Содержание к диссертации
Введение
Многокомпонентные транспортные системы вирусов растений 6
Транспорт вирусов с тройным блоком транспортных генов 9
Особенности транспортной системы гордеи-подобных вирусов 16
Особенности транспортной системы потекс-подобных вирусов 29
Потивирусы 40
Клостеровирусы 46
Материалы и методы 50
Результаты 68
Обсуждение 103
Выводы 113
Список литературы 115
- Многокомпонентные транспортные системы вирусов растений
- Транспорт вирусов с тройным блоком транспортных генов
- Особенности транспортной системы гордеи-подобных вирусов
- Особенности транспортной системы потекс-подобных вирусов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Распространение вирусной инфекции по растению происходит при участии транспортных вирусных белков (ТБ). ТБ обеспечивают внутриклеточный транспорт вирусного генома от мест репликации к плазмодесмам клеточных стенок, межклеточный транспорт из зараженной клетки в соседние здоровые и дальний транспорт по проводящей системе растения. Транспортные системы разных групп вирусов отличаются количеством и свойствами ТБ, а также транспортной формой вируса. Геном вируса может транспортироваться в виде вириона или в виде рибонуклеопротеидного комплекса, который наряду с вирусной РНК может включать только ТБ или ТБ и белок оболочки (БО) вируса. Транспортные белки вирусов являются многофункциональными белками, взаимодействующими с одной стороны с вирусным геномом и между собой, а с другой стороны с компонентами существующих в растении путей транспорта макромолекул, необходимых для регуляции роста и развития растения. Исследование механизмов транспорта вирусов в растениях является актуальным направлением молекулярной фитовирусологаи, поскольку на достаточно простых вирусных моделях позволяет изучать функциональные и молекулярные аспекты транспорта макромолекул. В тоже время эти исследования важны для разработки эффективных способов защиты растений от вирусных инфекций.
Объектами настоящей работы являются ТБ, кодируемые первым геном тройного блока транспортных генов (ТБГ) двух типов вирусов — потекс-подобных (X-вирус картофеля, ХВК) и гордеи-подобных (полулатентный вирус мятлика, ПЛВМ), а также белок оболочки потивируса (А-вирус картофеля, АВК), важный компонент транспортной системы этой группы вирусов. ТБГ1 белки являются РНК-связывающими белками, РНК-хеликазами, относящимися к суперссмейству 1, и способны гидролизовать НТФ in vitro (Gorbalcnya and Koonin, 1993; Morozov and Solovyev, 2003). АТФазная активность потекс-подобных ТБГ1 белков необходима для межклеточного транспорта, в частности для увеличения пропускной способности плазмодесм (Morozov and Solovyev, 2003) и для супрессии поспранскрипциопного умолкания генов (Bayne et аЦ 2005). РНК-хеликазная активность ТБГ1 белков вирусов обоих типов, видимо, обеспечивает процесс транслокации вирусного генома через плазмодесми в соседние клетки (Morozov and Solovyev, 2003; Zamyatnin et al., 2005; Verchot-Lubicz, 2005). Известно также, что ТБП белок гордеи-подобных
вирусов формирует вирусный транспортный рибонуклеопротеид в отсутствии БО (Brakke et al., 1988; Donald et al., 1997) в отличие от потекс-подобных вирусов, где транспортной формой является вирион (Santa Cruz et al., 1998) или вирусо-подобные частицы, включающие БО (Lough et al., 2001, Karpova et al., 2006). Детальная локализация функциональных участков ТБГ1 белков остается не ясной, В белке оболочки потивирусов выявлены различные детерминанты, необходимые для сборки вириона, межклеточного и дальнего транспорта вируса (Dolja et al, 1994, 1995), однако изучения биохимических активностей БО до настоящего времени не проводилось.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное изучение биохимических свойств НТФазно/хеликазных доменов ТБГ1 белков двух типов вирусов с ТБГ: потексвируса ХВК и гордеивируса ПЛВМ, и локализация в их составе минимального АТФазного субдомена, а также биохимическая характеристика БО АВК. В ходе исследования решались следующие задачи: картирование района, ответственного за АТФазную активность у ТБГ1 белков потексвирусов и гордеивирусов; измерение кинетических параметров реакции гидролиза АТФ; оценка неспецифической РНК-связывающеЙ активности минимального АТФазного субдомена ТБГ1 белков с использованием различных типов нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов; выяснение функциональной роли консервативных положительно заряженных аминокислот, расположенных перед первым мотивом НТФаз/хеликаз ТБГ1 белков; изучение гомологичных белок-белковых взаимодействий ТБГ1 белков и оценка роли N-концевой части НТФазного/хеликазного домена в них; обнаружение и характеристика НТФазноЙ активности рекомбинантного белка оболочки АВК и попытка локализации АТФазного центра.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы был картирован участок НТФазно/хеликазного домена ТБГ1 белков (состоящий из консервативных мотивов 1,1а и П и небольшого участка перед ними), отвечающий за АТФазную активность. Показано, что небольшой полипептид, видимо, представляющий отдельный N-концевой субдомен, , гидролизует АТФ с эффективностью полноразмерныхх ТБГ1 белков, а также способен кооперативно связывать одиоцепочечную и двуцепочечнуго РНК. Для ТБГ1 белка ХВК и хеликазяого домена ПЛВМ показана способность образовывать димеры и олигомеры. Показано, что консервативный остаток основной аминокислоты в N-концевой части
хеликазного домена обоих типов ТБГ1 белков необходим для эффективного гидролиза АТФ только в случае полноразмерных доменов.
Впервые выявлена и охарактеризована НТФазная активность для белка оболочки А-вируса картофеля. Показано, что за НТФазную активность БО АВК отвечает его С-концевой домен.
Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. АЛ. Белозерского от 30 мая 2006 года. Результаты работы были доложены на международных конференциях: NATO Advanced Research Workshop, "Significance of virus diseases for crop biosecurity in a developing European community", Киев, Украина, 2005; ХІП International Congress of Virology "Microbes in a changing world", Сан-Франциско, США, 2005; 30th FEBS Congress and 9th ШВМВ Conference "The protein world", Будапешт, Венгрия, 2005; ЕМВО Workshop in Plant Virology "Suppression and Circumvention of Host Defense by Plant Viruses", Хельсинки, Финляндия, 2006.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура работы. Диссертация состоит из глав: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", 'Ъыводы", "Список литературы". Работа изложена нау^йраницах и содержит у ./иллюстрации.
Многокомпонентные транспортные системы вирусов растений
Вирусы проникают в клетки растения через раны, образующиеся механическим путем (таким образом перемещаются, например, представители семейства Flexiviridae и рода Hordievirus) или образованные переносчиками: насекомыми, нематодами и т.д. (например представители семейства Closteroviridae). Распространение вируса в растении происходит в две основные стадии; межклеточный (ближний транспорт), по плазмодесмам, и системный (дальний), по везукулярной системе растения.
В геноме вирусов растений закодированы специфические белки, необходимые для транспорта вирусных геномов в инфицированном растении-хозяине. Первым идентифицированным вирусным белком, который способствовал межклеточному распространению вируса между соседними клетками растения, был 30 кДа белок вируса табачной мозаики (ВТМ) (Leonard and Zaitiin, 1982; Ohno et al., 1983; Deom et al., 1987), названный транспортным белком (ТБ) (Hull, 1989; Atabekov and Taliansky, 1990). Функции, установленные или предполагаемые для подобных транспортных белков, включают в себя взаимодействие с вирусной РНК в сайте репликации вирусного генома, вывод ее таким образом из репликативпого пула, транспорт вирусной РНК к плазмодесме с участием эндомсмбранной системы и цитоскелета клетки, увеличение пропускной способности плазмодесм, транслокация вирусного генома через плазмодесмы в соседнюю клетку (Carrington et al., 1996; Lazarowitz and Beachy, 1999; Lucas, 1999; Tzfira et al, 2000; Blackman and Overall, 2001; Haywood et al, 2002; Heinlein, 2002a).
Вышеперечисленные активности реализуются при транспорте вирусного генома различными типами транспортных систем. Различные группы вирусов могут использовать от одного до нескольких ТБ, некоторые из которых имеют ферментативные активности шаперонов, АТФаз и РНК-хеликаз, кроме того, в ряде систем в транспорт вовлечены дополнительные вирусные белки, в том числе и белки оболочки вирусов. Транспортные системы различных групп вирусов также отличаются так называемой транспортной формой вирусного генома. Это может быть вирион, модифицированный вирион, вирусный рибонуклеопротеидный комплекс, сформированный одним или несколькими транспортными белками без участия или при участии белка оболочки.
В настоящее время стало очевидным, что вирусные ТБ используют и модифицируют клеточную систему активного транспорта макромолекул, необходимую для регуляции и координации роста и развития растений (Okita and Choi, 2002; Oparka and Roberts, 2001). Выявлены клеточные белки и мРІТК, которые перемещаются по растению аналогично вирусным ТБ и транспортным комплексам (Lucas, 2006). Кроме того, выявлены клеточные белки с активностью шаперонов и хеликаз, которые обеспечивают транспорт макромолекул. Таким образом, транспорт вирусов в растениях представляет собой модель или частный случай транспорта макромолекул, которые в здоровом растении регулируют рост и развитие тканей и органов.
Транспорт вирусов с тройным блоком транспортных генов
Известна группа альфа-подобных РНК вирусов с положительным геномом, в котором имеется сходный для всей группы модуль, называемый тройным блоком генов (ТБГ), состоящий из трех частично перекрывающихся открытых рамок трансляции (ОРТ) (Morozov et al., 1987; 1989; Forster et al, 1988). В состав этой группы включают представителей родов Pomovirus, Pecluvirus, Hordeivirus и Benyvirus и представителей семейства Flexiviridae (роды Potexvirus, Carlavirus, Allexivirus и Foveavirus) (Morozov and Solovyev. 1999). Расположение консервативного модуля ТБГ в геноме вирусов из разных родов по отношению к другим генам сильно отличается, однако взаимное расположение трех ОРТ друг относительно друга и характер кодируемых ими белков остается неизменным. Продукты трансляции этих трех рамок получили название ТБГ1, ТБГ2 и ТБГЗ белки. Мутационный анализ инфекционных кДНК клонов вирусных геномов четко показывает, что все три белка необходимы для успешного транспорта вируса (Petty and Jackson, 1990; Petty et al., 1990; Beck et al., 1991; Gilmer et al., 1992; Herzog et al., 1998). Таким образом, транспортная функция, осуществляемая одітим ТБ у ВТМ, распределяется между тремя белками ТБГ.
Вирусы с тройным блоком транспортных генов (ТБГ) на основании организации их геномов, свойств кодируемых белков и биологических особенностей были подразделены на два типа - потекс-подобиые и гордеи-подобные.
Особенности транспортной системы гордеи-подобных вирусов
Биохимические активности гордеи-подобных ТБГ1 белков
Биохимические активности ТБГ1 белков гордеивирусов ВШМЯ и ПЛВМ и беиивируса ВНПЖС были изучены in vitro. Эти белки проявляют РНК-связывагощую, АТФ-связывающую, АТФазную и РНК-хеликазную активности in vitro.
Аминокислотная последовательность гордеивирусных ТБГ1 белков содержит множественные участки связывания РНК (Donald et al., 1995; 1997). Возможно, именно благодаря этим свойствам, вирусам этой группы не требуется БО для межклеточного транспорта.
Для гордеи-подобных ТБГ1 белков было показано, что они обладают сильной, устойчивой к повышению ионной силы раствора, неспецифической, кооперативной РНК-связывающей активностью (Bleykasten et al., 1996; Donald et al., 1997; Cowan et al., 2002; Kalinina et al., 2001). Так, показано, что 58K белок ВШМЯ связывает двудепочечную (дц) и одноцепочечную (оц) РНК почти с одинаковой эффективностью (Donald et al., 1997). Эффективность связывания оцРНК не зависит от ее последовательности, так как 58К белок ВШМЯ одинаково эффективно взаимодействует как со смысловой, так и с антисмысловой РНК, то есть является неспецифичпым относительно последовательности. Однако эффективность связывания, возможно, зависит от конформации РНК, так как при добавлении поли(У) или дрожжевой тРНК связывания не наблюдалось. Делеционные мутации в N-коицевом домене 58К белка значительно снижали его РНК-связывающую активность (Donald et al., 1997).
С помощью мутационного анализа булло обнаружено, что в составе 63К белка ПЛВМ выявлены два домена, обладающие РНК-связывающими активностями, не зависящими от последовательности: С-концевой НТФазно/хеликазный домен и N-копцевой домен (Kalinina et al., 2001). Характерные особенности N-концевого домена: наличие богатого аргинин-лизинового аминокислотного кластера (участки А и В), возможно, участвующего в связывании нуклеиновых кислот, и консервативного участка, расположенного перед хсликазным доменом (Bleykasten et al., 1996; Solovyev et al., 1996). Мутации в одном из участков (А или В) ингибируют РНК-связывагощие свойства 63К белка ПЛВМ, в то время как мутация обоих участков полностью отменяет РНК-связывание (Kalinina et al., 2001). В условиях электрофореза в агарозпом геле N- и С-концевые домены 63К белка образуют комплексы разных типов. Этот вывод был сделан на основании изменений в элсктрофоретической подвижности РНК, связанной с белком. Комплекс, образуемый НТФазно/хеликазным доменом 63К (С63К), оставался в лунке агарозного геля. Связывание РНК происходило кооперативно. В то время как комплекс, образованный N-концевой доменом 63К (N63K) мигрировал в геле с меньшей подвижностью, чем свободная РНК. Связывание РНК в этом случае было очень сильным и носило некооперативиый характер. 63К белок формировал оба типа комплексов. При изучении этих комплексов мутантных С63К и N63K белков и 63К белка с РНК при помощи атомно силовой микроскопии было обнаружено, что они значительно отличаются друг от друга по структуре (Kalinina et al.. 2001).
42К белок ВІ-ЩЖС способен взаимодействовать с одинаковой эффективностью, как с оцРНК, так и с оцДНК и дцДНК, однако обладает несколько меньшим сродством к дцРНК. Взаимодействие с оцРНК неспецифично и не зависит от последовательности РНК, так как 42К белок взаимодействует с одинаковой эффективностью как с антисмысловой РНК ВНПЖС, так и с РНК неродственного вируса (Bleykasten et al,, 1996). С помощью мутационного анализа было обнаружено, что домен 42К белка бенивируса ВНПЖС, отвечающий за связывание нуклеиновых кислот, расположен в области между аминокислотными остатками 2-24 (Bleykasten et al.. 1996). Мутантный 42К белок, содержащий только N-концевые аминокислотные остатки 1-49 и С-концевые 342-348 (из 378 а.к в составе белка дикого типа) обладал способностью связывать РНК, то есть 75% молекулы 42К белка было несущественно для РНК-связывающей активности и она, по-видимому, не зависела от конформации белка. У бенивирусов за РНК-связывающую активность отвечает Arg/Lys-богатый участок, расположенный на расстоянии 6-18 аминокислотных остатков от N-конца ТБГ1 белка (Bleykasten et al., 1996).
Особенности транспортной системы потекс-подобных вирусов
Для следующих ТБП белков семейства Flexiviridae были определены биохимические активности in vitro: 26К белок вируса мозаики лисохвоста (ВМЛис), 25К белок Х-вируса картофеля (ХВК), 28К белок вируса мозаики бамбука (ВМБ). Для ТБП белков потекс-подобных вирусов были обнаружены АТФ-связывающая, АТФ-гидролизующая, РНК-связывающая и РНК-хеликазная активности.
ТБП белок потексвирусов обладает сильной, устойчивой к повышению ионной силы раствора, неспецифической, кооперативной РНК-связывающей активностью. 26К белок ВМЛис проявляет in vitro Mg2+-3aEHCHMyro РНК-связывающую активность (приблизительно одинаковые количества комплекса образуются при концентрациях Mg2+ от 1 до 10 мМ). Причем образующиеся комплексы достаточно устойчивы к повышению ионной силы буфера (от 0 до 200мМ NaCl). РНК-связывающая активность 26К белка ВМЛис не зависит от последовательности РНК, он эффективно связывал как геномную и антисмысловую РНК ВМЛмс, так и РНК, транскрибированную с вектора pSP64 (Rouleau ct ah, 1994).
РНК-связывающая активность 25К белка ХВК детектировалась Норт-Вестерн методом только в отсутствии Mg2+ и NaCl (Kalinina et ah, 1996). При этом в условиях анализа методом сдвига в геле 25К белок демонстрировал высокую и достаточно стабильную к повышенным концентрациям NaCl (до 400 мМ) РНК-связывающую активность. Наибольшее сродство у 25К ХВК проявляется к оцРНК, но обладает он, правда несколько меньшим, сродством и к оцДНК. Эффективность связывания не зависела от присутствия в инкубационной смеси АТФ, из чего можно сделать вывод, что РНК-связывающая активность 25К белка не зависит от его АТФазной активности (Kalinina et al., 1996). Участок, отвечающий за РНК-связывающую активность потексвирусного ТБГ1 белка (25К), расположен в N-концсвом районе белка, (Morozov et al., 1999; Wimg et al, 1999).
28K белок ВМБ обладает РНК-связывающей активностью in vitro, которая не зависит от последовательности РНК и устойчива к солям (до 200 мМ NaCI). 28К белок одинаково эффективно взаимодействовал как с различными участками геномной, так и с З -нетранслируемой областью антисмысловой РНК ВМБ (Wung et al., 1999). ТБГ1 белок ВМБК также способен некооперативно взаимодействовать с оцРНК ВМБК in vitro (Lough eta!., 1998).
НТФ-связывающая активность показана для 26К белка ВМЛис и 28К белка ВМБ. В присутствии ионов двухвалентных металлов 26К белок способен связывать АТФ и ЦТФ, но не ГТФ. Максимальное связывание наблюдалось в присутствии 5 мМ Mg2+, связывание сохранялось при замене ионов Mg2+ ионами Мп2+, но не Са2+ и Zn2 1 (Rouleau et al., 1994). Показано, что 28К белок ВМБ в присутствии 5 мМ Mg2+ способен связывать НТФ, но также способен связывать АТФ и в отсутствии Mg2 f (Liou et al., 2000). Последний факт выглядит интригующе, и объясняют его наличием у 28К ВМБ кроме консервативного остатка аргинина в положении 16 (его наличие в этом положении характерно и для других потексвирусов: ВМЛис, ХВК; ВМБК) еще двух аргининовых остатков в положении 11 и 21. Расположенные вблизи консервативного хеликазного домена I, прямо вовлеченного в связывание (3 и у фосфатов НТФ (Kadare et al., 1997), эти остатки, как предполагают, служат усилителями НТФ-связывания, играя в нем важную роль (Liou et al, 2000).
25К белок ХВК, 26К белок ВМЛис и 28К белок ВМБ обладают способностью гидролизовать АТФ (Kalinina et al., 1996; Rouleau et al., 1994; Liou et al., 2000). Оптимальные условия реакции для всех белков: 37 С, рН 7,5-8,0, 2,5-5 мМ Mg2 1" (в случае 25К ХВК Mg2+ может быть заменен хотя и с меньшей эффективностью Са2+, но не Си2+ или Zn2 1"). 26К белок ВМЛис, по-видимому, не способен гидролизовать ЦТФ, в то время как 25К белок ХВК и 28К белок ВМБ гидролизуют как АТФ, так и ГТФ, УТФ, ЦТФ. АТФазная активность 25К белок ХВК в незначительной степени (1,5-2 раза) стимулируется в присутствии различных полирибонуклеотидов: поли(А)-последовательностью длиной 60-80 нуклеотидов, РНК ХВК и РНК ВТМ (Kalinina et al., 1996). АТФазпая активность 26К белка ВМЛис не зависит от присутствия в реакционной среде поли(А), транскриптов вирусных РНК или высоко структурированных молекул РНК, таких как 9S РНК Е. coli (Rouleau et al., 1994).
Стимуляция АТФазной активности белка в присутствии оцДНК или оцРНК является характерным свойством хеликаз и часто считается косвенным Hi свидетельством наличия у белка хеликазной активности. Mg - и АТФ-зависимая РНК-хеликазная активность in vitro была показана для ТБГТ белка Х-вируса картофеля (ХВК) (Kalinina et al., 2002).
25К белок ХВК состоит, по крайней мере, из двух функциональных доменов, соответствующих двум субдоменам ДНК-хеликаз супер семейства 1. С N-концевым функциональным доменом, включающим консервативные мотивы I-IV, ассоциированы РНК-связывающая и НТФ-гидролизующая активности ТБГТ белка, а также его локалищация в специфических компартментах клетки, в то время как С-концевой домен, включающий мотивы V-V1, участвует в специфических взаимодействиях с другими вирусными (предположительно ТБГ2 белком) а, возможно, и клеточными белками (Morozov et al., 1999).
