Введение к работе
Актуальность темы. Современные методы генетической инженерии позволяют придавать растениям новые свойства, способствующие повышению устойчивости растений к фитопатогенным микроорганизмам. Устойчивые трансгенные растения повышают качество сельскохозяйственной продукции и одновременно снижают расход пестицидов, улучшая экологическую обстановку. Трансгенные растения имеют перспективы стать одним из самых дешевых биореакторов, позволяющих получать неограниченный набор биомолекул фармацевтического, медицинского и промышленного назначения.
Традиционный способ получения трансгенных растений основан на применении конститутивно экспрессируемых селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам или генов-репортеров. Однако после завершения скрининга трансгенных растений присутствие в их геноме маркерных генов становится бесполезным и даже потенциально опасным. За счет переопыления и горизонтального переноса генетического материала возможно неконтролируемое распространение селективных генов в природных популяциях растений или микроорганизмов. Такая возможность переноса селективных генов в последние годы воспринимается как основная проблема потенциальной биологической опасности генетически модифицированных растений. В связи с этими рисками разработка эффективных подходов к созданию безмаркерных трансгенных растений с повышенной биобезопасностью представляет собой актуальную задачу генетической инженерии растений.
Таким образом, получение биобезопасных растений с устойчивостью к фитопатогенным грибам и бактериям, а также для производства антимикробных веществ для терапии человека является актуальной задачей современной биоинженерии.
Цели и задачи исследования. Цель данной работы - получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, в том числе с повышенной биобезопасностью, экспрессирующих искусственный ген зрелой формы антимикробного пептида цекропинаРІ.
Для достижения указанной цели решали следующие задачи:
Создание векторных конструкций для переноса искусственного гена зрелой формы антимикробного пептида цекропина Р1 в растения.
Получение трансгенных растений рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1.
Сравнение уровня экспрессии цекропина Р1 в трансгенных растениях под контролем различных промоторов.
Получение биобезопасных трансгенных растений с повышенной устойчивостью к микробным фитопатогенам без применения селективных генов для скрининга трансформантов.
Молекулярно-генетический и физиолого-биологический анализ полученных трансгенных растений.
Исследование экологической безопасности полученных трансгенных растений.
Научная новизна работы. Созданы генетические конструкции с целевым геном цекропина Р1 под различными промоторами: рекомбинантный вектор pPCV91::cecPl, в котором ген cecPl клонирован под модифицированный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S с четырьмя энхансерами, и рекомбинантный вектор рВМ::сесР1, не содержащий селективных генов для скрининга трансформантов, в котором ген cecPl клонирован под контролем одинарного промотора CaMV 35S.
Получены трансгенные растения рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующие искусственный ген, кодирующий зрелую форму антимикробного пептида цекропина Р1. Уровень синтеза цекропина Р1 в растениях с геном cecPl под 4-х кратным промотором CaMV 35S был более чем в 10 раз выше, чем под этим одинарным промотором и составил 0,03% от общего содержания белка листьев.
С целью повышения биобезопасности трансгенных растений разработан способ получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген cecPl. Скрининг трансгенных растений проведен на основе прямой иммунологической детекции цекропина Р1 в клеточных экстрактах, что значительно сокращает время получения трансгенных растений. Показан стабильный синтез цекропина Р1 в растениях поколения ТІ.
Трансгенные растения рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующие искусственный ген цекропина Р1, обладали повышенной устойчивостью против бактериальных - Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae и грибных - Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium sporotrich, Phytophthora infestans фитопатогенных микроорганизмов. Показано, что трансгенные растения, экспрессирующие зрелую форму антимикробного пептида цекропина Р1 сохраняют способность к колонизации полезными ассоциативными микроорганизмами.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования вносят новый вклад в развитие методологии получения биобезопасных трансгенных растений. Полученные безмаркерные трансгенные
растения, экспрессирующие искусственный ген зрелой формы антимикробного
пептида цекропина Р1, перспективны для повышения продуктивности растений
и экологически безопасны. Трансгенные растения каланхоэ могут быть
использованы в медицине как продуцент лечебного сока с антимикробной
активностью. Разработанная методология получения безмаркерных
трансгенных растений, лишенных экспрессируемых селективных и
репортерных генов, позволит проводить с ними чистые эксперименты в
фундаментальной биологии. Результаты работы могут найти применение в
научных исследованиях в областях молекулярной биологии, биохимии и
физиологии растений, в том числе в Институте молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардта РАН, Институте физиологии растений
им. К.А. Тимирязева РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова и Всесоюзной академии сельскохозяйственных наук.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на II Международной научно-практической конференции «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005); IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); VI съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); VIII, X чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2006, 2011); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009); IX-XV Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005-2011); III Российском Симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007);
IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов
(Новосибирск, 2008); на II, III Международном симпозиуме «Физиология
трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2008, 2010);
XVIII, XXII Зимней молодежной научной школе (Москва, 2006, 2010);
IX конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология»
(Звенигород, 2008); Всероссийской конференции «Экотоксикология» (Пущино-
Тула, 2009); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к
неблагоприятым факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); Международной
научной конференции «Современное состояние и перспективы развития
микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008, 2010); Всероссийской
конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского
государственного университета им. A.M. Горького (Екатеринбург, 2010);
V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия
микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010);
Всероссийской научно-практической конференции «Инновационное развитие
профессионального образования в условиях университетского комплекса» (Бузулук, 2010); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010); Всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011).
Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований, Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека», Госконтрактом № 02.512.11.2337 по теме «Получение модифицированных растений и растительно-микробных ассоциаций для биоремедиационных технологий защиты окружающей среды».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах, 3 патента на изобретение, 17 статей в научных сборниках и других изданиях (без тезисов докладов).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 163 источников. Работа изложена на 145 страницах, иллюстрационный материал включает 39 рисунка и 6 таблиц.
