Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Клональное микроразмножение и оздоровление растений 8
1.2. Биологические особенности луковичных и клубнелуковичных геофитов 13
1.3. Морфо-физиологические особенности клонального микроразмножения луковичных и клубнелуковичных растений в культуре in vitro ... 17
1.3.1. Физиологические особенности растения-донора
1.3.2. Действие физических факторов 23
1.3.3. Состав питательной среды 26
Глава 2. Биологическая характеристика объектов исследования 36
2.1. Ботаническая характеристика лилии 36
2.2. Экологическая характеристика лилий 37
2.3. Ботаническая характеристика гладиолуса 40
2.4. Экологическая характеристика гладиолуса... 41
2.5. Использованные сорта, их характеристика, источник получения.. 44
Глава 3. Методы исследования 46
3.1. Постановка эксперимента 46
3.2. Методы исследования 49
Глава 4. Введение лилий и гладиолусов в культуру in vitro 53
4.1. Стерилизация и исходное качество материала 53
4.2. Влияние сроков изоляции на развитие эксплантов на начальных этапах культивирования in vitro 58
4.3. Влияние физиологического возраста и расположения эксплантов на регенерационную активность при введении в культуру 60
4.4. Влияние полярности эксплантов лилий на образование микро луковичек 65
4.5. Влияние минерального состава питательной среды на регенерацию эксплантов при введении в культуру , 67
4.6. Влияние регуляторов роста на органогенез эксплантов .. 72
4.7. Зависимость развития эксплантов от типа источника углерода и его концентраций 84
Глава 5. Микроразмножение лилий и гладиолусов 90
5.1. Влияние минерального состава среды на регенерацию растений на этапе микроразмножения 90
5.2. Влияние концентрации сахарозы на образование микролуковичек и побегов 92
5.3. Влияние регуляторов роста на органогенез при микроразмножении.. 95
5.4. Влияние физических условий культивирования на развитие эксплантов при микроразмножении 103
5.5. Регенерация микролуковичек и побегов из каллусной ткани 107
Глава 6. Укоренение регенерантов лилий и гладиолусов 112
6.1. Зависимость корнеобразования от минерального состава питательной среды 112
6.2. Влияние регуляторов роста наризогенез 114
6.3. Влияние экологических факторов наризогенез 119
Глава 7. Перевод растений-регенерантов в условия ex vitro 124
7.1. Зависимость приживаемости пробирочных растений ex vitro от предпосадочной обработки регулятором роста 124
7.2. Влияние экологических факторов на рост и развитие растений-регенерантов ex vitro 126
Заключение 133
Выводы 135
Библиографический список 137
- Морфо-физиологические особенности клонального микроразмножения луковичных и клубнелуковичных растений в культуре in vitro
- Влияние физиологического возраста и расположения эксплантов на регенерационную активность при введении в культуру
- Зависимость развития эксплантов от типа источника углерода и его концентраций
- Влияние физических условий культивирования на развитие эксплантов при микроразмножении
Введение к работе
В настоящее время возросли требования к исходному материалу цветочно-декоративных растений, который в соответствии со стандартами должен быть свободен от различных вредителей и болезней [Тамберг, 2000; Петренко, 2001]. Лидирующую роль в получение высококачественного посадочного материала приобретают биотехнологические методы.
Среди декоративных многолетников луковичные и клубнелуковичные цветочно-декоративные растения с каждым годом приобретают все большее значение в промышленном цветоводстве и озеленении. Особой популярностью у цветоводов по всему миру пользуются лилии и гладиолусы. Ускоренное размножение их в течение последних 15-20 лет вызывает огромный интерес, как исследователей-ботаников, биотехнологов, селекционеров, так и производственников [Лапинская, 1998; Румынии, Агаджанян, Слюсаренко, 1999; Мазур, Калашникова, 2000]. Традиционный вегетативный метод не позволяет размножить быстро и в достаточном количестве новые сорта и гибриды. Многие гибриды имеют низкий коэффициент размножения, что препятствует их аттестации на сорт. Обычно для выведения нового сорта селекционеру требуется 10-12 лет [Висящева, Соколова, 1991]. Все это сдерживает процесс сортосмены и обедняет ассортимент цветочной продукции.
При дефиците исходного материала значительно ускорить размножение позволяет метод клонального микроразмножения (КМР), который включает следующие этапы: I. Введение в культуру in vitro, П. Собственно микроразмножение, III. Укоренение, IV. Перевод растений-регенерантов в культуру ex vitro [Высоцкий, 1983; Бутенко, 1999]. Данный метод был использован для некоторых декоративных растений: тюльпана [Bancilhon, 1974; Hussey, 1975; Riviere, Muller, 1979], нарцисса [Hussey, 1982; Выхристова, 1983], ириса [Лунева, 1977; Болтенков и др., 2000], фрезии [Bajaj, Pierik, 1974; Катаева, 1981, 1983], гиппеа-
5 струма [Рахимбаев и др., 1983], шафрана [Рахимбаев и др., 1985], лилии [Румынии, Слюсаренко, 1989; Chang et al., 2000; Мазур, Калашникова, 2000], гладиолуса [Ziv et al., 1970; Bajaj et al., 1983; Лапинская, 1998], однако систематические данные по клональному размножению лилий и гладиолусов, в том числе растений разных сортов, неполные. Недостаточно изучено влияние стерилизующих растворов, минерального и органического состава питательной среды, регуляторов роста и условий культивирования на процессы регенерации растений на каждом этапе микроразмножения. Кроме того, практически отсутствуют сравнительные данные по эколого-морфологическим особенностям клонально-го микроразмножения лилий и гладиолусов разных сортов.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение морфо-физиологических особенностей клонального микроразмножения in vitro различных сортов лилий (Lilium L.) и гладиолусов {Gladiolus L.). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: разработать эффективные методы введения различных сортов лилий и гладиолусов в стерильную культуру in vitro; выяснить роль биологических особенностей эксплантов в регенерационную активность на этапе введения в культуру in vitro; изучить влияние минерального и органического компонентов питательной среды на регенерационную активность эксплантов лилий и гладиолусов на I этапе КМР; определить роль отдельных факторов культивирования (состав питательных сред, физические условия) на этапе микроразмножения (II этап КМР); оптимизировать состав питательных сред и условия культивирования, обеспечивающие высокую укореняемость и регенерацию пробирочных растений (III этап КМР); - проанализировать параметры адаптации и выращивания растений- регенерантов лилий и гладиолусов в условиях ex vitro (IV этап КМР).
Основные положения, выносимые на защиту. - Сорта ЛА-гибридов лилий {Longiflorum-Asiatic hybrids) и гладиолусов -^ {Gladiolus hybridus hort.) существенно различаются по своим биологическим свойствам. - Технология клонального микроразмножения разработана для каждого сорта и отличается специфическими элементами. -Полученные экспериментальные результаты имеют практическое значение.
Научная новизна результатов исследований. Для четырех сортов ЛА-гибридов лилий и гладиолусов разработаны эффективные приемы получения асептической культуры первичных эксплантов и выявлены наиболее благоприятные сроки изоляции эксплантов. Впервые для данных видов и сортов изу-чено влияние физиологического возраста, происхождения и полярности эксплантов на регенерационную активность при введении в культуру in vitro. Выяснено влияние минеральных и органических компонентов питательной среды, экзогенных регуляторов роста и экологических факторов культивирования на регенерационную активность эксплантов гладиолусов и ЛА-гибридов лилий и на различных этапах КМ Р.
Практическая ценность. Полученные результаты вносят вклад в развитие современных представлений об особенностях клонального микроразмножения in vitro луковичных и клубнелуковичных декоративных растений. Применение разработанных элементов технологии клонального микроразмножения разных сортов ЛА-гибридов лилий и гладиолусов позволит успешно решать проблему ускоренного размножения и оздоровления ценных сортов лилий и гладиолусов, существенно сократит сроки получения посадочного материала. Подана заявка на изобретение (патент РФ) № 2005104318/12 с приоритетом от 17.02.2005.
Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учеб- +,к ном процессе на биологических факультетах университетов, сельскохозяйст- венных и педагогических вузов.
7 Апробация работы. Материалы диссертации представлены и доложены на
II и III Международных научных конференциях «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2001, 2003), на Международной научной конференции «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002), на Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии» (Брянск, 2002), на V съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), VIII International Conference «The Biology of Plant Cell In Vitro and Biotechnology» (Saratov, 2003), на Международной научной конференции, посвященной 100-летию профессора В.Н. Ржавитина «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003), на научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), на Общегородской конференции «Проблемы озеленения городов» (Москва, 2004), на региональной научной конференции, посвященной 40-летию ботанического сада МГУ им. Н.П.Огарева «Роль ботанического сада в интродукции, сохранении редких видов растений и экологическом воспитании» (Саранск, 2000), на VII и VIII Научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов (Саранск, 2002, 2003), на XXXI Огаревских чтениях (Саранск, 2002).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в т. ч. 3 статьи в реферируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, библиографического списка, включающего 182 наименования, в том числе 70 на иностранных языках. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков и 35 таблиц.
Морфо-физиологические особенности клонального микроразмножения луковичных и клубнелуковичных растений в культуре in vitro
К данной группе факторов, влияющих на регенерационную способность изолированных частей растений, относятся: продолжительность хранения растительного материала, сроки изоляции, таксономическая принадлежность, физиологический возраст, происхождение, размер, строение и ориентация экс-плантов на питательной среде.
Продолжительность хранения. Сроки и условия хранения растительного материала оказывают неоднозначное влияние на регенерационную активность различных видов луковичных и клубнелуковичных декоративных растений, вводимых в культуру in vitro. Так, при культивировании гиацинта и нарцисса in vitro число сформированных на экспланте бульбочек не зависело от сроков хранения, однако вес луковичек постепенно увеличивался с удлинением периода хранения с оптимумом, приходящимся на первые две недели октября [Pierik, Ruibing, 1973; Seabrook et al., 1976, 1982; Hussey, 1982; Выхристова 1983]. В тоже время, регенерационная активность эксплантов находится в более тесной связи со сроками хранения у лилии [Takayama, Misawa, 1982, 1983; Румынии, Слюсаренко, 1989; Мазур, Калашникова, 2000; Chang et ah, 2000;], гладиолуса [Ziv et al., 1970; Ginzburg, Ziv, 1973; Hussey, 1977; Bajaj et al., 1983; Румынии и др., 1990], ириса [Hussey, 1976; Лунева, 1977; Болтенков и др., 2000] и фрезии [Davies, Helsop, 1972; Bajaj, Pierik, 1974; Катаева 1981, 1983]. Сроки изоляции оказывают большое влияние на процессы регенерации эксплантов. По мнению ряда авторов, экспланты, изолированные в весенние сроки (март-май), обладали большей ре генерационной способностью по сравнению с эксплантами, изолированными в осенне-зимний период [Robb, 1957; Pierik, Ruibing, 1973; Румынии, Слюсаренко, 1989]. При этом формируется максимальное количество побегов и адвентивных луковичек на эксплант [Stimart et al., 1980; Van Aartrijk, Blom-Bamhoom, 1979, 1981; Novak, Petru, 1981]. Исследователи считают, что сезонные колебания в образовании побегов и луковиц in vitro коррелируют со стадиями развития растений и с различной активностью ИУК и АБК в разные периоды покоя [Stimart, Ascher, 1978; Ilosoki, Asahira, 1980; Kim, 1981; Paek, Kee, 1982; Hussey, 1982]. Однако сроки изоляции видос-пецифичны. Например, приведенные сроки (март-май) оптимальны для лилий, гиацинтов, гладиолусов [Джумашева, Рахимбаев, 1981; Мауриня и др., 1983; Джумашева, 1983; Лапинская, 1998; Мазур, Калашникова, 2000], тогда как для других растений, в частности тюльпанов, экспланты (чешуи главной дочерней луковицы) целесообразно изолировать в зимний период (январь-март) [Nishiuchi, Myodo, 1976]. В этот период молодая луковица состоит из трех-четырех чешуи с низким содержанием крахмала, и этот признак благоприятствует дедифференциации клеток, формированию каллусных тканей и возникновению меристематических очагов с высокой митотической активностью [Riviere, Mutler, 1979; Bancilhon, 1974; Hussey, 1975].
Сортовые особенности. Ре генерационные способности луковиц разных сортов одного вида сильно варьируют [Gunnar, 1971; Румынии, Слюсаренко, 1989; Болтенков и др., 2000]. Показано, что реализация морфогенетических потенций различных типов ткани в значительной степени зависит от генотипа исходного растения [Pierik, Ruibing, 1973; Debargh, Standaert-De Metsenaere, 1976; Doss, Christian, 1979; Выхристова, 1983; Митрофанова, Иванова, 1987].
Физиологический возраст экспланта. Этот фактор оказывает большое влияние на регенерационную способность растений в культуре in vitro. По данным S. Robb [Robb, 1957], молодые и старые чешуи лилии обладали одинаковой регенерационной способностью. Напротив, S. Takayama, М. Misawa установили, что внешние луковичные чешуи старых луковиц лилии (возраст 70 дней) обладали невысокой способностью к дифференциации луковиц. Наиболее активными в этом отношении были чешуи молодых (возраст 20 дней) луковиц или внутренние чешуи более старых луковиц. На образование корней в культуре in vitro возраст луковиц не оказал существенного влияния [Takayama, Misawa, 1980].
В работах, проводимых с другими культурами, в частности с гиацинтом, было показано, что скорость регенерации незначительно увеличилась с возрастанием порядкового номера чешуи - с 1 по 6, с 7 по 12, с 13 по 18 (счет ведется от центра к периферии). Это различие стиралось спустя 12 недель. Однако вес бульбочєк у молодых чешуи (с 1 по 6) был значительно ниже, чем у старых чешуи (с 7 по 12 и с 13 по 18) [Pierik, Ruibing, 1973].
Строение и происхождение эксплантов также оказывает существенное влияние на органогенез луковичных и клубнелуковичных декоративных растений в культуре in vitro. В опытах с гиацинтом показано, что скорость регенерации и количество бульбочєк на один эксплант, а так же их вес резко уменьшались в верхних частях чешуи по сравнению с нижними [Pierik, Ruibing, 1973; Pierik, Post, 1975]. Вследствие этого основными требованиями для лучшей регенерации и роста луковичек были следующие: наличие базальной части чешуи, относительно малая ширина и большая длина экспланта [Pierik, Post, 1975]. В этом случае количество формирующихся луковичек на один эксплант возрастало почти линейно при увеличении размера экспланта. Максимальное число мелких луковичек было получено из эксплантов шириной 0,5 см, а крупные луковички - из эксплантов шириной от 1,0 до 1,5 см при постоянной длине эксплантов [Раек, Кее, 1982].
Происхождение эксплантов. Большое значение при клональном размножении in vitro имеет происхождение экспланта. Тип используемого экспланта в первую очередь зависит от генетических особенностей культивируемых растений [Tamura, 1978; Раек, Кее, 1982; Hussey, 1982; Мурсолиева, 1999]. При культивировании луковичных растений многие исследователи в качестве исходных эксплантов зачастую используют чешуи, а при культивировании клубнелуковичных - целые клубнелуковицы или их сегменты [Pierik, Ruibing, 1973; Pierik, Post, 1975; Stimart, Ascher, 1978; Takayama, Misawa, 1980; Джума-шева, 1983; Румынии, Слюсаренко, 1989; Мазур, Калашникова, 2000].
Однако помимо этих частей растений используют и другие. У гиацинта, помимо луковичных чешуи, высокими морфологическими потенциями в культуре in vitro обладают ткани генеративных органов — цветочные почки и отрезки цветоноса [Kim, 1981; Раек, Кее, 1982]. В работах по микроразмножению ценных гибридов лилий хорошо себя проявили листья и завязи [Simmonds, Camming, 1976; Bennici, 1979; Stimart et al., 1980; Novak, Petru, 1981; Мазур, 1999].
При микроразмножении тюльпана in vitro в качестве экспланта преимущественно используют главную дочернюю луковицу, которая имеет естественную преграду от заражения в виде сочных чешуи материнской луковицы, или наружную пазушную почку [Nishiuchi, Myodo, 1976; Riviere, Muller, 1979]. Однако некоторые исследователи для интенсификации процессов органогенеза тюльпана in vitro предлагают использовать ткани, происходящие либо из генеративных органов, либо расположенные вблизи от них -цветоносы, цветки, листья [Bancilhon, 1974; Hussey, 1975; Nishiuchi, Myodo, 1976; Riviere, Muller, 1979].
Влияние физиологического возраста и расположения эксплантов на регенерационную активность при введении в культуру
Выявлено, что наиболее крупные микролуковички у всех сортов (диаметром до 5,4 мм) формировались в варианте с использованием 0,5 мг/л 6-БАП и 1,0 мг/л ПУК, однако у сорта Мадонна крупные луковички (3,9 мм) образовывались при добавлении в среду 1,0 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л НУК (см. табл, 4.9). В целом увеличение концентрации 6-БАП в среде приводило к снижению размера луковичек у всех сортов.
Совместное применение 6-БАП и 2,4-Д оказалось менее эффективно с точки зрения выхода адвентивных микролуковичек (табл. 4.10). Для всех сортов их количество колебалось от 1,0 до 2,3 шт/эксплант. Как и в предыдущем варианте опыта, повышение концентрации 6-БАП в среде приводило к небольшому увеличению количества образующихся микролуковичек. Что касается концентрации 2,4-Д, то для всех сортов не отмечалось четкой зависимости. Так, для сортов Суинс и Сансет при всех концентрациях 6-БАП наиболее предпочтительными оказались 1,0 и 1,5 мг/л 2,4-Д; для сорта Вашингтон - 0,5 мг/л, а для сорта Мадонна - 1,0 мг/л 2,4-Д.
Изучение размера формирующихся луковичек de novo под влиянием совместного применения 6-БАП и 2,4-Д показало, что, как и в варианте с 6-БАП + НУК, увеличение концентрации цитокининов в среде снижало размер у всех сортов. Образование луковичек максимального размера (5,6-8,6 мм) у всех сортов наблюдали на среде с 0,5 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л 2,4-Д.
Исследовали также влияние на регенерационную активность эксплантов другого цитокининового препарата - кинетина - вкупе с НУК и 2,4-Д. При совместном применении кинетина и НУК максимальное число микролуковичек у большинства сортов формировалось на среде, содержащей 0,5 мг/л кинетина и 0,5-1,5 мг/л НУК (табл. 4.11). На средах с повышенным содержанием цитоки-нина (1,0 и 1,5 мг/л кинетина) наблюдали снижение количества образующихся микролуковичек.
При выяснении зависимости размеров формирующихся адвентивных микролуковичек от соотношения данных регуляторов роста установили, что у всех сортов наибольший размер имели луковички в варианте с внесением в питательную среду 0,5-1,5 мг/л кинетина + 0,5 мг/л НУК. Максимальный размер луковичек отмечался у сорта Вашингтон (3,9 мм) на среде с концентрацией обоих регуляторов роста по 0,5 мг/л.
Следующая комбинация изучаемых регуляторов роста была кинетин + 2,4-Д (табл. 4.12). У всех сортов количество образовавшихся микролуковичек колебалось от 1,2 до 2,2 шт./эксплант. Наибольшее количество формировалось у сорта Суй не. Следует отметить, что максимальное количество микролуковичек у данного сорта наблюдалось как при низких концентрациях данных регуляторов роста в среде (оба по 0,5 мг/л), так и при относительно высоких (оба по 1,5 мг/л). Однако в первом случае микролуковички отличались утонченными вытянутыми чешуйками, и в последующем разрастались, принимая уродливую форму, тогда как во втором полученные адвентивные микролуковички имели правильную морфологию.
Размер формирующихся микролуковичек при использовании данной комбинации регуляторов роста не имел такой четкой зависимости, как в предыдущих вариантах. Как и в серии опытов с 6-БАП, самые крупные микролуковички формировались при добавлении в среду 2,4-Д. У сорта Суинс это отмечалось в варианте с использованием 1,0 мг/л кинетина и 0,5 мг/л 2,4-Д, размер луковичек составил 8,1 мм.
Также изучали влияние 6-БАП (0,5-4,0 мг/л), кинетина (0,5-4,0 мг/л), НУК (0,5 до 1,5 мг/л) и 2,4-Д (0,5 до 1,5 мг/л) на побегообразование у эксплантов гладиолуса на этапе введения в культуру in vitro.
Совместное применение 6-БАП с НУК и 2,4-Д оказалось не эффективным для формирования побегов у эксплантов все изучаемых сортов. Побегообразование отмечалось только в вариантах с концентрацией НУК и 2,4-Д - 0,5 мг/л. При этом количество формирующихся побегов в среднем по сортам не превышало 1,2 шт/эксплант. Высокие концентрации НУК и 2,4-Д (1,0 и 1,5 мг/л) ингибировали образование и рост побегов. При этом у всех сортов отмечалось активное каллусообразование (рис. 4.7).
В связи с этим исследовали побегообразование добавляя в ПС только 6-БАП или кинетин в разных концентрациях (0-4,0 мг/л). Использование в качестве гормонального фактора среды 6-БАП показало его высокую эффективность для регенерационной способности изолированных эксплантов у большинства изученных сортов (табл. 4.13). Экспланты гладиолуса характеризовались хорошим развитием при наличии в питательной среде этого препарата в широком диапазоне концентраций - от 0,5 до 3 мг/л. При этом 6-БАП влиял как на коэффициент размножения, так и на длину побегов. В концентрации от 0,5 до 2,5 мг/л гормональный препарат изменял число регенерируемых побегов от 3,5 до 12,2 шт./экспл. У всех сортов высокие концентрации 6-БАП (более 2,0-2,5 мг/л) снижали количество образующихся побегов, а при концентрации 4,0 мг/л у всех сортов отмечалось интенсивное каллусообразование без формирования побегов.
Изученные концентрации данного регулятора роста оказывали существенное влияние и на размер формирующихся побегов. На безгормональной среде длина побегов у всех сортов была минимальной (табл. 4.14). Увеличение концентрации 6-БАП в среде приводило к удлинению побегов. Максимальная длина побегов у всех сортов отмечалась на среде с 1,5 мг/л 6-БАП. В зависимости от сорта данная величина колебалась от 21,8 мм (сорт Лазурный берег) до 37,3 мм (сорт Андрей Первозванный). Дальнейшее увеличение концентрации данного препарата ингибировало этот процесс.
Зависимость развития эксплантов от типа источника углерода и его концентраций
При изучении зависимости длины формирующихся побегов от концентрации данных регуляторов роста было установлено, что, как и при использовании комбинации 6-БАП + НУК, побеги максимальной длины у всех сортов формировались при концентрации 6-БАП в среде 1,0 мг/л. Оптимальная концентрация ауксинового препарата 2,4-Д составила 0,5 мг/л. При этом длина побегов колебалась от 54,5 мм у сорта Лазурный берег до 67,2 мм у сорта Андрей Первозванный.
Увеличение концентрации 6-БАП в среде до 1,5 мг/л негативно отразилось на длине формирующихся побегов. Таким образом, для получения максимального количества побегов у всех сортов гладиолуса на этапе микроразмножения культивирование необходимо осуществлять на среде, содержащей 6-БАП + НУК с концентрацией обоих препаратов 0,5 мг/л. А для получения побегов максимальной длины (до 95,2 мм) целесообразно использовать среду с 1 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л НУК. На этапе собственно микроразмножения, наряду с составом питательной среды и используемыми регуляторами роста, на регенерационную активность эксплантов большое влияние оказывают физические условия культивирования [Высоцкий, 1983; Takayama, Misawa, 1983; Бутенко, 1999]. Важнейшими являются фотопериод и температура. При изучении влияния фотопериода на органогенез лилий и гладиолусов мы исследовали три варианта: 24-часовой световой день, 16-часовой и темнота. Изучение процесса регенерации у эксплантов лилий при варьировании фотопериода показало, что наибольшее число микролуковичек у всех сортов формировалось при круглосуточном освещении — 1,5-2,3 шт/эксплант (табл. 5.7). Максимальное количество микролуковичек образовывалось на эксплантах сортов Суинс и Вашингтон (2,3 и 2,2 шт. соответственно), а минимальное у сорта Мадонна. Сорт Сансет занимал промежуточное положение. Уменьшение продолжительности освещения до 16 часов приводило к снижению регенерационной активности эксплантов всех изучаемых сортов. Количество микролуковичек при этом колебалось от 1,2 до 1,9 шт/эксплант. При культивировании эксплантов в темноте отмечался самый низкий выход микролуковичек (от 1,0 до 1,2 шт/эксплант), причем у сортов Суинс и Вашингтон количество образующихся микролуковичек в данном варианте опыта снижалось вдвое по сравнению с круглосуточным освещением. Влияние продолжительности светового периода изучали также на процессе побегообразования у эксплантов разных сортов гладиолуса (табл. 5.8). Как и в случае с лилиями, максимальной регенерационной активностью отличались экспланты, культивируемые при 24-часовом освещении. Количество побегов у всех сортов колебалось от 3,4 до 5,7 штук. Применение 16-часового фотопериода несколько тормозило этот процесс. При этом среднее количество побегов для всех сортов составляло 3,7 шт/эксплант. Культивирование эксплантов в темноте приводило к снижению побегообразования в 2-4 раза у сортов Оскар и Андрей Первозванный. У сортов Черный камень и Лазурный берег вообще не происходило образование побегов, а отмечался активный каллусогенез. Таким образом, для эксплантов лилий и гладиолусов оптимальным является культивирование при постоянном освещении. Помимо фотопериода, на этапе собственно микроразмножения изучали влияние температурного фактора на регенерационную активность эксплантов лилий и гладиолусов. Исследовали два температурных режима культивирования: 14 С и 23 С (рис. 5.5). Культивирование эксплантов при 23 С вызывало активное образование микролуковичек. Наибольшей регенерационной активностью в данном варианте обладали экспланты сорта Вашингтон (2,5 шт/эксплант). Далее располагались сорта Суинс, Сансет (2,2 и 1,9 шт/эксплант, соответственно), экспланты сорта Мадонна характеризовались самым низким показателем (1,7 шт/эксплант). Среднее количество образующихся луковичек по всем сортам составило 2,1 шт/эксплант. Культивирование эксплантов при 14 С снижало процесс индукции микролуковичек у всех изучаемых сортов лилий, у сорта Суинс в 1,3 раза, у сортов Сансет и Мадонна в 1,4 раза, а у сорта Вашингтон в 1,9 раза. В среднем снижение образования микролуковичек по всем сортам при 14 С, по сравнению с вариантом 23 С составило 1,5 раза. При культивировании эксплантов гладиолуса в этих же температурных режимах прослеживалась аналогичная тенденция. Побегообразование шло наиболее интенсивно в варианте, когда температура составляла 23 С (рис. 5.6). У эксплантов сортов Оскар, Черный камень и Андрей Первозванный количество образующихся побегов при данном температурном режиме было максимальным - 4,2-4,4 шт/эксплант. Среднее количество образующихся побегов по всем сортам составило 4 шт/эксплант Выращивание эксплантов при 14 С снижало образование побегов у эксплантов всех изучаемых сортов, у сорта Лазурный берег в 1,5 раза, у сорта Оскар и 1,7 раза, у сортов Андрей Первозванный и Черный камень в 2 и 2,2 раза соответственно.
Влияние физических условий культивирования на развитие эксплантов при микроразмножении
Перенос пробирочных растений в нестерильные условия представляет собой важнейший этап, в случае неудачи способный полностью перечеркнуть всю предшествующую работу. При этом приходится учитывать два основных фактора, характеризующих пробирочные растения: анатомо-морфологический, заключающийся в слабо развитой хлоренхиме, ненормально функционирующих устьицах, и физиолого-биохимический, отражающий пониженную способность к фотосинтезу, вследствие фотогетеротрофности регенерантов при культивировании на средах, содержащих источники углеводов [Высоцкий, 1983; Лапинская, 1998; Бутенко, 1999].
В процессе работы задачу перевода пробирочных растений в нестерильные условия решали для отдельных видов растений. Общими моментами были следующие: стимуляция развития адвентивных корней in vivo, подготовка листового аппарата к условиям пониженной влажности, перевод на фотоавто-трофный тип питания. В связи с этим изучали зависимость приживаемости и дальнейшего развития витрорастений от концентрации раствора НУ К, а котором осуществляли предпосадочное замачивание укорененных растений, и физических (экологических) условий выращивания (фотопериод и температура).
Приживаемость растений-регенерантов в условиях ex vitro существенно зависит от разных эндогенных и экзогенных факторов. Одним из важнейших является наличие достаточного количества эндогенных ауксинов, принимающих активное участие в формировании корневой системы в условиях ex vitro [Высоцкий, 1983; Бутенко, 1999], так как, по некоторым данным, корневая система, развившаяся in vitro не играет большой роли в обеспечении жизнедеятельности растений в почвенных субстратах и в большинстве случаев гибнет [Высоцкий, 1983].
В связи с этим представляет определенный интерес предпосадочная обработка растений-регенерантов лилий и гладиолусов путем замачивания в растворах с различной концентрацией НУК (0-1,5 мг/л).
При переводе растений-регенерантов лилий в нестерильные условия было установлено, что в целом изучаемые сорта отличались достаточно высокой степенью приживаемости (табл. 7.1). Предварительное замачивание пробирочных растений в растворах НУК перед посадкой в почву показало его высокую эффективность по отношению к приживаемости растений в контрольном варианте. При концентрации НУК 0,5 мг/л процент выживших растений был больше на 19,1 % чем в контроле (в среднем по всем сортам). Наибольший процент выживших и укоренившихся растений отмечен в вариантах с концентрацией НУК 1,0 и 1,5 мг/л. При этом процент выживших растений варьировал от 97,3 % (сорт Сансет) до 100 % (остальные сорта).
При перенесении растений-регенерантов гладиолусов в условия ex vitro наблюдалась сходная картина. Обработка пробирочных растений раствором НУК увеличивала процент приживаемости растений в нестерильных условиях по сравнению с необработанными (контролем) (табл. 7.2). В варианте с концентрацией НУК 0,5 мг/л процент прижившихся растений в среднем составил 86,7 %, тогда как в контроле - 73,5 %. Увеличение концентрации НУК до 1,0 и 1,5 мг/л повышало этот показатель до 99,2 и 99,8 %, соответственно.
Анализируя полученные данные, можно утверждать, что для эффективного перевода растении-регенерантов лилий и гладиолусов в условия ex vitro перед посадкой их необходимо замачивать в растворе НУК с концентрацией 1,0-1,5 мг/л. Такой способ подготовки регенерантов к пересадке в нестерильные условия обеспечивает 97-100% приживаемость пробирочных растений. Вероятно, это объясняется увеличением уровня ауксинов в растениях-регенерантах, что способствует образованию дополнительных корней и быстрому формированию корневой системы [Высоцкий, 1983; Бутенко, 1999]. 7.2. Влияние экологических факторов на рост и развитие растении-регенерантов ex vitro
В процессе адаптации и последующем росте и развитии пробирочных растений ex vitro важную роль играют экологические факторы, особенно фотопериод и температура [Stimart, Asher, 1981; Лапинская, 1998].
В связи с этим изучали особенности адаптации растений к нестерильной среде при варьировании температуры (14 С и 23 С) и фотопериода (16-часовой или 24-часовой световой день). Выясняли влияние этих факторов на рост и развитие надземной части, а также формирование и развитие луковиц, клубнелуковиц и клубнепочек.
Исследования по переводу растений-регенерантов лилий в условия ex vitro показали большую зависимость высоты растений от температуры и условий освещения (табл. 7.3). Во всех вариантах наименьшую высоту имели растения, выращиваемые при 14 С. При данном температурном режиме растения, выращиваемые в условиях 24-часового светового дня, были на 11,6 см (в среднем) выше растений, выращиваемых при 16-часовом световом дне. Максимальную высоту имели растения в варианте с температурой выращивания 23 С и круглосуточным освещением - от 68,2 см (сорт Су инс) до 75,3 см (сорт Сансет).
Аналогичные исследования проводили с растениями гладиолуса (табл. 7.4). При изучении влияния температуры и фотопериода на рост регене-рантов гладиолуса ex vitro прослеживалась та же тенденция, что и в опыте с лилиями. Наиболее эффективным с точки зрения роста растений оказалось выращивание их при температуре 23 С и круглосуточном освещении. При этом формировались хорошо развитые растения, высота которых колебалась от 123,0 см (сорт Оскар) до 135,4 см (сорт Андрей Первозванный). Снижение температуры до 14 С вкупе с 16-часовым световым днем снижало этот показатель в среднем по всем сортам на 62,5 см. В целом выращивание растений при постоянном освещении было более эффективным по сравнению с вариантом 16-часового светового дня.
