Содержание к диссертации
Введение
2: Обзор литературы
2.1 Общие положения
2.2. Альфа-подобные фнтовнрусы; содержащие тройной блок генов
2.2.1. Семейства Tubmieidae. 12
2.2.1.1.Род.е/іртипаг 12
2.2.1 .2. Род Pomovirus. 14
2.2.1.3. Род Pecluvirus.
2.2.1.4. Род Hordeivirus
2 2.2.2. Порядок Tymovirales
2.2.2 Г. Семейство Potexviridde
2.3: Методы изучения локализации транспортных белков фитовирусов 22
2.3.1.1. Субклеточное фракционирование белков ТБГ 22
2.3.1.1.1.Субклеточная локализация 6ТБП 21
2.3.1.1.2. Субклеточная локализация белков-ТБГ2 иТБЕЗ. 24
2.3.1.2. Субклеточная локализация транспортных белков тобамовирусов 25
2.3.1.3. Субклеточная локализация транспортных белков витивирусов, порядок Tymovirales 26
2.3.1.4. Субклеточная локализация транспортных белков представителей семейства Bromoviridae 27
2.3.1.5. Субклеточная- локщгазащгаг гранстгортных белко представителей семейства Comoviridae 27
2.3.1.6. Субклеточная локализация транспортных 28
белков представителей семейства Tombusviridae
2.3.2. Электронная микроскопия транспортных белков 28
2.3.2.1. Электронная микроскопия белков ТБГ 28
2.3.2.2. Электронна* микроскопия: транспортных: белков других вирусов растений 29
2.3.3. Изучение локализации транспортных белков методом лазерной конфокальной микроскопии 31
2.4 Изучение локализации, белков ТБГ методом флуоресцентной микроскопии 32
2.4. Комплементационный анализ транспортных белков 33
2.4.1. Гомологичная комплементация транспортных белков 33
2.4.2. Гетерологичная комплементация транспортных белков 34
2.4.2.1. Гетерологичная комплементация транспортных белков в положении т cis 35
2.4.2.2. Гетерологичная комплементация транспортных, белков в положении in tram 37
2.4.2.2.1. Гетерологичная комплементация транспортных белков с помощью рекомбинантньгх конструкций 38
2.4.2.2.2. Гетерологичная комплементация транспортных белков вирусов в трансгенных растениях 39
2.4.2.2.3. Гетерологичная комплементация вирусного транспорта с использованием вирусов-помощников 41
2.5. Структура и свойства белков тройного блока генов . 42
2.5.1. Особенности первичной структуры белка ТБГ1 43
2.5.2. Особенности первичной структуры белков ТБГ2 иж ТБГЗ 44
2.5.3. Экспрессия белков ТБГ 45
2.5.4. Биохимические и функциональные свойства белка ТБП 47
2.5.5. Функции белков ТБГ2 и ТБГЗ 50
2.5.6. Возможная схема транспорта ТБГ-содержащих вирусов 52
3. Материалы и методы 54
3.1. Реактивы и материалы 54
3.2. Ферменты и наборы 54
3.3. Векторы для клонирования и бактериальные штаммы. 55
3.4. Среды, использовавшиеся при культивировании 55
3.5. Выделение плазмидной ДНК 55
3.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидной 56
3.7. Электрофорез в агарозном геле 57
3.8. Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля, 57
3.9. .Цитирование фрагментов ДНК 57
3.10. Трансформация растительных тканей 57
3.11. Трансформация бактериальных клеток A. Uimefaciens плазмидной ДНК 58
3.12. Выделение тотального препарата нуклеиновых кислот из клеток A. tranefeciens 59
3.14. Рестрикционный гидролиз тотального препарата ДНК, выделенного из клеток A.tumefaciens 60
3.1.5.ДНК-блотинг 61
3 1 6. Гибридизация нуклеиновы кислот, иммобилизованных. на найлоновом фильтре 62
3.17. Синтез зонда для гибридизации. 62
3.18. Выделение препарата тотальной РНК из растительных тканей 63
3.19.Электрофорез РНК в денатурирующем геле 64
3.20.йммунодетекция белков 64
3.21. Субклеточное фракционирование растительных тканей 65
3.22. Разделение клеточных мембран в градиенте плотности сахарозы 66
3.23. Экстракция белков из препарата мембран. 67
3.24. Выделение РНК из фракций протяженного градиента сахарозы 67
3.25. Флотация мембранных препаратов 67
4.Результаты 68
4.1. Получение трансгенных растений, экспрессирующих
белок ТБГЗ ГОТОМ и белок ТБГЗ ПЛВМ, слитого с GFP. 68
4.2. Иммунодетекция белков 18К и GFP-18K в трансгенных и зараженных растениях. 70
4.3. Эпифлуоресцентная микроскопия трансгенных растений, экспрессирующих. ген. белка GFP- 18К. 78
4.4. Функциональная активность белков 18К и GFP-18K, экспрессируемых в трансгенных растениях 79
4.5. Субклеточное фракционирование растительных тканей, экспрессирующих белки 18К и GFP-18К 81
4.6. Исследование мембранной природы белков 18К и GFP-18К. 82
4.7. Локализация белков 18К и GFP-18K в
эедоплазматическом ретикулюме. 86
Обсуждение результатов 93
Выводы 100
Список литературы 101
- Альфа-подобные фнтовнрусы; содержащие тройной блок генов
- Методы изучения локализации транспортных белков фитовирусов
- Изучение локализации, белков ТБГ методом флуоресцентной микроскопии
- Структура и свойства белков тройного блока генов
Введение к работе
Предметом молекулярной фитовирусологии является исследование репликации и экспрессии вирусного генома, а так- же взаимодействия вирусного патогена с растением — хозяином; Одной из ключевых проблем является изучение механизмов транспорта вирусов в зараженном растении. Основную роль. в вирусном, транспорте, играют вирус-кодируемые транспортные белки, которые обеспечивают перенос вирусного, генома вігутри клетки, от сайтов репликации к плазмодесмам, межклеточный транспорт, а так же распространение вирусного генома по всему растению (Atabekov and Dorokhov, 1984; Carrington etal., 1996).
Транспортные белки фитовирусов делятся на несколько классов, одним из которых является группа белков, кодируемых тройным блоком генов (ТБГ) (Morozov etal:, 1987; 1989). В завиеимосги or группы вирусов ТБГ может находиться в различных участках вирусного генома, но взаимное расположение генов ТБП, ТБГ2 и ТБГЗ и особенности кодируемых ими белков всегда остаются неизменными. Мутации в любом из генов ТБГ приводят к потере вирусом транспортных функций (Petty and Jackson, 1990; Beck et al, 1991; Gilmer et al., 1992; Herzog et al, 1998). Среди белков ТБГ наиболее хорошо изучен 6ТБГ1. Для него показана РНК-связывающая, НТФ-азная и хеликазная активности (Bleykasten et al.,\996; Kalinina et al., 1996; 2001; 2002; Donald et al., 1997; Wung et al., 1999; Liou et al., 2000), кроме того, хорошо изучено его распределение к клетке (Niesbach-Klosgen et al., 1990; Donald et al., 1993; Rouleau et al., 1994; Morozov et al, 1999; Erhardt et al, 1999; 2000; Lawrence and Jackson, 2001). В отличие от 6ТБП, биохимические свойства белков ТБГ2 и ТБГЗ изучены слабее. Это обусловлено высокой гидрофобностью этих белков. Локализация 6ТБГ2 в клетках зараженных растений была определена достаточно давно (Niesbach-Klosgen et al, 1990; Donald et al., 1993), однако попытки детектировать биохимическими методами 6ТБГЗ в клетках зараженных растений до сих пор не были успешными (Niesbach-Klosgen et al, 1990; Donatd et al, I99J; Khstmamurthy et al, 2003). Тем не менее в настоящий момент появилось достаточно много сведений о локализации этого белка ири экспрессии его с помощью различных векторных систем (Solovyev et al, 2000; Cowan et al, 2002; Krishnamutrfhy et al, 2003).
Альфа-подобные фнтовнрусы; содержащие тройной блок генов
Геном вирусов, имеющих тройной блок генов, представляет собой однонитевую РНК положительной полярности. Все вирусы, имеющие в составе генома ТБГ, относятся к супергруппе альфа-подобных вирусов и имеют два характерных признака. Во-первых, их геномные РНК всегда несут кэп-структуру па 5 конце и поли-Л-тракт и/или тРНК подобігую структуру на З конце. Во-вторых, они обладают характерным набором инвариантных доменов репликационных белков, а именно, домен, характерный для РРТЮ-зависимой РНК-полимеразы, относящейся к супергруппе 3, хеликазньгй домен, характерный для суперсемейства I, и метил-гуанилил-трансферазньга домен (Goldbach, 1987; Коопіп and Dolja, 1993). В состав супергруппы альфа-подобпых вирусов входят два семейства, геном представителей которых содержит ТБГ. Это семейства Tubiviridae и Potexviridae. Семейство Tubiviridae объединяет несколько родов вирусов с палочковидными вирионами. Строение геномов у различных родов может существенно отличаться. В состав генома представителей семейства может входить от одного до пяти сегментов РНК. В геномах представителей родов Tobamovinis, Tobravirus и Furovirus закодировано по одному транспортному белку, относящемуся к классу тобамоподобных ТБ, тогда как у вирусов, относящихся к родам Pomovirus, Peclwirus, Hordeivirus и Benyvirus, транспортные функции выполняют белки тройного блока генов Вирус некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) является единственным представителем рода Benivirus. Геном ВНПЖС состоит из 4-5 (в зависимости от штамма) кэпированных и полиадснилированных сегментов РНК (Richards and Tamada, 1992; Miyanishi et ai, 1999; Koenig and Lennefors, 2000). Первый и второй сегменты РНК необходимы для репликации и вирусного транспорта соответственно. Функции третьей РНК предположительно связывают с вирусным транспортом и развитием симптомов (Jupin et al, 1992; Richards and Tamada, 1992; Lauber et alt 1998). PHK 1 ВНПЖС содержит единственный ген, продуктом которого является белок с молекулярной массой 273кДа.
Данный продукт имеет в своем составе метил-гуанилил-грансферазный, хеликазный и полимеразный домены. Подобный набор функциональных доменов характерен для всех членов предполагаемого семейства Tubiviridae, но решгаказа ВНПЖС обладает одной особенностью. Между хеликазным и полимеразным доменами она содержит аминокислотную последовательность, характерную для папайя-подобной протеиназы. В результате автопротеолитической активности продукт трансляции РНК 1 расщепляется на два полипептида-РНК зависимую РНК-полимеразу с молекулярной массой ббкДа и белок с содержащий мотивы МЕТ и ХЕЛ" (Richards and Tamada, 1992; Henn et al, 1997).
В геномной РНК 2 содержится 6 ОРТ: ОРТ I кодирует вирусный БО с молекулярной массой" 2 ІкДа. Помимо своей" структурной функции, этот белок учасгвует в дальнем транспорте вируса. В результате проскока амбер стоп-кодона ОРТ 1 образуется полипептид с молекулярной массой 75кДа, являющийся минорной компонентой вирусного кансида. Этот полипептид необходим для переноса вируса патогенным грибом Роїутуха betae и участвует в созревании вирионов (Boiizoubaa, et al, 1986; Schitt et al, 1992; Tamada et al, 1991, 1996; Richards and Tamada, 1992). Продукты OPT 3, 4 и 5 представляют собой белки ТБГ, необходимые для вирусного транспорта. Это белки с молекулярной массой 42кДа, 13 кДа (бТБГ2)и 15кДа (6ТБГЗ) (Richards and Tamada, 1992; Gilmer et al, 1992). Продукт OPT 6, экснрессирующийся с собственной сгРНК, нредсгавляег собой маленький (14 кДА) цистеин-богатый белок, вероятно, участвующий в регуляции накопления вирусной РНК и синтеза БО и являющийся супрессором посттрансляционного умолкания генов (ПТУГ) (Bouzoubaa, et al, 1986, Gilmer etal, 1992, Wt\metal, 1995). Геномная РНКЗ имеет две ОРТ, кодирующие белки с молекулярной массой 25кДа и 4.6кДа. Lauber и др., (1998), показали, что цис-элементы РНКЗ участвуют в дальнем транспорте вируса. Геномная РНК 4 кодирует белки с молекулярной массой 6.6 Кда и 31 кДа. Полные нуклеотидные последовательности были определены для следующих представителей рода Pomovirus: вируса кустистости верхушек картофеля (ВКВК), почвснно-трансмиссионный вируса свеклы (ПТВС), Q вируса свеклы (QBC), вируса некроза кормовых бобов (ВНКБ) (Scott et al, 1994; Kashivazaki el al, 1995; Koenig and Loss, 1997; Koenig et al, 1998; Lu et al., 1998; Savenkov et al, 1999). Геном представителей рода Pomovirus состоит из трех РНК. Вирусная РНК кэпироваиа и имеет протяжегагую нетранслируемую последовательность, образующую тРНК-подобную структуру. РНК I ШВС содержит две ОРТ, с которых транслируются два белка с молекулярными массами 145кДа и 204кДа.
Меньший полипептид содержит хеликазный домен, харакгерный для суиерсемейства 1 и метил-трансферазный домен. В результате проскока рибосомой стоп-кодона образуется второй белок, имеющий кроме хеликазного и метил--трансферазного доменов аминокислотную последовательность, характерную для РНК-зависимой РНК-полимеразы супергруппы 3 (Koenig and Loss, 1997). Геномная РНК 2 ПТСВ, QBC, ВБНК (в случае ВКВК го РНКЗ) кодирует два полипротеина. Это БО с молекулярной массой 19кДа и белковый продукт с молекулярной массой 104 кДа, образующийся в результате супрессии первого терминирующего кодона. Этот белок значительно варьирует по длине у различных представителей рода Pomovirus. Он входит в состав вирусного капсида и, вероятно, является детерминантой при переносе вируса почвенными грибами. РНК2 QBC содержит еще две дополнительных ОРТ кодирующие отдельные
Методы изучения локализации транспортных белков фитовирусов
Субклеточное фракционирование является достаточно распространенным методом изучения внутриклеточной локализации вирусных белков. Этот метод наряду с методом электронной микроскопии с использованием иммунозолотого мечения начал применяться с восьмидесятых годов двадцатого столетия (Watanabe et al, 1986; Godefroy-Colbum et al., 1986; Shanks et al., 1989). Он основан на разделении гомогенной суспензии растительных тканей на несколько фракгп й как с помощью фильтрования, так и с помощью ступенчатого центрифугирования. В процессе фильтрования дебриса и последующей его огмывки в буфере, содержащем сильный неионный детергент (Triton X-100), получают фракцию клеточных стенок (CW) и экстракт мембранных структур смытых с клеточных стенок (ST) ( Godefroy-Colburn et al., 1986; Niesbach-Klosgea et al., 1990). При двухступенчатом центрифугировании фильтрата образуются осадки фракции Р1, преимущественно содержащей клеточные ядра, хлорогагасты и часть клеточных митохондрий, и фракции Р30, обогащенной клеточными мембранами (митохондрий, Гольджи, плазматическая мембрана, большая часть ЭР) и осколками других органелл. Супернатант, оставшийся после конечного центрифугирования, представляет собой фракцию растворимых белков, состоящую из белков клеточного цитозоля и растворимых белков из разрушенных органелл (Niesbach-Klosgen et al, 1990). Иногда супенатант подвергается дополнительной стадии центрифугирования при lOOOOOg для того, чтобы отделить мелкие микросомы, в основном состоящие из мембран ЭР, и нолисомьг от растворимых белков (Kaplan et al, 1995; Ward et al., 1997; Fujita et al., 1998). Безусловно, этот метод является довольно приблизительным, поскольку разделение содержимого клетки весьма условно. Основываясь на данных субклеточного фракционирования нельзя с точность утверждать, что искомый белок ассоциирован с определенным видом органелл. Зачастую, результаты субклеточного фракционирования, полученные в ходе одних экспериментов, не подтверждаются другими опытами (Davies et at., 1993; Kalinina et ai, 1998). На экспериментальные данные может влиять выбор вида растения, возраст листьев или стадия инфекции (Chang etal., 1997; Erhardt et al.y 1999). Тем не менее, с помощью этого метода можно весьма наглядно определить распределение искомого белка в растительной клетке.
Белок ТБГ1 встречается во всех фракциях тканей инфицированных или трансгенных растений. Тем не менее, метод субклеточного фракционирования не дает однозначных сведений относительно того, какая фракция в наибольшей степени обоїшцена этим белком. Например, по одним данным, наибольшее количество белка 25К ХВК было найдено главным образом во фракции PI (Davies et al, 1993), а по другим во фракции S30, хотя небольшие количества 6ТБГ1 присутствовали в мембранной фракции и во фракции клеточных стенок инфицированных листьев Nicotiana tabacum и Nicotiana benthamiana (Kalinina et al.y 1998). Аналогичные данные получены для бТБП потексвируса мозаики лисохвост (ВМЛ) (Rouleau et al., 1994). Напротив, у потексвируса мозаики бамбука 6ТБГ1 был детектирован во фракции клеточных стенок и в мембранной фракции, выделенных из инфицированных тканей N. benthamiana, в то время как при анализе инфицированных листьев Chenopodium quinoa белок обнаруживался только во фракции клеточных стенок (Chang et ai, 1997). У ТБГ-содержаших представителей семейства Tubiviridae аналогичный белок так же присутствует в основном во фракции клеточных стенок. Например, бТБП ВКА был детектирован только в CW фракции системно инфицированных листьев N. benthamiana,а при анализе инокулированных листьев, помимо клеточных стенок белок обнаруживался и в мембранной фракции (Erhardt et al, 1999). Белок ТБГ1 ВШМЯ так же был найден в основном в CW фракции, в остальных фракциях он присутствовал в незначительных количествах (Donald et al, 1993). В исследованиях Cowan и др., (2002), 6ТБГ1 помовируса ВКВК был детектирован во всех фракциях листьев N. benthamiana исключая фракцию растворимых белков, а 6ТБП ВНПЖС обнаруживался только во фракции PI (Niesbach-Klosgen ef al., 1990).2.3.1.1.2. Субклеточная локализация белков ТБГ2 и ТБГЗ.
Белки ТБГ2 и ТБГЗ содержат участки последовательностей гидрофобных аминокислотных остатков, поэтому для этих белков характерны мембраносвязывающие свойства (Morozov et al, 1987; 1989). Очевидно, именно этот факт влияет на то, что 6ТБГ2 присутствует в основном в мембранной фракции (Niesbach-Klosgen et al., 1990; Donald et al., 1993; Cowan et at., 2002). Впрочем, незначительные количества белка могут присутствовать во фракции клеточных стенок (Niesbach-Klosgen et al., 1990; Donald et al, 1993), в PI фракции (Niesbach-Klosgen et al, 1990; Donald et al, 1993; Cowan et al, 2002) или в ST-экстракте (Niesbach-Klosgen et al., 1990). Небольшое количество белка было также обнаружено во фракции растворимых белков, что довольно сложно объяснить, учитывая мембранную природу 6ТБГ2 (Cowan et al., 2002). Субклеїочная локализация 6ТБГ2 исследовалась только для ТБГ-содержащих представителей семейства Tubivihdae, но, учитывая высокую консервативность последовательностей 6ТБГ2 всех родов, следует ожидать, что локализация 6ТБГ2 потексвирусов будет аналогичной.
В работе HefTeron и др. (1997) показано, что 6ТБГЗ ХВК, выделенный из инфицированных и трансгенных растений, ассоциирован только с клеточными стенками. Однако эти данные коррелируют с другими, опубликованными в работе Cowan и др., (2002), в которойпоказано, что бТБГЗ ВКВК находится в основном в мембранной и ядерной фракциях (РЗО и Р1), и лишь незначительные его количества присутствуют во фракции клегочных стенок. Следует отметить, что данные результаты были получены при экспрессии бТБГЗ в растениях iV. benthamiana с помощью рекомбипаптпого вектора на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ). Попытки изучения локализации этого белка в инфицированных растениях производились и ранее, однако они не были столь успешными (Niesbach-Klosgen et al, 1990; Donald et al, 1993; BCrishnamurthy et al, 2003). Существует несколько предположений, почему
Изучение локализации, белков ТБГ методом флуоресцентной микроскопии
Белок ТБГ1 встречается во всех фракциях тканей инфицированных или трансгенных растений. Тем не менее, метод субклеточного фракционирования не дает однозначных сведений относительно того, какая фракция в наибольшей степени обоїшцена этим белком. Например, по одним данным, наибольшее количество белка 25К ХВК было найдено главным образом во фракции PI (Davies et al, 1993), а по другим во фракции S30, хотя небольшие количества 6ТБГ1 присутствовали в мембранной фракции и во фракции клеточных стенок инфицированных листьев Nicotiana tabacum и Nicotiana benthamiana (Kalinina et al.y 1998). Аналогичные данные получены для бТБП потексвируса мозаики лисохвост (ВМЛ) (Rouleau et al., 1994). Напротив, у потексвируса мозаики бамбука 6ТБГ1 был детектирован во фракции клеточных стенок и в мембранной фракции, выделенных из инфицированных тканей N. benthamiana, в то время как при анализе инфицированных листьев Chenopodium quinoa белок обнаруживался только во фракции клеточных стенок (Chang et ai, 1997). У ТБГ-содержаших представителей семейства Tubiviridae аналогичный белок так же присутствует в основном во фракции клеточных стенок. Например, бТБП ВКА был детектирован только в CW фракции системно инфицированных листьев N. benthamiana,а при анализе инокулированных листьев, помимо клеточных стенок белок обнаруживался и в мембранной фракции (Erhardt et al, 1999). Белок ТБГ1 ВШМЯ так же был найден в основном в CW фракции, в остальных фракциях он присутствовал в незначительных количествах (Donald et al, 1993). В исследованиях Cowan и др., (2002), 6ТБГ1 помовируса ВКВК был детектирован во всех фракциях листьев N. benthamiana исключая фракцию растворимых белков, а 6ТБП ВНПЖС обнаруживался только во фракции PI (Niesbach-Klosgen ef al., 1990).
Белки ТБГ2 и ТБГЗ содержат участки последовательностей гидрофобных аминокислотных остатков, поэтому для этих белков характерны мембраносвязывающие свойства (Morozov et al, 1987; 1989). Очевидно, именно этот факт влияет на то, что 6ТБГ2 присутствует в основном в мембранной фракции (Niesbach-Klosgen et al., 1990; Donald et al., 1993; Cowan et at., 2002). Впрочем, незначительные количества белка могут присутствовать во фракции клеточных стенок (Niesbach-Klosgen et al., 1990; Donald et al, 1993), в PI фракции (Niesbach-Klosgen et al, 1990; Donald et al, 1993; Cowan et al, 2002) или в ST-экстракте (Niesbach-Klosgen et al., 1990). Небольшое количество белка было также обнаружено во фракции растворимых белков, что довольно сложно объяснить, учитывая мембранную природу 6ТБГ2 (Cowan et al., 2002). Субклеїочная локализация 6ТБГ2 исследовалась только для ТБГ-содержащих представителей семейства Tubivihdae, но, учитывая высокую консервативность последовательностей 6ТБГ2 всех родов, следует ожидать, что локализация 6ТБГ2 потексвирусов будет аналогичной.
В работе HefTeron и др. (1997) показано, что 6ТБГЗ ХВК, выделенный из инфицированных и трансгенных растений, ассоциирован только с клеточными стенками. Однако эти данные коррелируют с другими, опубликованными в работе Cowan и др., (2002), в которойпоказано, что бТБГЗ ВКВК находится в основном в мембранной и ядерной фракциях (РЗО и Р1), и лишь незначительные его количества присутствуют во фракции клегочных стенок. Следует отметить, что данные результаты были получены при экспрессии бТБГЗ в растениях iV. benthamiana с помощью рекомбипаптпого вектора на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ). Попытки изучения локализации этого белка в инфицированных растениях производились и ранее, однако они не были столь успешными (Niesbach-Klosgen et al, 1990; Donald et al, 1993; BCrishnamurthy et al, 2003). Существует несколько предположений, почему не удавалось детектировать бТБГЗ. Во-первых, существовал ряд трудностей на стадии экспрессии белка для получения антител (Niesbach-Klosgen et al, 1990; Donald et al., 1993). Во-вторых, предполагается, что уровень накопления бТБГЗ во время вирусной инфекции крайне низок, а время экспрессии незначительно (Niesbach-Klosgen et al, 1990; Donald et al., 1993; Zhou and Jackson, 1996; Morozov and Solovyev, 2003). В-третьих, нельзя исключить вероятность быстрой деградации белка и/или изменения конформации эпитопов в ходе денатурирующего электрофореза (Niesbach-Klosgen etal, 1990; Donald etal, 1993).
Структура и свойства белков тройного блока генов
У ряда альфаподобных вирусов была выделена группа перекрывающихся генов названная тройным блоком генов. ТБГ является достаточно консервативным модулем, цистроны которого имеют инвариантное положение друг относительно друга. Но несмотря на это, у различных родов вирусов месгоиоложение ТБГ весьма огличаегся (Bouzoubaa et al, 1986; Gustafson and Armour, 1986; Morozov et al, 1987; 1989; Froster et al, 1988; Huisman et al 1988; Skyabin et al 1988a, b; Rupasov et al., 1989) Белковые продукты ТБГ обозначил- как 6ТБГ1, 6ТБГ2 и 6ТБГЗ (Solovyev et al, 1996а). Изучение этих белков показало, что они имеют непосредственное отношение к вирусному транспорту (Petty and Jackson, 1990а; Beck et al, 1991; Gilmer et al, 1992; Herzog et al, 1998).
В кластере генов тройного блока цистрон 6ТБГ1 занимает 5 -проксимальное положение. Белок ТБГ1 наиболее крупный из белков ТБГ. Тем не менее, его размеры сильно варьируют у различных родов ТБГ-содержащих вирусов. У представителей семейства Potexviridae молекулярная масса 6ТБГ1 колеблется от 25 до 28 кДа, тогда как молекулярная масса 6ТБП представителей семейства Tubiviridae достигает 39-63 кДа (Solovyev et al, 1996b; Wong et al, 1998; Erhardt et al, 1999). Это обусловлено некоторыми отличиями в строении белков ТБГ1, что до некоторой степени влияет на функциональные различия белков ТБГ1 у разных родов вирусов. Поэтому, в настоящий момент белки ТБГ1 принято подразделять на два класса: первый класс составляют 6ТБГ1 трдеи-, помо-, пеклу- и бенивирусов (гордешюдобные); ко второму относят 6ТБГ потеке-, карла-, фовеа- и аллексвирусов (потексподобные) (Morozov and Solovyev, 2003). Основной общей чертой 6ТБГ1 является их принадлежность к классу НТФазных/хеликазных белков относящихся к суперсемейству 1 (Gorbalenya et al, 1989; Gorbalenya and Koonin, 1993; Koonin and Dolya, 1993). Для этого семейства характерно наличие субдоменов 1А (НТФ-азная активность), 1В (связывание одноцепочечной ДНК), 2А и 2В, участвующих в дестабилизации спирали ДНК (Velankar et al, 1999; Garsia-Castillo et al, 2003). Однако, в последовательности белков ТБГ1 присутствуют только субдомены 1А и 2А," включающие в себя мотивы I, la-IV и V, VI, соответственно. Для всех белков ТБГ1 характерна высокая степень гомологии хеликазного домена (Rouleau et ah, 1994; Donald et al, 1995; Solovyev et al 1996a; Wung et al, 1999).
У потексподобных белков ТБГ1 практически вся последовательность составляет хеликазный домен. В то же время у представителей семейства Tubiviridae хеликазный домен занимает лишь С-концевую половину белка, а N-концевая часть существенно варьирует как по длине так и по последовательности (Donald et al, 1995; Solovyev et al, 1996a). 3aисключением участков предшествующих хеликазному домену, в аминопроксимальной половине не наблюдается достоверного сходства аминокислотных последовательностей. Тем не менее, общей чертой для всех гордеиподобных белков ТБГ1 является наличие одного или двух участков с высоким содержанием положительнозаряженных аминокислотных остатков. Белок ТБП гордеивирусов содержит два таких участка, тогда как в последовательности белков ТБП немо-, пеклу- и бенивирусов присутствует только по одному такому участку (Bleykasten et al, 1996; Solovyev et al, 1996a; Morozov and Solovyev, 2003).
Для белков ТБГ2 и 3 характерно наличие протяженных сегментов с высоким содержанием гидрофобных аминокислотных остатков. Это указывает на возможность их ассоциации с клеточными мембранами (Morozov et al., 1987, 1989; Solovyev et al., 1996b). Данная гипотеза получила подтверждение в ряде исследований (Niesbach-Klosgen et al., 1990; Donald et al, 1993; Hefferon et al, 1997c; Solovyev et al, 2000; Cowan /a/., 2002).
У всех ТБГ-содержащих вирусов белки ТБГ2 обладают высокой степенью схожести структуры. В N-концевой и С-концевой областях 6ТБГ2 содержатся два высоко гидрофобных сегмента. Между ними заключен учасюк с большим содержанием гидрофильных аминокислотных остатков. Для него характерно наличие высоко консервативного мотива GDx6GgxYxDG. В карбоксипроксимальной области 6ТБГ2 за гидрофобным сегментом расположен короткий участок, обогащенный остатками цистеина (Solovyev et al, 1996b; Morozov and Solovyev, 2003).
В отличие от 6ТБГ2 белки ТБГЗ существенно различаются длине полипептидной цепи. Исходя из этого, белки ТБГЗ можно условно разделить на две группы. В группу 1 входят белки ТБГЗ гордеи-, помо- и пеклувирусов. Их молекулярная масса составляет от 18 до 24 кДа. У всехбелков ТБГЗ в N-концевой части присутствует протяженный отрицательнозаряженный участок с консервативным мотивом НхххСхСххС, далееследуют два высоко гидрофобных сегмента и оіраниченная имигидрофильная область с консервативным консенсусомQDLNxi3Px6QxxPxG. Группу II представляют 6ТБГЗ вирусов семейства Pofexviridae. Для них характерно наличие только одного гидрофобного сегмента в N-концевой половине и гидрофильной области с консервативной последовательностью CxjGxgC на С-концевом участке полипептидной цепи (Solovyev et aL, 1996b; Morozov and Solovyev, 2003).
Исходя из правил Sipos и Von Heijne, 1993, считается, что молекулы белка ТБГ2 имеют U-образную конфигурацию и расположены так, что терминальные гидрофильные последовательности обращены в сторону цитоплазмы, а центральная гидрофильная область экспонирована в люменальное пространство. Напротив, для гордеиподобных 6ТБГЗ предложена обратная ориентация (Solovyev et al., 1996b).
Характерной чертой всех альфаподобных вирусов является экспрессия 5 -дистальных генов с отдельной сгРНК. В соответствии с этим выражение белков ТБГ так же происходит при участии субгеномных 3 -котерминальных РНК (Agranovsky and Morozov, 1999). Белок ТБГ1 (в случае, если он находится не в 5 терминальном положении) и белок ТБГ2 транслируются с собственной сгРНК. Для некоторых представителей семейства Poxexviridae были найдены последовательности являющиеся промоторами субгеномной РНК лежащие выше гена 6ТБГ1 (Kim and Hemenway, et al, 1997; Lee et al, 2000), в то время как для сгРНК белков ТБГ2 иЗ подобные элементы найдены не были. Это позволяет предположить, что для инициации синтеза сгРНК с которой транслируются гены белков ТБГ2 и 3 существуют собственные неканонические элементы последовательностей, что подтверждается сравнением последовательностей гордсивирусов в ходе которого передгенами белков ТБГ1 и 2 были обнаружены элементы, возможно являющиеся промоторами для сгРНК (Solovyev et al, 1996; Savenkov et al, 1998) Для белка ТБГЗ сгРНК найдено не было (Guilford and Frosler, 1986; Dolja et al 1987; Gilmer et al 1992; Zhou and Jackson, 1996; Savenkov et al, 1998). Скорее всего экспрессия 6ТБГЗ осуществляется с сгРНК белка ТБГ2 посредством сквозного рибосомального сканирования. При этом рибосома проскакивает AUG-кодон 6ТБГ2 , а следующим AUG-кодоном является 5 терминальный триплет гена белка ТБГЗ (Morozov et al, 1989; Morozov et al, 1991b; Zhou and Jackson, 1996; Verchot et al, 1998). Эти обстоятельства позволяют предположить, что уровень экспрессии белка ТБГЗ весьма низок по сравнению с уровнем экспрессии белка ТБГ2, что подтверждается работой Zhou and Jackson, 1996, в которой показано, что при синтезе 6ТБГ2 и 6ТБГЗ с общей матрицы in vitro соотношение синтезируемых 6ТБГ2 и 6ТБГЗ составляет 10:1. Крайне низкий уровень экспрессии 6ТБГЗ подтверждается также тем, единственный случай идентификации такого
