализация фенольных соединений в тканях высших растений in vivo и in vitro
1.2.1. Образование фенольных соединений в растениях 21
1.2.2. Культуры in vitro и их способность к синтезу фенольных соединений 24
1.2.3. Локализация фенольных соединений в клетках и тканях высших растений 27
1.3. Рододендроны и их способность к синтезу фенольных соединений
1.3.1. Ботаническое описание растений рода Rhododendron L 29
1.3.2. Образование фенольных соединений в растениях рода Rhododrendron L 30
1.3.3. Образование фенольных соединений в каллусных тканях и растениях-регенерантах рододендронов, культивируемых в условиях in vitro 32
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.1.1. Растения рода Rhododendron L. 33
2.1.2. Каллусные культуры рододендронов и условия их культивирования 33
2.1.3. Растения-регенеранты рододендронов и условия их культивирования 33
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение оводненности растительных тканей 34
2.2.2. Определение содержания хлорофилла 34
2.2.3. Определение содержания фенольных соединений 34
2.2.4. Определение активности -фенилаланинаммиак-лиазы 35
2.2.5. Определение локализации фенольных соединений 36
2.2.6. Определение состава фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии 36
2.2.7. Статистическая обработка результатов 37
Глава 3: Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Образование и локализация фенольных соединений в растениях рода Rhododendron L.
3.1.1. Морфология, рост и содержание хлорофилла в листьях и стеблях однолетних побегов рододендронов 38
3.1.2. Образование фенольных соединений в листьях и стеблях однолетних побегов рододендронов 42
3.1.3. Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы и ее изменение в процессе вегетации рододендронов 51
3.1.4. Локализация фенольных соединений в листьях и стеблях однолетних побегов рододендронов 52
3.2. Каллусные культуры рододендронов и образование в них фенольных соединений
3.2.1. Морфофизиологические характеристики каллусных культур рододендронов 58
3.2.2. Динамика роста и образование фенольных соединений в каллусных культурах рододендронов 59
3.2.3. Изменения в образовании фенольных соединений при культивировании каллусных культур рододендронов 62
3.2.4. Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы в каллусных культурах рододендронов и ее изменения в процессе культивирования 64
3.2.5. Локализация фенольных соединений в каллусных культурах рододендронов 65
3.3. Образование и локализация фенольных соединений в растениях-регенерантах рододендронов в условиях in vitro
3.3.1. Особенности роста микропобегов рододендронов и содержание в них хлорофилла 69
3.3.2. Образование фенольных соединений в растениях-регенерантах рододендронов 71
3.3.3. Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы в микропобегах рододендронов 74
3.3.4. Локализация фенольных соединений в микропобегах рододендронов 75
3.4. Состав фенольного комплекса рододендронов in vivo и in vitro
3.4.1. Состав фенольного комплекса листьев рододендронов 78
3.4.2. Состав фенольного комплекса растений-регенерантов рододендронов 82
Заключение 84
Выводы 87
Список литературы 89
- Структура фенольных соединений
- Культуры in vitro и их способность к синтезу фенольных соединений
- Растения-регенеранты рододендронов и условия их культивирования
- Морфология, рост и содержание хлорофилла в листьях и стеблях однолетних побегов рододендронов
Введение к работе
Фепольные соединения являются одними из наиболее распространенных в тканях высших растений представителями вторичного метаболизма. Они участвуют в основных процессах жизнедеятельности растительных клеток: фотосинтезе, дыхании, формировании клеточных стенок, а также защите от действия стрессовых факторов биотического и абиотического происхождения (Запрометов, 1993, 1996).
Наряду с этим, растительные полифенолы находят широкое
практическое применение. Благодаря высокой биологической активности они
успешно используются в пищевой и легкой промышленности, а также в
медицине и фармакологии в качестве веществ, обладающих
капилляроукрепляющей, нейрорегуляторной, биостатической,
иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью (Барабой, 1984; Куркин и др., 2003, 2004; Weinreb et al., 2008; Antonio, Druse, 2008).
В последнее время внимание исследователей обращено на растения рода Rhododendron L., характеризующиеся высокой способность к образованию вторичных веществ, главным образом, фенольной природы (Комисаренко и др., 1973; Дурмишидзе и др., 1981; Кемертелидзе и др., 2007). Наряду с их типичными представителями (кверцетином, мирицетином, оксибензойной, оксикоричной и хлорогеновой кислотами), в тканях рододендронов были обнаружены редкие, специфичные продукты вторичного метаболизма, такие как дафнетоксип, таксифолин, родояпонин, маттеуцинол, азалеин, успешно используемые в терапии нейродегеративных и онкологических заболеваний (Белоусов, 1995; Кемертелидзе, 2007; Chosson et. al., 1998; Willcox et al., 2004; Prakash et al., 2007).
В литературе не раз сообщалось, что многие лекарственные растения в условиях in vitro сохраняют способность к синтезу вторичных веществ. В связи с этим большое практическое значение приобретает инициация из них каллусных культур, а также культур тканей и органов, как возможных
источников биологически активных соединений (Zaprometov, 1989; Носов, 1991). Рядом авторов сообщалось о способности клеточных культур рододендронов к образованию терпеноидов и алкалоидов, однако сведения об их фенольном метаболизме практически отсутствуют.
В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение особенностей фенольного метаболизма растений рода Rhododendron L., а также инициированных из них каллусных культур и растений-регенерантов.
Были поставлены следующие задачи:
Изучить особенности образования фенольных соединений в листьях и стеблях однолетних побегов рододендронов.
Выяснить локализацию фенольных соединений в различных органах рододендронов и ее изменение в процессе вегетации.
Получить каллусные культуры рододендронов и изучить особенности образования и локализации в них фенольных соединений.
Исследовать образование и локализацию фенольных соединений в растениях-регенерантах рододендронов, культивируемых in vitro.
Изучить состав фенольных соединений рододендронов и инициированных из них растений-регенерантов.
Структура фенольных соединений
В настоящее время известно свыше 9000 соединений фенольной природы растительного происхождения, однако в связи с огромным интересом исследователей и совершенствованием методов химического анализа, число их неизменно растет.
В основу классификации фенольных соединений положен биогенетический принцип их образования, что позволяет выделить вещества, наиболее часто встречающиеся в растительных тканях (Harborne, 1980; Запрометов, 1993). К их числу относятся полифенолы с одним ароматическим кольцом - фенилпропаноиды (оксикорпчные и оксибензойные кислоты) и с двумя ароматическими кольцами - флавоноиды. Оксибензойные кислоты - соединения Сб -Сі-ряда, состоящие из бензольного ядра и одноуглеродной боковой цепи (рис. I). К числу наиболее распространенных их представителей относят прогокатеховую, ванилиновую, гентизиновую, галловую, а также и-оксибензойную кислоту, являющуюся предіиественником убихинонов и пластохинонов. Образование оксибензойных кислот в большей степени характерно для тканей покрытосеменных растений, где они обычно присутствуют в связанной форме в виде растворимых и нерастворимых коньюгатов с углеводами (Bate-Smiht, 1964; Запрометов, 1974, 1993).
Оксикоричные кислоты - соединения Сб —С3-ряда, содержащие бензольное ядро и трехуглеродную боковую цепь (рис. 2). К наиболее распространенными их представителями относятся я-оксикоричная (п-кумаровая), кофейная, феруловая и синаповая кислоты, служащие биогенетическими предшественниками подавляющего большинства фенольных соединений.
Наиболее многочисленная группа природных полифенолов представлена флавоноидами - соединениям Св -С3 -Сб-ряда, состоящими из двух бензольных ядер, связанных между собой трехуглеродной цепочкой (рис. 3). Согласно общепризнанной классификации флавоноиды делятся на 10 основных классов, исходя из степени окисленности или восстановлен ности пропанового фрагмента: катехины (флаван-3-олы), лейкоантоцианидины (флаван-3,4-диолы), дигидрохалконы, халконы, антоцианидины, флаваноны, флаванонолы (дигидрофлавонолы), флавоны, флавонолы и ауроны (Запрометов, 1993; Harborne, 1980; Harborne, Williams, 2000). В последнее время выделяют еще один класс флавоноидов -незамещенные в пирановом ядре флаваны (Запрометов 1993, 1996).
Огромное разнообразие флавоноидов достигается за счет наличия асимметрических атомов углерода в пирановом гетероцикле, а также различных схем гидроксилирования, метилирования, метоксилирования ароматических ядер. Повсеместное распространение в растительных тканях имеют такие флавоноиды, как антоцианидины (апигенин, лютеолин), катехины (эпикатехин), флавонолы (кверцетин, кемпферол, мирицетин и др.), большинство их которых находятся, преимущественно, в глпкозидированной форме. При этом довольно часто происходит ацилирование сахарных фрагментов с участием различных органических кислот (Запрометов, 1996). катехины
Лигнины представляют собой нерегулярные трехмерные полимеры фенольной природы (рис. 5 а). Они являются обязательными компонентами опорных тканей и вторичных клеточных стенок всех сосудистых растений (Запрометов, 1996; Boudet, 2000). Предшественниками лигнинов служат оксикоричные спирты, которые под действием окислительных ферментов (пероксидазы) и генерируемой в клеточных стенках перекиси водорода подвергаются глубокой полимеризации (Boerjan et al., 2003).
Строение и физико-химические свойства лигнинов зависят от видовой принадлежности растений, а также от специфики тканей (Gross, 1993, Запрометов, 1993). Рис. 5. Полимерные фенольные соединения: а — лигнин, б - таннин (проантоцианидин клюквы, тип А).
Таннины (дубильные вещества) принято делить на две группы: гидролизумые (галловые и эллаговые) и негидролизуемые (конденсированные). Гидролизуемые таннины представляют собой сложные эфиры фенолкарбоновых кислот и Сахаров, которые при кислотном или ферментативном гидролизе образуют галловую или эллаговую кислоту соответственно (Gross, 1993). Конденсированные таннины или проантоцианидины являются производными катехинов и флаван-3,4-диолов (рис. 5 б). При взаимодействии их с минеральными кислотами образуются ярко окрашенные антоцианидины. Структура и функции проантоцианидинов зависят от стереохимической природы предшественников, а также от степени их полимеризации (Schofield et al., 2001; Dixon et al., 2005). Несмотря на значительные успехи, достигнутые в изучении химии проантоцианидинов, остается множество вопросов, связанных с их обнаружением в растительных тканях. Сложность заключается в том, что у фенолнакапливающих культур весьма вероятна их сополимеризация с лигнинами (Stafford, 1988; Запрометов, 1993, 1996).
Характерной особенностью всех фенольных соединений является их способность к формированию гликозидированных, метилированных и метоксилированных форм. Кроме того, благодаря наличию в их структуре гидроксильных и карбоксильных групп, они образуют конъюгаты с сахарами, органическими кислотами, терпенами, алкалоидами и растительными аминами (Волынец, Прохорчик, 1983; Запрометов, 1993). Именно этим обусловлено огромное разнообразие растительных полифенолов.
В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении биосинтеза фенольных соединений (Запрометов, 1988, 1993; Herrman, 1995; Winkel-Shirley, 1999; Knaggs, 2003; Deluc, Barricu, 2006). Установлено, что существуют два основных пути их образования: шикиматный и ацетат-малонатный (поликетидный). Исходными веществами шикиматного пути являются продукты углеводного метаболизма - фосфоенолпируват и эритрозо-4-фосфат, образующиеся в процессах гликолиза или пентозофосфатного цикла соответственно (рис. 6). Образовавшийся при их конденсации З-дезокси-D арабиногептулозонат-7-фосфат под действием каталитических ферментов через ряд промежуточных продуктов образует шикимовую кислоту. В результате ее последующих превращений возможно образование ряда оксибензойных кислот. Основной путь использования шикимовой кислоты — образование таких ароматических кислот как L-фенилаланин и /,-тирозин.
Культуры in vitro и их способность к синтезу фенольных соединений
Культуры клеток и тканей высших растений могут служить модельными объектами исследований в различных областях науки, а также использоваться в качестве источников биологически активных веществ, имеющих широкий спектр применения в медицине и фармакологии. В значительной степени это обусловлено тем, что в условиях in vitro клетки и ткани сохраняют присущую і інтактному растению способность к синтезу вторичных соединений, в том числе фенольной природы (Носов, 1991; Zaprometov, 1989; Stafford, 1991).
В связи с этим культуры клеток и тканей могут служить удобной системой для изучения фенольного метаболизма и его роли в жизни растений.
Как отмечалось выше, культивируемые в условиях in vitro клетки растений сохраняют способность к синтезу различных соединений фенольной природы. Однако, в большинстве случаев, наблюдается обеднение их спектра и снижение биосинтетической активности, что может быть следствием изменения внутренней организации тканей, а также уровня дифференциации клеток в условиях in vitro. Исключение составляет ряд фенолнакапливающих культур, таких как Camellia sinensis, Ginkgo biloba и другие, где содержание полифенолов остается на уровне интактного растения, а в ряде случаев и превосходит его. Так, каллусные ткани Stevia rebaudiana характеризовались более высокой способностью к синтезу полифеполов по сравнению с листовыми эксплантами. Кроме того, антиоксидантная активность метанольных экстрактов каллусов была на 10 — 15% выше, чем листовых (Tadhani et al., 2007).
К числу наиболее распространенных фенольных соединений, обнаруженных в каллусных тканях многих растений, относятся оксикоричные кислоты, антоцианы, катехины, флавоны, проантоцианидины, а также лигнин.
В условиях in vitro сохраняются и некоторые особенности образования полифенолов, свойственные исходным эксплантам. Так, в каллусных культурах Camellia sinensis листового происхождения содержание растворимых фенольных соединений было выше, чем в каллусах, инициированных из стеблей. Подобный характер накопления наблюдался и в тканях интактных растений (Загоскина, 1997).
Помимо снижения уровня накопления полифенолов, в культивируемых in vitro клетках отмечалось изменение их качественного состава. В частности, в каллусных культурах чая снижалось содержание галловой кислоты и галлокатехшюв, тогда как способность к синтезу простых форм катехинов и проантоцианидинов полностью сохранялась (Запрометов, Загоскина, 1987). В суспензионной культуре и каллусных тканях шалфея {Salvia officinalis) в отличие от интактного растения, доминирующим компонентом фенольного комплекса становилась розмариновая кислота (Santos-Gomes et al., 2003).
Наряду с мономерными фенольными соединениями в клеточных культурах отмечается синтез их полимерных форм, а именно лигнина и галловых дубильных веществ. В ряде случаев, их содержание в каллусных клетках было значительно выше, чем в интактном растении (Загоскина и др. 1993; Scalbert et al., 1988; Hano, Addi, 2006).
Следует подчеркнуть, что уровень накопления полифенолов зависит как от генетических характеристик клеток, так и от условий их культивирования (минеральный и гормональный состав питательной среды, освещенность, длительность пассажа и др.), о чем не раз сообщалось в литературе (Загоскина и др., 2003; Moreno, Heijden, 1994; Rodrigues, Oliveira, 2005).
В настоящее время пристальное внимание исследователей обращено на микроразмножение растений, в котором важная роль принадлежит не только процессам морфогенеза и регенерации, но и структурно-физиологической адаптации микроклонов in vivo. В этом случае большое значение могут иметь фенольные соединения, принимающие непосредственное участие в этих процессах.
Наряду с каллусными и суспензионными культурами, растения-регенеранты в условиях in vitro сохраняют способность к синтезу полифенолов. В большинстве случаев отмечалось незначительное снижение уровня их накопления, особенно в отношении флавоноидов. Однако сообщалось и о том, что микроклоны, полученные из тканей фенолнакапливающих растений, характеризуются высокой способностью к их образованию. Например, в микропобегах Eugenia myrtifolia уровень накопления антоцианов оставался таким же высоким, как и в интактных растениях (Longo et al., 2007). Метанольные экстракты побегов шалфея {Salvia officinalis L.) и инициированных из них микроклонов практически не отличались по содержанию полифенолов и их антиоксидантной активности (Grzegorczyk et al., 2007).
Рядом авторов сообщалось о составе фенольных соединений, синтезируемых в растениях-регенерантах. Так, в микропобегах дуба {Ouercus robus), культивируемых in vitro, состав фенольного комплекса практически не отличался от такового интактных растений. Исключением являлся педункулагин, не обнаруженный в стеблях растений-регенерантов, богатых пентагаллоидными глюкозидами (Scalbert et al., 1988). Несмотря на значительные успехи, достигнутые в микроразмножении высших растений (Riseman, Chennareddy, 2004; Chitra, Padamaja, 2005; Almeida et al., 2005), остается множество вопросов, связанных с их фенольным метаболизмом, а также физиологической ролью этих веществ в тканях, культивируемых in vitro.
Растения-регенеранты рододендронов и условия их культивирования
Микропобеги Rh. smirnowii, Rh. japonicum и Rh. ledebourii были получены из листовых почек интактных растений в отделе биотехнологии Главного ботанического сада им. Цицина РАН (г. Москва). Культивирование проводили на модифицированной среде Андерсона различного гормонального состава на свету при температуре 21-23С и относительной влажности воздуха 70% (Anderson, 1984; Васильева, Александрова, 2005). Продолжительность пассажа составляла от 5 до 7 месяцев.
Для извлечения хлорофилла ткани растений измельчали до гомогенного состояния и экстрагировали 96%-ным этанолом (в темновых условиях). Содержание хлорофилла а и b определяли спектрофотометрическим методом при 665 и 649 им, соответственно (Шлык, 1971). Концентрацию пигментов рассчитывали на основании удельных коэффициентов поглощения.
Для извлечения фенольных соединений свежий растительный материал гомогенизировали и подвергали экстракции горячим 96%-ным этанолом. Экстракты использовали для спектрофотометрического определения различных классов фенольных соединений. Суммарное содержание растворимых фенольных соединений определяли с реактивом Фолина-Дениса при 725 нм, флаванов - с 1%-ным раствором ванилина в 70%-ной серной кислоте при 500 нм (Запрометов, 1974), флавонолов — с 1%-ным водным раствором хлористого алюминия при 415нм (Gage, Wendei, 1950) и проантоцианидинов - с бутанольным реактивом при 550 нм (Запрометов, 1974). Калибровочные кривые строили по (-)-эпикатехину (для суммы растворимых фенольных соединений и флаванов) и по рутину (для флавонолов). Содержание проантоцианидинов выражали в условиях единицах (Е55о/г свежей массы).
Для определения активности L-фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) свежезамороженный растительный материал гомогенизировали на холоду в 0,1 М натрий-боратном буфере (рН 8,8), содержащем 0,5 мМ ЭДТА и 3 мМ дитиотреитол, с добавлением водонерастворимого поливннилпирролидона (поликлар AT, 25% от сырой массы растительной ткани). Гомогенат фильтровали и центрифугировали при +4С в течении 20 мин. при 13000 об/мин. Осадок отделяли от иадосадочной жидкости, используемой в далыпейшем в качестве «грубого» ферментного препарата для определения удельной активности ФАЛ. Активность фермента определяли по образованию из L-фенилаланпна продукта реакции транс-коричной кислоты (Zucker, 1965) спекторфотометрически при 290 нм. Реакционная смесь содержала 0,1 М Na-боратный буфер, 0,01 М L-фенилаланин и ферментный препарат (60 мкг белка/мл) в общем объеме 2 мл. Измерение проводили на спектрофотометре после предварительного инкубирования реакционной смеси в течение 60 мин. при 37С. Реакцию превращения -фенилаланииа в т/?я//с-коричную кислоту прекращали путем добавления 0,5 мл 1 н трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Спустя 5 мин выпавший осадок отделяли центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин) и определяли оптическую плотность по поглощению образовавшейся за данное время транс-коричной кислоты. Активность ФАЛ выражали в мкг транс-корпчнои кислоты/мг белка за 1 час.
Количество белка в исследуемых образцах определяли спектрофотометрически по методу Бредфорд (Bradford, 1976). 2.2.5. Определение локализации фенольных соединении Цитологические и гистохимические исследования проводили на свежих срезах (25мкм) тканей пнтактных растений и растений-регенерантов, полученных при помощи микротома-криостата, а также на давленых препаратах каллусных культур. Для выяснения локализации фенольных соединений использовали реактив «Fast Blue» (Soukurova, 2000). Наличие флаванов (катехинов и проантоцианидинов) определяли по реакции с ванилиновым реактивом (Приступа и др., 1970). Препараты просматривали при помощи светового микроскопа Ergavall ("Karl Ziess" Германия).
Для изучения состава фенольных соединений листья интактных растений и микропобеги растений-регенерантов (30 мг) измельчали и экстрагировали в 1 мл охлажденной (приблизительно до +4С) смеси хлороформ/метанол/вода (3/5/2, v/v), содержащей рибитол (полярный внутренний стандарт, 40 мкг/мл) и метиловый эфир нондскановой кислоты (неполярный внутренний стандарт, 20 мкг/мл). Образцы выдерживали в течение 60 минут в холодной комнате (+4 С0) при непрерывном помешивании. Затем гомогенат отделяли (14000 об/мин, 20 минут), переносили в пластмассовые пробирки на 2.0 мл и добавляли 0.2 мл хлороформа и 0.3 мл воды. Полученную смесь перемешивали в течение 2 минут, центрифугировали (при 14000 об/мин, 20 минут), с целью разделения 2-х фазной системы органических растворителей (хлороформ/метанол и метанол/вода). Нижнюю фракцию полярных соединений (метанол/вода) помещали в вакуумный концентратор (на 2 часа при комнатной температуре) для удаления метанола, после чего водную фазу замораживали и лиофилизировали. Сухой остаток полярных соединений растворяли в 0.5 мл воды, центрифугировали в течение 20 минут при 14000 об/мин, переносили в пробирки, замораживали и хранили в морозильнике при -20 С.
Морфология, рост и содержание хлорофилла в листьях и стеблях однолетних побегов рододендронов
Одними из наиболее перспективных для выращивания в Москве и Московской области являются Rh. smirnowii Trautv., Rh. japonicum (Gray) Suring и Rh. ledebourii Pojark (Александрова, 2001). Рододендрон Смирнова {Rh. smirnowii) представляет собой вечнозеленый древовидный кустарник, высотой 1,5-2 м с плотными, кожистыми листьями (рис. 9 а). Рододендрон Ледебура (Rh. ledebourii) - полувечнозеленый мелколистный кустарник, высотой 1-1,5 м, характеризующийся частичным опаданием листьев не только осенью, но и весной, с началом роста новых побегов (рис. 9 б). Рододендрон японский (Rh. japonicum) - листопадный ветвистый кустарник, высотой 1-1,5 м с тонкими, продолговато-ланцетовидными листьями (рис. 9 6 ).
Исследуемые виды различались по морфологическому строению побегов и по типу их опушения. Так, характерной особенностью вечнозеленого Rh. smirnowii являлось густое клочковато-волосистое опушение молодых побегов. Полувечнозеленый Rh. ledebourii отличался наличием на поверхности листьев многоклеточных выделительных чешуек (железок), а листопадный Rh. japonicum — бахромчатых и железистых волосков (Кондратович, 1981; Эсау, 1970). О том, что опушение побегов является точным морфологическим признаком, лежащим в основе современной систематики рододендронов, неоднократно сообщалось в литературе (Hoff, 1953; Тахтаджан, 1964; Куперман, 1977; Кондратович, 1981).
Изученные виды отличались и по характеру роста, о чем свидетельствовали данные по изменению длины однолетних побегов в процессе вегетации (табл. I). На начальных этапах роста (май) у вечнозеленого Rh. smirnowii и листопадного Rh. japonicum она была практически одинакова и почти вдвое хменыпе, чем у полувечнозеленого Rh. ledebourii. К середине вегетационного периода (июль) длина побегов существенно увеличивалась, особенно у Rh. smirnowii и Rh. japonicum (в 3 и 4 раза соответственно). Ростовая активность отмечалась вплоть до середины октября месяца.
Одним из основных процессов, обуславливающих рост и развитие растений, является фотосинтез, служащий основой трофического и энергетического обеспечения клеток. При этом уровень накопления в тканях фотосинтетических пигментов - важный интегральный показатель их физиологического состояния (Мокроносов и др., 2006; Чиков, 2008).
Определение содержания хлорофиллов а и b в листьях однолетних побегов рододендронов показало, что оно было существенно выше у Rh. ledebourii, особенно в первой половине вегетационного периода (табл. 2). Полученные данные свидетельствовали о наличии прямой взаимосвязи между уровнем накопления пигментов в фотосинтезирующих тканях и интенсивностью роста побегов, о чем не раз сообщалось в литературе (Гертнере, 1974; Мокроносов, 1981; Адрианова, 2000).
В процессе вегетации содержание хлорофилла а и b возрастало, особенно у Rh. smirnowii и Rh. japonicum, достигая максимальных значений на завершающих этапах роста (октябрь). В период покоя уровень накопления пигментов в листьях вечнозеленого Rh. smirnowii и полувечнозеленого Rh. ledebourii рододендронов снижался (на 35 и 50% соответственно), главным образом, за счет хлорофилла Ь.
В стеблях характер накопления полифенолов был иным (рис. 10 б). В большинстве случаев на протяжении всего периода вегетации существенных изменений в содержании этих веществ не отмечалось. Исключением являлся вечнозеленый Rh. smirnowii, у которого их уровень значительно увеличивался на завершающих этапах роста, достигая максимальных значений в период покоя (декабрь).
Все это свидетельствует об изменении биосинтетической способности листьев и стеблей однолетних побегов рододендронов по мере их роста и развития. При этом значительное накопление фенольных соединений, приуроченное к летнему периоду вегетации, может быть обусловлено особенностями метаболизма молодых, активно растущих тканей. В тоже время, высокое содержание полифенолов в листьях и стеблях вечнозеленого Rh. smirnowii в период покоя (декабрь), вероятно, связано с их участием в защите клеток от действия низких температур (Chalker-Scott, 1990; Swiderski et al., 2004).
Известно, что флавонолы являются одними из наиболее распространенных компонентов фенольного комплекса надземных органов высших растений (Запрометов, 1993). Как следует из представленных на рисунке 11 данных, исследуемые виды существенно различались по способности к их образованию. В листьях вечнозеленого Rh. smirnowii в большинстве случаев она была ниже, чем у полувечнозеленого и листопадного видов (рис. 11 а).
По мере вегетации (май-октябрь) содержание флавонолов постепенно возрастало, особенно у листопадного Rh. japonicum. К периоду покоя (декабрь) оно либо не менялось, что было характерно для вечнозеленого Rh. smirnowii, либо резко снижалось — как у полувечнозеленого Rh. ledebourii. В последнем случае это, вероятно, обусловлено катаболизмом этих веществ, о чем сообщалось в литературе (Запрометов, 1996).
В стеблях однолетних побегов рододендронов способность к синтезу флавонолов, в большинстве случаев, была существенно ниже по сравнению с листьями (рис. 11 б). Наибольшее их накопление на протяжении всего периода вегетации отмечалось у полувечнозеленого Rh. ledebourii. В стеблях Rh. smirnowii и Rh. japonicum содержание флавонолов было значительно ниже и по мере роста практически не менялось.
Все это еще раз свидетельствует о широком спектре участия флавонолов в процессах фотосинтеза и защиты клеток от действия УФ-радиации (Волынец, Прохорчик, 1983; Запрометов, 1993, 1996). Кроме того, их значительное накопление в листьях рододендронов в осенний период, вероятно, является своеобразной формой запасания Сахаров, о чем не раз сообщалось в литературе (Chalker-Scott, 1999; Janas et al., 2002). Флаваны - высокореакционные соединений фенольної! природы, представленные мономерными (катехинами) и полимерными формами (проантоцианидины) и обладающие Р-витаминной капилляроукрепляющей активностью (Запрометов, 1993, 1996; Плотников и др., 2005; Dixon et al., 2005). Рядом авторов сообщалось о высокой способности рододендронов к синтезу флаванов, однако эти сведения крайне ограничены (Дурмишидзе н др., 1981;Harborn, 1971). Как следует из представленных на рис. 12 а данных, в листьях рододендронов суммарное содержание флаванов увеличивалось вплоть до середины вегетации (июль), осенью незначительно снижалось, а зимой -вновь возрастало. В стеблях динамика накопления флаванов была иной (рис. 12 б). Во всех случаях их наименьшее содержание отмечалось на начальных этапах роста побегов (май), затем оно постепенно увеличивалось, достигая максимальных значений в период покоя. При этом в большинстве случаев уровень этих веществ был значительно ниже в стеблях по сравнению с листьями. Исключение составлял вечнозеленый Rh. snrivnowii, у которого зимой содержание флаванов в стеблях было на 15% выше, чем в листьях. Известно, что флаваны являются одними из наиболее распространенных компонентов фенольного комплекса рододендронов. В связи с этим представляло интерес изучение вклада этих веществ в суммарное содержание фенольных соединений.
