Введение к работе
] Актуальность проблемы.
Полная идентичность двух молекул ДНК не может обеспечить одинаковую реализацию кодируемой ими генетической информации. Примером такого феномена могут служить две женские половые Х хромосомы, имеющие практически идентичную первичную последовательность ДНК, но кардинально отличающиеся с точки зрения транскрипции их генов: лишь одна из двух хромосом будет на большем своем протяжении содержать активные гены, в то время, как гены второй Х хромосомы будут молчать. В последнее время ученые получают все новые и новые доказательства того, что надгенетические (эпигенетические) механизмы контроля генетической информации играют важнейшую биологическую роль в таких процессах как развитие эмбриона, дифференцировка клеток, дозовая компенсация половых хромосом, развитие онкологических и нейродегенративных заболеваний. Сложности и относительные неудачи в клонированни позвоночных организмов связаны с удивительной стабильностью эпигенетического профиля, в первую очередь гистоновых модификаций и метилирования ДНК, в процессе перепрограммирования терминально дифференцированной клетки в плюрипотентную. Однако, несмотря на прогресс, достигнутый в понимании роли эпигенетического контроля генной экспрессии в биологических процессах, остается открытым целый ряд вопросов о механизмах реализации эпигенетической информации. В частности, метилирование ДНК является необходимой модификацией для нормального эмбрионального развития мыши. Животные с генетическим нокаутом гена, кодирующего поддерживающую метил ДНК трансферазу, погибают во время эмбриогенеза сразу после гаструляции. Однако, предполагаемые белки-интерпретаторы метилирования ДНК, а именно метил ДНК связывающие белки семейства MBD ни по отдельности, ни совокупно не являются необходимыми для нормального прохождения эмбриогенеза. Таким образом, либо метилирование ДНК напрямую может ингибировать взаимодействие транскрипционных или иных белковых факторов с их участками узнавания, или же необходимо предположить существование отличного от MBD семейства метил ДНК узнающих белков, которые могут переводить сигналы метилирования ДНК, к примеру, в подавление транскрипции метилированных генов. После полной расшифровки генома человека появилась возможность поиска новых метил ДНК связывающих белков по гомологии с MBD доменом, однако, ни один из найденных таким образом новых белков специфически не связывал метилированную ДНК. В данной работе будут описано обнаружение и характеристика функциональных свойств белков, которые объединены в одно семейство за счет способности имеющихся в их составе трех доменов «циноквые пальцы» C2H2 типа специфически связывать метилированную ДНК. Существование второго семейства метил ДНК связывающих белков существенно расширяет наши представления о механизмах интерпретации метилирования ДНК. Тот факт, что белок Каизо потенциально может быть вовлечен через белок-белковые взаимодействия в передачу сигналов от клеточной мембраны клетки в ядро, открывает новое направление в изучении эпигенетических механизмов контроля генетической информации как последствия межклеточных контактов.
Цель работы
Проверить гипотезу о существовании у позвоночных организмов метил ДНК связывающих белков, отличных от белков MBD семейства. В случае обнаружения нового семейства таких белков провести их функциональную характеристику с помощью современных методов молекулярной биологии, в частности с использованием технологии генетического нокаута.
Основные задачи исследования
Первой задачей исследования стала характеристика гена, ответственного за метил ДНК специфическое взаимодействие, которое было детектировано in vitro в экспериментах по задержке подвижности ДНК-белковых комплексов, образованных энхансерным элементом гена S100A4 и ядерными эксрактами многих клеточных линий, органов и тканей мыши и человека. После получения достаточных доказательств о том, что описанные ДНК белковые комплексы образованы с участием белка Каизо, встал целый ряд задач по опредеднию биологической роли Каизо у позвоночных:
получить и охарактеризовать мышей, у которых проведен генетический нокаут гена Каизо.
определить гены мишени, с регуляторными участками которых Каизо взаимодействует in vivo и уровень транскрипции которых чувствителен к падению Каизо.
определить морфологические и молекулярные последствия транзиентного понижения уровня Каизо в оплодотворенных ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus.laevis.
выяснить, как катенин р120 может влиять на ДНК связывающие и транскрипционные свойства Каизо при их взаимодействии.
определить функциональную значимость взаимодействия Каизо с неметилированными последовательностями CTGCNA в составе некотрых генов, вовлеченных в канонические и неканонические сигнальные пути wnt.
провести биоинформатический поиск гомологичных белков, используя в качестве референсной последовательность аминокислот трех доменов типа «цинковый палец» белка Каизо. В случае нахождения существенных гомологичных молекул провести их детальную характеристику, уделив особое внимание их способности специфически связывать метилированную ДНК.
Научная новизна работы
Свойство белков ZBTB33 (Каизо), ZBTB4 и ZBTB38 специфически связывать метилированную ДНК было открыто впервые мире в процессе получения основных результатов данной диссертационной работы. Впервые показано, что мышь с удаленным геном Каизо проявляет устойчивость к развитию рака кишечника. Также пионерскими являются все результаты, указывающие на важность Каизо в процессе эмбрионального развития шпорцевой лягушки. Проведение полногеномного картирования участков связывания Каизо было превым примером использования технологии ChIP-Seq в Российской Федерации. Помимо технической новизны следует обратить внимание на то, что данный экспреримент позволил выделить метил ДНК связывающую активность Каизо, как доминирующую in vivo, в то время как связывание неметилированных последовательностей CTGCNA было детектировано на уровне фона. Последнее обстоятельство является убедительным аргументом в споре с рядом лабораторий (Dr Juliet Daniel, Dr Pierre McCrea), которые считают что реализация основной биологической функции Каизо проистекает через связывание участков CTGCNA, а не метилированных ЦфГ динуклеотидов. Таким образом, данная работа не только открывает новое направление в изучении доменов типа «цинковые пальцы», но и позволяет более точно сфокусировать исследования в этой области на интерпретации сигналов метилирования.
Практическая ценность работы
Способность трех доменов типа «цинковый палец» белка Каизо связывать in vitro метилированную ДНК с высокой плотностью динуклеотидов ЦфГ выгодно отличает их от MBD метил ДНК связывающего домена, который способен узнавать и одиночные метилированные ЦфГ динуклеотиды. Более того, проведенные эксперименты показывают, что ДНК аффинные сорбенты, полученные с использованием «циноквых пальцев» Каизо преимущественно связывают метилированные ЦфГ островки (до 75% все связавшейся ДНК), в то время, как доля метилированных ЦфГ островков в элюированных фракциях сорбента на основе MBD домена белка MBD2 составляет не более 5%. Таким образом использование аффинных сорбентов на основе белка Каизо может существенно снизить расходы по определению профиля метилирования ЦфГ островков лини клеток, органа или ткани. Это особенно важно при характеристике новообразований. Известно, что метилирование ЦфГ островков в промоторных областях генов раковых супрессоров явлется одним из молекулярных механизмов, приводящих к трансформации клеток. Конечно же, аффинные сорбенты на основе Каизо не способны привести к определению статуса метилирования геномной ДНК с нуклеотидной точностью, однако для клинических применений это редко требуется. При использовании технологии определения первичной нуклеотидной последовательности нового поколения (Solexa, SOLiD) для анализа связанной Каизо сорбентом геномной ДНК объем такого секвенирования будет на порядок меньше, а значит и дешевле и доступнее для клинических исследователей, чем при использовании MBD сорбентов и тем более при так называемом «бисульфитном секвенировании». Другим направлением практического применения результатов работы может стать лечение онкологических заболеваний.
Мышь с удаленным геном Каизо проявляет устойчивость к развитию рака кишечника, вызванного аномальным уровнем активности сигнального пути wnt. Малые молекулы, которые бы ингибировали активности Каизо (транскрипционную или ДНК связывающую), вероятно, могут стать хорошими кандидатами для создания противоопухолевых препаратов, действие которых можно нужно будет проверять на модельных организмах, а потом и в клинических испытаниях. Причем в последнем случае вполне вероятно важным окажется генотип опухоли и наибольший эффект препаратов следует ожидать у пациентов с опухолями с активным сигнальным путем wnt.
Апробация работы
Основные результаты докладывались на конференциях Американской ассоциации по изучению рака (AACR) в 2001 и 2008 годах в США, в 2005 году на конференции по эпигенетическим механизмам пеперпрограммирования генома (Капри, Италия), а также на российских конференциях, в частности, на третьем международном съезде Биохимического общества (Санкт- Петербург 2002, на конференции, посвященной 40-летию журнала «Молекулярная биология» (Москва, 2007 год) и на седьмой международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома (Новосибирск, 2010).
Публикации
По результатам работы имеется 22 публикации в реферируемых журналах.
![Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов](/i/i/4496/149155.png "Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов Федорова Оксана Федоровна")
![Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов](/i/i/4456/315898.png "Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов Фёдорова Оксана Фёдоровна")
