Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 9
1.1 Значение зернобобовых культур в агропромышленном комплексе 9
1.1.1 Горох {Pisum sativum L.) - ведущая зернобобовая культура 12
1.2 Вредители Pisum sativum Ь.и их характеристика 15
1.2.1 Характеристика основного вредителя Pisum sativum L.- Bruchus pi-sorum L. 17
1.2.2 Физиология поврежденного зерна Pisum sativum Ь.зерновкой Bruchus pisorum L. 21
1.3 Защита посевов Pisum sativum L.OT вредителей 22
1.3.1 Меры борьбы с Bruchus pisorum L. 23
1.4 Морфологические и физиолого-биохимические различия растений, устойчивых к болезням и вредителям 25
1.4.1 Антипитательные соединения 26
1.4.1.1 Растительные ингибиторы протеиназ 27
1.4.1.2 Ингибиторы а - амилазы 27
1.4.1.3 Лектины 28
1.4.1.4 Пуроиндолины и другие белки 28
1.4.1.5 Фенольные соединения 29
1.5 Факторы иммунитета Pisum sativum L.K Bruchus pisorum L. 30
Глава 2 Объекты и методы исследования 35
2.1 Объекты исследования 35
2.2 Условия выращивания 37
2.2.1 Характеристика хозяйства, месторасположение 3 7
2.2.2 Почвенно-климатические условия 38
2.2.2.1 Климат 38
2.2.2.2 Рельеф 41
2.2.2.3 Почвенные условия 42
2.3 Методы исследования 42
Глава 3 Результаты исследований и обсуждения 48
3.1 Вредоносность Bruchuspisorum L. 48
3.1.1 Динамика численности Bruchus pisorum L. на посевах Pisum sativum L. 48
3.1.2 Повреждаемость Pisum sativum L. зерновкой Bruchus pisorum L. 52
3.1.3 Степень вредоносности Bruchus pisorum L. 55
3.2 Особенности формирования пергаментного слоя створки бобов гороха как барьера для инвазии Bruchus pisorum L. 61
3.2.1 Уточнение фазы развития растений Pisum sativum L., на которой следует брать бобы на анализ 62
3.2.2 Оценка степени одревеснения пергаментного слоя с учетом принципа одревеснения лигнина в этом образовании 63
3.2.3 Разработка способа оценки устойчивости сортов Pisum sativum L. к Bruchus pisorum L 73
3.2.4 Эффективность использования разработанного способа оценки устойчивости сортов Pisum sativum L. к Bruchus pisorum L. 75
3.3 Биохимическая характеристика сортов гороха, различающихся устойчивостью кбрухусу 76
3.3.1 Содержание белка в зерне Pisum sativum L. в связи с повреждением Bruchus pisorum L. 76
3.3.1.1 Динамика содержания белка в зерне Pisum sativum L. 76
3.3.1.2 Содержание белка в зрелом зерне Pisum sativum L. в связи с повреждением Bruchus pisorum L. 80
3.3.1.3 Содержание солерастворимой белковой фракции в зрелом зерне Pisum sativum L, в связи с повреждением Bruchus pisorum L. 86
3.3.1.4 Характеристика глобулиновых белков Pisum sativum L. в связи с повреждением Bruchus pisorum L. по полипептидному составу 92
3.3.2 Содержание углеводов в зерне сортов Pisum sativum L, в связи с устойчивостью-восприимчивостью к Bruchus pisorum L. 94
3.3.2.1 Содержание крахмала в зрелом зерне Pisum sativum L. в связи с повреждением Bruchus pisorum L. 94
3.3.2.2 Содержание амилозы в зрелом зерне Pisum sativum L. в связи с повреждением Bruchus pisorum L. 97
3.3.2.3 Содержание Сахаров в зрелом зерне сортов Pisum sativum L. в связи с устойчивостью-восприимчивостью к Bruchus pisorum L. 100
3.3.3 Антипитательные соединения - как защитный барьер при атаке Pisum sativum L. личинками Bruchus pisorum L. 104
3.3.3.1 Активность ингибиторов протеолитических ферментов при внедрении, локализации и развитии в семенах Pisum sativum L. зерновкой Bruchus pisorum L. 104
3.3.3.2 Активность а-амилазы и ингибитора в семенах Pisum sativum L. в связи с повреждением Bruchus pisorum L. 113
3.3.3.3 Действие ингибиторов гидролаз на жизненную активность взрослых особей Bruchus pisorum L. 119
3.3.3.4 Содержание фенольных соединений в генеративных органах растений Pisum sativum L. 122
Заключение 137
Выводы 144
Практические рекомендации 146
Список литературы 147
Приложение 167
- Характеристика основного вредителя Pisum sativum L.- Bruchus pi-sorum L.
- Морфологические и физиолого-биохимические различия растений, устойчивых к болезням и вредителям
- Оценка степени одревеснения пергаментного слоя с учетом принципа одревеснения лигнина в этом образовании
- Содержание крахмала в зрелом зерне Pisum sativum L. в связи с повреждением Bruchus pisorum L.
Введение к работе
В настоящее время наиболее опасным вредителем для культуры гороха является гороховая зерновка (Bnichus pisorum L.), которая ограничивает расширение его посевных площадей.
Гороховая зерновка ~ насекомое-монофаг, в качестве опасного вредителя известна с восемнадцатого века (Шапиро, 1985). В России в последние десятилетия в связи с климатическими изменениями ареал ее распространения существенно расширился и продвинулся к северу, и в условиях Орловской области Bnichus pisorum L. достигла порога экономической значимости к середине 90-х годов. Поврежденные брухусом семена гороха теряют в весе 12...35 % в зависимости от генетических особенностей сорта, всхожесть семян снижается на 56-85 %. Кроме того, семена гороха, зараженные данным вредителем, становятся опасными для употребления в пищу человеку и на корм скоту в связи с высокой их токсичностью.
Наиболее эффективный и экологически безопасный способ борьбы с фитофагом - создание и использование устойчивых сортов гороха, что способствует снижению опасности загрязнения пестицидами продукции и окружающей среды. Так, возделывание сортов сельскохозяйственных культур интенсивного типа, устойчивых к основным вредным объектам, позволяет снизить уровень численности вредителей и болезней на 25...30 %, повысить экономические пороги вредоносности в 1,5...2 раза, снизить потери урожая на 15...30 %, увеличить выход стандартной продукции на 15...20 %, снизить объем и кратность применения средств защиты растений на 30...70 %.
В связи с этим выработка методов быстрой оценки устойчивости растений, физиологической адаптации, однократного искусственного иммунитета приобретает приоритетное направление. Селекцию на
иммунитет ведут во многих странах, но из-за ограниченности знаний о механизмах устойчивости успехов в этом направлении не наблюдается.
Между тем, развитие методов генной инженерии позволило в последние годы создать трансгенные растения, обладающие устойчивостью к насекомым-вредителям. Так, получены трансгенные растения гороха и фасоли, устойчивые к жукам-зерновкам. Трансген ингибитора а-амилазы, введений в растение гороха, защищает семена от долгоносика при хранении (Ishimoto at all, 1989; Smith, 1990; Clement, 1992; Hardie, 1993; Schroeder, Barreatall, 1993; Shade at all, 1994; Schroeder at all, 1995). Некоторые лектины убивают гусениц, и их используют для борьбы с насекомыми-вредителями сельскохозяйственных культур (Cavalieri at all., 1995). Основная трудность, которая пока сдерживает использование генной инженерии в селекции растений, состоит в поиске и выделении хозяйственно-полезных генов. Однако работы в этом направлении активно ведутся. Вместе с тем, методы генной инженерии являются дорогостоящими и не везде и не всегда могут быть использованы для создания устойчивых растений.
В связи с этим нетрадиционная селекция может вестись и другим путем, а именно с помощью подбора для скрещивания тех растений, в которых количественные проявления морфолого-анатомических и физиолого-биохимических параметров, присущие устойчивым формам, наиболее ярко выражены, или путем регуляции и активации соответствующих генов (мутагенез, фитогормоны, минеральное питание и прочее). Следует отметить, что механизмы устойчивости растений к биотическим факторам среды, как правило, неспецифичны. Специфика заключается лишь в количественных проявлениях (как отмечалось раннее), что может служить маркерным признаком на устойчивость.
Для надежного и разностороннего выявления механизмов устойчивости изучаемых сортообразцов гороха необходимо проводить исследования в полевых и лабораторных условиях, используя как прямые, так и косвенные методы оценки. Исключительно важным аспектом работ в
этом направлении является разработка методов ускоренной оценки селекционного материала на повреждаемость Bruchus pisonim L.
Первоначально методы оценки сводились к сравнительному анализу потерь урожая зерна различных сортов в результате инвазии (Энтомологическая оценка селекционного материала зерновых и зернобобовых культур. Харьков, 1980). Но высокая вредоносность Bruchus pisonim L., неуклонное расширение его ареала требовали углубленного изучения особенностей биологии вредителя и механизмов устойчивости к нему растения-хозяина.
Актуальность темы. Устойчивость растений к вредным организмам один из важных факторов, определяющих высокие урожаи сельскохозяйственных культур и его стабильность. Разработка путей эффективного решения этой проблемы имеет большое народнохозяйственное значение.
Одним из наиболее вредоносных фитофагов, повреждающих семена гороха, является Bruchus pisorum L, (гороховая зерновка). При повреждении гороха гороховой зерновкой теряется до 30...40 % массы зерна, а всхожесть семян снижается на 70...90% (Вилкова и др., 1977; Малаханов, 1986; 1 Закладной, 1987; Старостин и др., 1988; Давлетов и др., 2002). Зерно засоряется экскрементами и остатками от частой линьки личинок, приобретает неприятный запах и вкус, что делает употребление его в пищу небезопасным для здоровья человека.
В поврежденном зерне содержатся высоколетальные алломоны -токсины, к которым относятся терпены, сердечные гликозиды, хиноны, хиперицин (синтезируемые самими насекомыми) и другие соединения (Харборн, 1985; Остроумов, 1986).
В связи с этим актуальным и своевременным является создание устойчивых сортов или индуцирование иммунитета.
Известно, что устойчивость растений определяется механизмами конститутивной и индуцибелыюй устойчивости. Первые определяются
анатомо-морфологическими особенностями, наличием химических барьеров (лигнином, лектинами, олигосахаридами и пр.). Индуцибельная же устойчивость возникает в ответ на внедрение патогена или фитофага, что выражается в синтезе элементов сигнальной системы (фитоалексинов, салицилата, жасмоната, ингибиторов гидролаз, оксидоредуктаз и др.). Экспериментальных данных по изучению механизмов устойчивости сельскохозяйственных культур к насекомым-вредителям, в том числе, гороховой зерновке Bruchus pisorum L,, крайне мало.
Цель и задачи исследований. Целью работы является сравнительное исследование физиолого-биохимических особенностей генотипов гороха, контрастных по устойчивости к Bruchus pisorum L. для их использования в селекции.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие . задачи:
Проанализировать потери урожая гороха в разные годы выращивания в связи с поврежденностью зерна Bruchus pisorum L.
Выявить особенности формирования пергаментного слоя створки бобов гороха как барьера для инвазии Bruchus pisorum L,
Провести биоскрининг сортов гороха, различающихся по устойчивости к Bruchus pisorum L., на содержание белка и углеводов.
Изучить динамику накопления токсичных веществ - ингибиторов гидролаз по фазам развития семян гороха.
Установить роль фенольных соединений в устойчивости гороха к вредителю.
Обозначить конститутивные и индуцибельные факторы, определяющие устойчивость гороха к Bruchus pisorum L.
Научная новизна исследований. Впервые получены данные биохимических особенностей различных сортов гороха, отличающихся по устойчивости к Bruchus pisorum L., исследован механизм толерантности к гороховой зерновке (установлено, что устойчивость гороха к брухусу
определяется скоростью образования пергаментного слоя створки боба, соотношением фракций белка с преимуществом альбуминов и высоким содержанием фенольных соединений).
Практическая ценность работы. Выявлены сорта гороха: Tigra, М-93-94, Зарянка, 94-61, Denica, которые могут быть использованы для селекции устойчивых сортов к гороховой зерновке. Полученные биохимические характеристики устойчивых сортов могут быть положены в основу методов создания трансгенных растений.
Запатентованный способ диагностики устойчивости сортов гороха по образованию пергаментного слоя сокращает сроки селекции, затраты на создание инфекционных фонов, снижает риски экологического загрязнения.
Характеристика основного вредителя Pisum sativum L.- Bruchus pi-sorum L.
Продовольственная проблема и, в частности, задача обеспечения человечества полноценным пищевым белком сохраняют свою актуальность, несмотря на колоссальный рост производства продовольствия в 50-80 гг. прошлого столетия (Brown, 1988; Шершнев, 1996; 1999; Браудо, 2000, Доценко и др., 2002). Актуальность проблемы обеспечения полноценным пищевым белком населения РФ подчеркнута в «Концепции государственной политики в области здорового питания и безопасности питания населения России на период до 2005 года» (Княжев, Большаков, 1998; Княжев, Онищенко и др., 1998). Белковой проблеме уделяется большое внимание и в рамках одного из приоритетных направлений развития науки в агропромышленном комплексе «Совершенствование технологических процессов по производству высококачественных, экологически-чистых продуктов питания», включающего несколько критических технологий федерального уровня (Богатырев, Тужилкина, 1995; Большаков, 1998). Дефицит растительного белка в России составляет 1,4 млн. т (из них половина приходится на долю пищевого белка). В рационе питания россиян дефицит белка составляет 30%, что с точки зрения медицины -неблагополучный факт. Однако, ускоренными темпами идет замена белков животного происхождения со сбалансированным аминокислотным составом на лимитированные растительные (Мартынов, 2000; Доценко и др., 2002).
Согласно зоотехническим нормам в 1 к. ед. должно содержаться 105 -135 грамм переваримого протеина. Фактически содержится 80 - 85 граммов. В концентрированных кормах доля бобовых должна составлять до 15 %, фактически содержится до 1 % (Антоний, 1980; Вавилов и др., 1983; Жеруков, 1996). В результате быстрого увеличения дефицита белка цены на него на мировом рынке возросли за последние годы более чем в 3 - 4 раза, в связи, с чем проблема растительного белка в мировом масштабе приобретает значение стратегического сырья (Жеруков, 1996).
Значение зернобобовых культур трудно переоценить, так как они входят в баланс зерна страны, а, следовательно, в уровень обеспечения населения продуктами питания. О возрастающей роли в качестве источника белка для питания человека и животных свидетельствует непрерывное увеличение доли указанных культур в общем производстве зерна. Как известно, зернобобовые культуры - один из главных источников ценного растительного белка (пищевого и кормового), качество которых не уступает соевому (Калле, 1991; Задорин, 2002; Schwenke, 1982; Gueguen, Cerletti, 1994; Kozlovska, Zdunczyk, Honke, 1998). Возможные урожаи протеина у главных видов зернобобовых , могут быть в два раза выше, чем у мятликовых зерновых, причем сырой протеин составляет в них почти полностью настоящий белок). Переработка растительного белка в животный высокозатратна. Дело в том, что использование растительного белка в составе кормов для производства белка животного приводит к потере от 70 до 95% растительного белка (в зависимости от вида конечной продукции) (Кале, 1991). В среднем для производства 1 кг животного белка расходуется около 7-11 кг белка растительного (Чабб, 1985; Задорин, 2001). К этому следует добавить, что затраты энергии при производстве животного белка в 19-164 раз выше, нежели при производстве белка. Укажем также на исчерпание возможностей расширения пастбищного скотоводства (Шерщнев, 1996; 1999) и на большой ущерб, наносимый биосфере при выращивании скота в животноводческих комплексах.
Любой живой организм формируется за счет белков растительного и животного происхождения. Все стадии жизнедеятельности клетки и организма совершаются при непременном участии белков, на долю которых приходится около половины сухой массы. Наиболее многочисленной группой белков являются высокоспециализированные ферменты, осуществляющие самые разнообразные химические и фотохимические реакции (Мартынов, 2000). Белки входят в состав соединительных и костных тканей, кожи, волос, выполняют динамическую опорную функцию, обеспечивают взаимосвязь всех органов, их механическую целостность и защиту. Они «умеют» делать все. Биосистемы всех уровней, в том числе и молекулы, являются «производителями» белков. Недостаток белка сказывается на физическом состоянии человека, снижает его способность сосредоточиться, выдерживать высокий ритм труда. В отношении взрослого населения последствия дефицита белка в рационе рассматривают как заболевание, которое можно устранить при переходе к сбалансированному питанию. Однако недостаток белка серьезно сказывается на развитии детей, потребность которых в белке особенно велика. Дефицит белка приводит к необратимым последствиям, а число детей в возрасте до 4 лет, не получивших нужное количество белков, достигает в развивающих странах 50%. Недостаток белка в питании вызывает детскую смертность, что составляет более 5 млн. детей ежегодно и отрицательно сказывается на умственном развитии, способности к учебе и поведении детей.
Поэтому компенсация животного белка за счет растительного весьма актуальна. Следует учитывать, что растительные белки в отличие от животных, не несут холестерина. Поэтому в Китае доля растительных продуктов в общем объеме питания составляет 89,7 %, в Японии 79,8 %, в России 72,4 %, Франции 59,7 % (Романенко, Тютюнников,1997). Кроме того, с животными белками в организм поступает холестерин, нарушающий нормальное функционирование сердечно-сосудистой системы (Кравцов и др., 2002; Лобачева, 2005).
В зерне зернобобовых и зеленой массе содержатся в достаточном количестве все восемь незаменимых аминокислот. Только зерно бобовых служит донором лизина в пищевых продуктах и комбикормах (в белке бобовых его содержится в 1,5-2 раза больше, чем в зерне зерновых). По коэффициенту переваримости белок семян зернобобовых культур близок к белку куриного яйца и молока. Калорийность семян зернобобовых растений практически такая же, как у пшеницы и почти в 2 раза выше, чем у говядины (Задорин,2002; Медведев, 2002).
Исключительно велика роль зернобобовых культур как средообразующего фактора. Благодаря их уникальной способности усваивать атмосферный азот с помощью клубеньковых бактерий, поселяющихся на корнях. При возделывании существенно улучшаются физические свойства почвы, изменяется микрофлора, угнетается сорная растительность, улучшается фитосанитарное состояние, накапливаются в почве органические остатки (зернобобовые уменьшают расход гумуса на выращивание культур севооборота), улучшается питательный режим по всем элементам. После уборки зернобобовых культур на 1 га в почве остается 20-70 ц корневых и пожнивных остатков, в которых содержится 45-130 кг азота, 10-20 кг фосфора, 20-70 кг калия. Благоприятное соотношение азота и углерода в пожнивных и корневых остатках способствует их активной мобилизации в процессе разложения и минерализации (Задорин, 1999; Медведев, 200)
Зернобобовые культуры возделывают в мировом земледелии на площади около 120 млн. га (13 % площади зерновых посевов). Много зернобобовых сеют в Индии и Китае, США и др. странах. Основные посевные площади зернобобовых культур сосредоточены в Российской Федерации, Украине, Белоруссии и Молдавии (Макаров и др., 2000).
Морфологические и физиолого-биохимические различия растений, устойчивых к болезням и вредителям
Устойчивость растительного организма - это его способность выживать при определенных значениях факторов среды, одно из проявлений надежности биосистем. Основа ее - закономерные изменения обмена веществ и саморегуляции на разных уровнях. Существуют два пути формирования устойчивости: на начальном этапе реакции организма на раздражение носят неспецифический характер, а затем на фоне неспецифических реакций вырабатываются специфические, приспособительные (ХроминскиЙ и др., 1973; Зарубина, 1985), Устойчивость или восприимчивость растения - результат взаимодействия двух геномов (растения и патогена). В природе встречаются растения, устойчивые ко всем патогенам. Одна из важнейших причин такой стойкости - наличие у них полевой (горизонтальной) устойчивости. Это такой тип устойчивости, при которой патоген развивается, но вследствие недостатка пищи в растении, из-за наличия механических преград и т.п. развивается медленнее, и потери урожая, поэтому невелики. Полевая устойчивость контролируется полимерными генами, каждый из которых не дает видимого эффекта устойчивости, но их различные сочетания определяют ту или иную ее степень (Volina и др., 1993).
Механический иммунитет растений обусловлен морфологическими особенностями растения-хозяина (Шуровенков и др., 1995). Химический иммунитет обусловлен химическими особенностями. У иммунных форм растений доля ферментов, устойчивых к метаболитам патогенов, более значительна, чем у неиммунных.
В соответствии с современными представлениями решающее значение в дезинтеграции жизненных функций насекомых имеют антипитательные соединения, в частности - продукты вторичного обмена растений. Наиболее устойчивы к влиянию метаболитов ряд продуктов вторичного обмена растений (окислительно-восстановительные ферменты, фитонциды, фитоалексины, алкалоиды, гликозиды, терпены, сапониты, фенольные соединения, ингибиторы свободно-радикальных реакций различной природы, рибосомо-инактивирующие белки, аминокислоты и проч,) (Запрометов, 1974, 1993; Метлицкий и др., 1976; Самородова-Бианки и др., 1979; Григорьева, 1989; Ветрова, Матренина и др., 1995; Ветрова, Полякова и др., 1995; Полякова и др., 1995; Конарев, 1997; Макарова и др., 1998; Шейн и др., 2001; Harborne at all, 1981; Rhodes, 1985; Stafford at all,1986; Christiansen at all, 1990; Funk at all, 1990; Schinitzler at all,1992; Delaney at all, 1994; Paine at all, 1997; Brignolas at all, 1998). Они оказывают токсическое воздействие на пищеварительный аппарат, эндокринную систему и нейрогуморальную системы насекомых и других вредителей растений. Известно, что у многих насекомых смертность только что отродившихся личинок от вторичных метаболитов достигает 80% (Кравченко, 1991).
Ниже приведем характеристику некоторых групп антипитательных соединений, хронологируя литературные источники.
Протеолитические ферменты играют важную роль в обмене веществ всех живых организмов, участвуя не только в процессе деградации белковых веществ, но и регуляции различных физиологических процессов через посредство реакций ограниченного протеолиза (Красильников и др., 2000).
Предполагается, что в растениях ингибиторы протеаз выполняют три основные физиологические функции: запасных белков растений, регуляторов активности эндогенных протеаз, компонентов защитной системы растений (Ибрагимов, 1999; Зайнутдинова, 2001).
Влияние ингибиторов на организм животных изучали в течение последних 50 лет. Было отмечено, что включение в рацион цыплят сырых соевых бобов приводит к замедлению их роста. Этот факт стимулировал изучение роли ингибиторов трипсина в метаболизме не только животных, но и насекомых (Хлуднев, 1991; Белозерский и др., 1993; Мосолов, Валуева, 1993; Micola at all, 1972; Ryan, 1981; Rackis at all, 1986; Tashiro at all, 1987; Nagasue at all, 1988; Mares at all, 1989; Ceciliani at all, 1994).
Ингибиторы a - амилазы широко распространены в растительном мире. У зернобобовых ингибиторы a - амилазы локализуются только в семенах, в форме гликопротеидов (Bionocore at all,1986). Последние выполняют функцию резервных белков. Обсуждается также вопрос о роли этих веществ в эндогенной защите растения от повреждения насекомыми и болезнями (Фомичева, 1992; Buenocore at all, 1986; Moreno at all, 1986, 1990; Ishimoto at all, 1989; Smith, 1990; Lajolo at all, 1991; Clement, 1992; Hardie, 1993; Schroeder, Barre at all, 1993; Shade at all, 1994; Schroeder at all, 1995). Так, китайские ученые вырастили генетически модифицированный устойчивый к бактериальным заболеваниям растений (бактериальной гнили) с помощью внедрения гена Ха21 (а - амилазы), изолированного из генома африканского дикого риса (Дженет Коттер, 2005). Выше мы уже говорили о защитной роли белка а - амилазы, выделенного из семян фасоли обыкновенной, который определяет устойчивость гороха к заражению гороховой зерновкой (Ishimoto at all, 1989; Smith, 1990; Clement, 1992; Hardie, 1993; Schroeder, Barre at all, 1993; Shade at all, 1994; Schroeder at all, 1995).
Лектины - гликозилированные белки, обладающие способностью связываться с поверхностью клеток, вызывая их агглютинацию. Они обнаружены в основном в семенах бобовых и зародышах пшеницы (Шакирова и др., 1992, 1993, 1999; Ямалеева и др., 1997, 1998, 2000). Долгое время лектины как и ингибиторы протеаз, были отнесены к числу антипитательных факторов (Thompson, 1988).
Связывая углеводы на поверхности лимфоцитов, лектины способны оказывать митогенный эффект и нарушить толерантность к орально потребляемым белкам пищи (Чулкова, 2002; Koninkx, 1992).
Пуроиндолины и другие белки - основные белки, содержащие пять дисульфидных мостиков и уникальный триптофановый домен, способный связывать липиды. Близкие к ним, переносящие липиды с одной мембраны на другую, обнаружены и других растений (Arondel at all, 1990; Cammue at all, 1995; Compoint at all, 1996). Все эти белки обладают и ярко выраженной антимикробной активностью (Черныш, 1977; Molina at all, 1993; Terras at all, 1995).
Оценка степени одревеснения пергаментного слоя с учетом принципа одревеснения лигнина в этом образовании
Наиболее эффективным и экологически безопасным способом борьбы растений с фитофагом - создание устойчивых к Bruchus pisorum L. сортов гороха. Исключительно важным аспектом работ в этом направлении является разработка методов ускоренной оценки селекционного материала на повреждаемость с Bruchus pisorum L..
Первоначально методы оценки сводились к сравнительному анализу потерь урожая зерна различных сортов в результате инвазии (Шапиро, 1985). Но высокая вредоносность Bruchus pisorum L., неуклонное распространение его требовали углубленного изучения особенностей биологии вредителя и механизмов устойчивости к нему растения-хозяина. Результатом комплексного подхода к проблеме явились методические рекомендации, опубликованные ВНИИ защиты растений (Вилкова и др., 1977; Шапиро и др., 1981). Здесь внимание акцентировано на сопряженности развития растений гороха и экологического цикла брухуса, в частности, на барьерной роли лигнифицированного пергаментного слоя как механизма структурно-химической устойчивости. Отмечено, что степень одревеснения этой ткани к моменту активного прохождения личинок через створку боба определяет успех заселения ими семян. Рекомендуется определение этого параметра на протяжении десятого - начала одиннадцатого этапов органогенеза с интервалом в 2 дня.
Цель нашего изучения заключалась в уточнении фазы развития растений гороха, на которой следует брать бобы на анализ, а также в максимальном упрощении и ускорении собственно процесса анализа.
Начало внедрения личинок вредителя в боб совпадает с прохождением им десятого этапа органогенеза, то есть с образованием и интенсивным ростом плодов в длину, несколько менее интенсивным ростом в ширину и незначительным в толщину. На десятом этапе органогенеза в мезофилле перикарпия плода происходит формирование сосудисто-волокнистых пучков. В результате усиленного деления клеток внутреннего эпидермиса начинается формирование пергаментного слоя.
Начало одиннадцатого этапа онтогенеза у гороха связано с прекращением объемного роста створок боба вследствие завершения одревеснения сосудов ксилемы и пергаментного слоя, В этот период инвазия -,. личинок зерновки уже практически невозможна. Срок оценки устойчивости сорта по скорости лигнификации пергаментного слоя ограничивается десятым этапом, прохождение которого характеризуется развитием семяпочек от зародышевых структур до стадии полного формирования семени, готового к процессу налива. В наших условиях Bruchus pisoram L. л после питания пыльцой гороха откладывает яйца на створки самых молодых бобов (Бондаренко и др., 1991). Эмбриональное развитие занимает б...10 дней. Внедрение вновь отродившейся личинки зерновки в боб - один из критических моментов в ее жизни. Скребущий ротовой аппарат личинки гороховой зерновки не приспособлен к прогрызанию одревесневших тканей растений. Поэтому проникновение личинок внутрь боба возможно лишь до начала одревеснения стенок сосудов и других элементов ксилемы, а также клеток пергаментного слоя. Таким образом, массовая инвазия вредителя приходится на период прохождения растением средней фазы десятого этапа. В процессе определения оптимального времени отбора полевого материала для анализа нами установлена тесная связь явления одревеснения пергаментного слоя створки боба со степенью развития зерна. Для сравнительной оценки устойчивости различных образцов гороха по степени лигнификации пергаментного слоя боба достаточно провести однократный отбор плодов с 3-4 яруса растений со средней степенью формирования семян (рис.8).
Среди многочисленных «барьерных» полимеров большую роль играют лигнины - специфические растительные полимеры опорных тканей вторичных оболочек растений. Лигнин по природе является линейным высокомолекулярным полимером, состоящим из производных ароматических спиртов (Кретович, 1986); в процессе одревеснения он откладывается в клеточных оболочках, которые, в свою очередь, содержат линейный полисахарид целлюлозу. В результате создаются условия для успешного использования поляризованного света в качестве контрастирующего фактора при микроскопировании. Поляризационная микроскопия основана на микроскопической анизотропии, то есть двойном лучепреломлении в биологических объектах, включающих преимущественно линейно организованные субмикроскопические частицы - такие, как целлюлоза и лигнин (Паутова, 1988). Отложение лигнина в пергаментном слое створки боба вызывает яркое высвечивание одревеснений его части в поляризованном свете. Следовательно, исключается необходимость химического окрашивания препарата, что значительно упрощает и ускоряет процесс анализа.
Оценку степени одревеснения пергаментного слоя осуществляли с учетом принципа продвижения лигнина в этом образовании. Лигнификация здесь проходит горизонтально, а не диффузно, и вектор этого процесса четко прослеживается проксимально, (то есть продвигается внутрь), от мезофила створки к ее внутреннему эпидермису. Рисунки 9, 10 демонстрируют поперечные срезы створки боба на протяжении десятого этапа онтогенеза гороха, в условиях проходящего (а, в, д) и поляризованного света микроскопа (б, г, е). На всех иллюстрациях (а, в, д) отчетливо видна уплотненная ткань пергаментного слоя, однако визуально определить начало и степень лигнификации практически невозможно. В поляризованном свете на рисунке 31 б отсутствуют светящиеся структуры. Это очень молодой боб и одревеснение еще не началось. Первые яркие лигнифицированные фрагменты видны на рис. 9г. Средняя фаза этапа отражена на иллюстрациях 9д, е и 10а-г, то есть фронтальное отложение лигнина, нарастание светящегося в поляризации слоя.
Содержание крахмала в зрелом зерне Pisum sativum L. в связи с повреждением Bruchus pisorum L.
Показатели относительной толщины пергаментного слоя к толщине створки бобов (%) варьируют от 6,83 до 68,16 % в группе восприимчивых (наименьшее значение у сорта Флагман, наибольшее - у сорта Аксайский 129; последние друг от друга отличаются на 61,33 %) и от 38,01 до 7,71 % у устойчивых сортов (наименьшее значение у сортообразца М-98-501, наибольшее - у сортобразца М-93-94; последние друг от друга отличаются на 30,3 %). В среднем, значение относительной толщины пергаментного слоя к толщине створки бобов выше у группы восприимчивых сортов, чем у устойчивых на 6,45 % (27,28 и 20,83 % соответственно).
Сходная вариативность толщины лигнифицированного пергаментного слоя внутри групп подтверждает мнение, что этот признак не является определяющим при оценке устойчивости гороха Bnichus pisorum L. (Вилкова Н.А. и др., 1977; Шапиро И.Д., 1981). Однако наличие невысокой, но отрицательной корреляции между относительной толщиной пергаментного слоя и повреждаемостью семян зерновкой (г5.6=-0,31) указывает на взаимосвязь признаков, хотя и недостаточную для оценки сортов. Возможно причина этого в том, что в этой фазе развития боба пергаментный слой, в основном, выполняет функцию опорной механической структуры.
Функцию структурно-химического барьера для проникновения личинок брухуса к семенам гороха пергаментный слой осуществляет раньше, в средней фазе десятого этапа органогенеза, что подтверждают данные таблицы 8. В таблице 9 приведены данные по степени лигнификации пергаментного слоя створки боба различных по устойчивости к брухусу сортообразцов гороха в средней фазе десятого этапа органогенеза.
В этот период толщина створки боба выше у группы восприимчивых сортов и составляет от 1100,11 (сорт Atlas) до 1209,38 мкм (сорт Демон), чем у группы устойчивых сортов - от 903,12 (сорт Denica) до 1003,12 мкм (сортообразец М-93-94). В среднем, значение толщины створок боба в среднюю фазу завершения десятого этапа органогенеза у восприимчивых сортов выше, чем у устойчивых на 207,3 мкм, или на 18 % (1167,71 и 960,41 мкм соответственно). В этот период положительная корреляция между толщиной створки боба и повреждаемостью семян зерновкой еще выше, г2_ 3=0,96. Практически отсутствует связь между площадью створки боба и процентом повреждения, г2-б=-0,08. Площадь створки у восприимчивых сортов колеблется в пределах от 383,24 (сорт Флагман 5) до 611,04 мкм (сорт Atlas), у группы устойчивых сортов - от 438,52 (сорт Denica) до 505,18 мкм (сорт Ранний 301). Среднее значение этого показателя у восприимчивой группы не намного превышает среднее значение площади створки боба у устойчивых сортов - на 23,9 мкм, или на 5 % (502,68 и 478,78 мкм соответственно). Таким образом, величина боба не связана с устойчивостью сорта к брухусу и не является диагностическим признаком. То есть площадь створки боба не имеет существенных различий при сравнении сортов гороха, различающихся устойчивостью к гороховой зерновке.
По-прежнему незначительно различаются по группам показатели толщины пергаментного слоя: от 181,25 9 (сорт Флагман 5) до 306,24 мкм (сорт Atlas) у восприимчивых (в среднем 257,29 мкм) и от 171,88 (сортоьразец М-93-94) до 240,62 мкм (сорт Denica) у устойчивых сортов (в среднем 215,59 мкм). Средние значения друг от друга отличаются на 41,7 мкм, или на 16 %. Но именно здесь мы видим существенные различия между группами в степени его лигнификации, то есть если у восприимчивых сортов одревеснело от 58,62 (сорт Флагман 5) до 74,72 % (сорт Демон) пергаментного слоя (в среднем - 67,92%), то для устойчивых эти показатели составляют 84,90 (сорт Ранний 301)...100,00 % (сорт Denica) и 90,72 % соответственно. Средние значения друг от друга отличаются на 22,8 %.
Хотелось бы отметить, что толщина створки и площадь створки боба (элементы структурного барьера) в группе устойчивых сортов у сорта Denica самые маленькие, однако величины толщины пергаментного слоя и степени одревеснения (элементы химического барьера) в этой группе у данного сорта самые высокие, тогда как зерно этого сорта не повреждается гороховой зерновкой (0,0 %).
Определилась тесная отрицательная корреляция между степенью одревеснения этой структуры в оптимальный для инвазии Bntchas pisorum L. период и итоговым повреждением семян на полевом инвазионном фоне (г2.5=-0,79).
Наши исследования подтверждают, что пергаментный слой боба на десятом этапе онтогенеза гороха функционирует как механизм структурно-химической устойчивости к Bruchus pisorum L. Эффективность его определяется степенью лигнификации в средней фазе прохождения этого этапа. Структура мезофила створки также влияет на уровень заселения семян гороха зерновкой,- более рыхлая ткань облегчает проникновение личинки к месту дальнейшего развития. Исследования показали, что процесс одревеснения стенок сосудов и других элементов ксилемы, а также клеток пергаментного слоя у гороха начинается в середине десятого этапа развития растений. Установлено, что сорта гороха существенно различаются между собой по времени начала, темпам формирования и мощности пергаментного слоя. Результаты выполненных исследований показали, что устойчивость того или иного сорта к зерновке обуславливается не столько абсолютной толщиной пергаментного слоя, сколько темпами его одревеснения к началу внедрения личинок вредителя в боб. Таким образом, судьба личинок и степень поврежденное сортов зависит от того, успеют ли они проникнуть в боб до того, как последний уже успел оформить достаточно мощный барьер из одревесневших клеток пергаментного слоя. Следовательно, признак устойчивости сортов гороха к брухусу, это когда совокупность морфолого-анатомических признаков выражается в увеличении компактности структурных параметров биологического объекта.
