Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов Федорова Оксана Федоровна

Содержание к диссертации

Введение

2.Обзор литературы 10

1. Значимость РВГЭ в инфекционной патологии детей на современном этапе 10

2. Структурная и молекулярная организация ротавириона 11

2.1. Вирион и его структурные белки 11

2.2. Неструктурные белки ротавируса 19

2.3. Геном 23

3. Разнообразие G[P] типов ротавирусов 26

3.1. G[P] типы ротавируса человека и их распределение в мире 26

3.2. Механизмы изменчивости и возникновения новых G[P] типов ротавирусов 33

3.3. Разработка ротавирусной вакцины 39

3. Материалы и методы 48

1. Исследуемые объекты 48

2. Иммуноферментный анализ 49

3. Электронная микроскопия 50

4. Электрофоретипирование РНК ротавирусов в ПААГ 50

5. Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция 52

6. G и [Р]-генотипирование ротавирусов с использованием ПЦР 53

7. Определение нуклеотидной последовательности гена энтеротоксина NSP4 56

8. Статистический анализ результатов 56

4. Результаты исследований и их обсуждение 58

1. Разработка методологии [Р]-генотипирования ротавирусов 58

1.1. Оптимизация метода ОТ-ПЦР для выявления РНК гена VP4 и оценка его эффективности 58

1.2. Оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]-генотипирования ротавирусов 67

2. Особенности циркуляции ротавирусов разных G[P] типов в Нижегородской области в 1997-2005 гг 76

2.1. Электрофоретипирование РНК ротавирусов 76

2.2. G и [Р] генотипирование природных изолятов ротавируса и анализ их распределения 78

2.3. Определение субтипа ротавирусов Р[8] генотипа 93

2.3.1. Разработка методики субтипирования аллелей гена VP4 генотипа Р[8] 93

2.3.2. Анализ смены субгенотипа в процессе многолетней циркуляции ротавирусов G1P[8] типа 97

2.3.3. Клинические проявления РВГЭ, вызванного ротавирусом типа G1 Р[8]- 2 100

3. Молекулярно - биологическая характеристика ротавирусов, выделенных от новорожденных детей 104

5. Заключение 113

6. Выводы 125

7. Список литературы 126

• Структурная и молекулярная организация ротавириона
• Механизмы изменчивости и возникновения новых G[P] типов ротавирусов
• Особенности циркуляции ротавирусов разных G[P] типов в Нижегородской области в 1997-2005 гг
• Молекулярно - биологическая характеристика ротавирусов, выделенных от новорожденных детей

Введение к работе

Ротавирусы (семейство Reoviridae, род Rotavirus) являются основным этиологическим агентом острого гастроэнтерита у детей первых лет жизни. Анализ исследований, опубликованных в период с 1986 по 2000 годы показал, что каждый год в мире регистрируется 111 млн эпизодов ротавирусного гастроэнтерита, 25 млн визитов в клинику, 2 млн госпитализаций и 352,000-592,000 (в среднем 440 тыс.) смертей среди детей в возрасте до 5 лет [144], что определяет необходимость разработки ротавирусной вакцины и совершенствования эпиднадзора за инфекцией. К настоящему времени в мире накоплена обширная информация об экстраординарном генетическом и антигенном многообразии ротавирусов. Среди ротавирусов человека группы А различают 10 G серотипов (детерминируются гликопротеином VP7), 9 «Р»-серотипов (детерминируются протеазочувствительным белком VP4) и 11 [Р]-генотипов. Гены, кодирующие VP4 и VP7, могут подвергаться независимому перераспределению, что увеличивает многообразие природных штаммов ротавируса, за счет существования различных комбинаций G и [Р] [163].

К настоящему времени показано существование географических различий в распространенности различных серотипов и генотипов ротавируса, установлен факт их временного перераспределения, зафиксировано появление большого количества нетипируемых штаммов и постоянно сообщается о находках новых, эпидемически значимых вариантов ротавируса [68]. В связи с этим для разработки универсальной вакцины и оценки эффективности уже разработанных вакцин необходимо знание антигенного (генетического) спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории, и проведение мониторинга за циркуляцией ротавирусов разных G[P] типов. Такие исследования в мире носят широкомасштабный характер [185]. Однако в России научные работы подобного плана не проводятся. Ранее в Нижегородском НИИЭМ было проведено изучение генетических и антигенных вариантов РВ, доминировавших на Европейской территории России в 1984-96 гг. Были получены новые данные об особенностях многолетней циркуляции ротавирусов основных G серотипов и прослежены последовательные сдвиги во времени от одного доминирующего варианта вируса к другому. В тоже время исследований по изучению разнообразия [Р]-генотипов ротавируса, G[P] ассоциаций, их распределению и установлению особенностей смены [Р]-генотипа РВ, не проводилось.

Цель исследования: оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]-генотипирования ротавирусов, изучение временных особенностей циркуляции ротавирусов разных G[P] типов и их молекулярно-биологическая характеристика.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для выявления гена VP4 ротавирусов группы А и дать оценку его эффективности.

2. Разработать праймеры для идентификации [Р]-генотипов и Р[8] субтипов ротавирусов.

3. Определить электрофоретипы РНК и G[P] типы ротавирусов, обнаруженных на территориях г. Нижнего Новгорода и г. Дзержинска в период 1997-05 гг., рассчитать их относительное распределение.

4. Изучить особенности смены доминирования субтипов Р[8]-1 и Р[8]-2 в процессе многолетней циркуляции ротавирусов G1P[8] типа.

5. Дать сравнительную характеристику клинических проявлений инфекции, вызванной ротавирусами генотипов G1P[8]-1 и GlP[8]-2.

6. Охарактеризовать молекулярно-биологические свойства ротавирусов, выделенных от новорожденных детей.

Научная новизна и практическая значимость работы: Оптимизирован метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ротавирусов разных электрофоретипов, эффективный в отношении штаммов, актуальных для России, что может служить основой для создания диагностической амплификационной тест-системы. Впервые рассчитано распределение G[P] типов ротавируса, идентифицированных на двух территориях Нижегородской области в 1997-05 гг. Территории городов Нижний Новгород и Дзержинск являются единственными в Российской Федерации, для которых установлен антигенный профиль природных штаммов РВ, что может быть использовано для оценки эффективности применения разработанных в мире ротавирусных вакцин.

Разработан способ субтипирования аллелей гена VP4 генотипа Р[8] с использованием ПЦР. Научная новизна подтверждена патентом (Патент № 2264469, приоритет от 24 ноября 2003 года).

Разработана новая технология G[P] генотипирования ротавирусов с использованием полимеразной цепной реакции, включающая: набор оригинальных праймеров, совместимых для мультиплексной постановки, контрольную постановку и универсальную программу амплификации. Рекомендована к утверждению расширенным заседанием Секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого совета МЗ РФ (Пр. № 168-уч. от 6 декабря 2004 года).

Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] различия в клинических проявлениях ротавирусной инфекции, свидетельствующее о существовании «респираторного» (G1P[8]-1) и «кишечного» вариантов ротавируса GlP[8]-2.

Выявлен и охарактеризован новый вариант ротавируса генотипа G9P[6]NSP4(A), вызывающий бессимптомную инфекцию у новорожденных детей.

Впервые определена первичная структура гена NSP4 трех российских изолятов ротавируса с генотипом G9P[6]NSP4(A) (DQ270101, DQ270102, DQ270103), что расширяет представления о вариабельности гена энтеротоксина NSP4 ротавируса в мире.

Внедрение результатов исследования в практику:

В процессе работы была установлена этиологическая роль РВ в возникновении 2454 эпизодов ОКИ. Результаты использованы в официальной статистике. При оперативном проведении исследований результаты использовались лечащим врачом для выбора адекватной стратегии лечения детей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированные и разработанные праймеры для обнаружения РНК ротавирусов группы A (Ro4-l, Ro4-2), для идентификации [Р]-генотипа (P[4]R, P[8]R) и субгенотипа Р[8] (R-P[8]-l, R-P[8]-2), обеспечивают генотипирование штаммов ротавируса, актуальных для территорий России.

2. Спектр G[P] типов ротавирусов циркулировавших среди детей на территории Нижегородской области в период 1997-05 гг. включает основные G1-4 серотипы и Р[4], Р[6], Р[8], Р[9] генотипы, представленные семью G[P] комбинациями, распределение которых изменяется во времени.

3. Особенностью циркуляции ротавируса G1P[8] является постоянное доминирование, поддерживаемое сменой субтипа Р[8]-генотипа, сопровождающейся изменениями в клинических проявлениях инфекции.

4. Ротавирус, обнаруженный у новорожденных детей с бессимптомной формой инфекции имеет генотип G9P[6]NSP4(A) и реорганизованный 11-й геномный сегмент.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г. Н. Новгород, 2002 г.);

• на заседании Нижегородского научного биохимического общества (г. Н. Новгород, 2004 г.);

• на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии 15 декабря 2005 г. Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 192 источника литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 9 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной в качестве фрагмента № 034/087/007-002.01 к договору с МЗ РФ № 034/087/007 «Новые технологии в профилактике, диагностике и лечении инфекционных заболеваний и их использование в эпиднадзоре».  

Структурная и молекулярная организация ротавириона

Ротавирион представляет собой сферическую, лишенную липопротеиновой оболочки, двукапсидную частицу размером около 76 нм, организованную согласно принципам икосаэдральной симметрии с триангуляционным числом (Т), равным 13. При электронной микроскопии ротавирион напоминает колесо с короткими спицами и хорошо различимым ободом, что послужило основанием для названия вируса (от лат. «rota» — колесо), которое было предложено Flewett Т. Н. в 1974 г [63].

Вирион сформирован тремя концентрическими слоями белка, которые окружают геном. При электронной микроскопии различают три типа вирусных частиц - гладкие двукапсидные (76,5 нм), шероховатые однокапсидные (70 нм) и сердцевины (50 нм), что отражает существование трех структурных элементов вириона- наружного, внутреннего капсидов и сердцевины [58, 60]. В современном представлении полные вирионы называют трехслойными частицами (TLP), частицы без наружного слоя называют двухслойными частицами (DLP) и неинфекционные частицы, у которых отсутствуют два внешних слоя, называют однослойными (SLP) [98]. Структурная организация ротавириона показана на рисунке 1. Отличительной особенностью структуры ротавириона является наличие 132-х каналов трех типов, которые пронизывают наружный и внутренний капсиды, достигая сердцевины. Каналы различаются своим положением и размером. Двенадцать каналов 1-го типа и шестьдесят каналов П-го типа имеют размер входного отверстия 40 А0 и располагаются вдоль икосаэдральных осей пятого и шестого порядка, соответственно. По краю каналов П-го типа расположены двулопастные выступы наружного капсида, которые возвышаются над поверхностью на 12 нм. Шестьдесят каналов Ш-го типа имеют глубину 140 А0 и ширину 55 А0. При входе в частицу эти каналы сужаются, а затем максимально расширяются, приближаясь к поверхности внутренней оболочки. На поверхности оболочки сердцевины имеются поры, которые соединены с каналами Ш-го типа во внутреннем капсиде вириона. Считают, что каналы вовлечены в импортирование метаболитов для транскрипции рибонуклеиновой кислоты и экспорта синтезированных РНК-транскриптов, для дальнейшего процесса вирусной репликации [60, 148]. Наружный капсид ротавириона сформирован двумя белками -гликопротеином VP7 и протеазочувствительным VP4 и представляет собой сотоподобную решетку. VP4 - белок, кодируемый четвертым геномным сегментом РНК, имеет м.м. 86,78 кДа и состоит из 776 а.о.

Сто двадцать копий этого белка в виде А - трехслойная вирусная частица: указаны белки наружного капсида (VP4 и VP7); Б - трехслойная вирусная частица в разрезе: указаны белки внутреннего капсида (VP6), оболочки сердцевины (VP2) и транскрипционные комплексы (VP1/VP3): В - схематическое изображение организации сердцевины ротавириона; Г - схематическое изображение транскрибирующейся двухслойной ротавирусной частицы димеров формируют 60 выступов наружного капсида (Рис. 1). Предсказанная вторичная структура VP4 имеет, по крайней мере, два различных домена. Аминотерминальный конец (N-конец), составляющий 60% VP4, является глобулярным доменом, богатым р-складками. Второй домен представлен длинным С-концом, богатым а-спиралями. При этом участок, состоящий из 63 а.о., имеет, как предполагается, структуру суперспирали (coiled-coil). Третичная структура VP4 стабилизирована двумя дисульфидными (-S-S-) мостиками [60, 114]. VP4 несет на себе множество функциональных участков (Рис. 2): 1) Сайт протеолитической активации. Обработка ротавириона трипсином в условиях in vitro приводит к расщеплению VP4 в позициях Arg 231, 241 и 248 на полипептиды VP8 (1-231 а.о.) и VP5 (243-776 а.о.), с последующим увеличением вирусной инфекционности. Протеолитеское расщепление VP4 позволяет увеличить инвазивную способность вируса и облегчить проникновение в клетку, способствует также правильной конформации вириона и стабилизирует комплексы выступов VP4 на de novo синтезированных вирусных частицах [45, 53, 59]. 2) Участок взаимодействия с сиаловой кислотой. Большинство ротавирусных штаммов способно к агглютинации эритроцитов, что обусловлено взаимодействием VP4 с сиаловыми кислотами (СК) на поверхности эритроцитов. Показано, что домен, отвечающий за это взаимодействие, локализован на VP8 между а.о. 93 и 208. Наиболее существенную роль в СК-связывающей активности этого белка играют аминокислотные остатки 155 и 188-190. У VP8 определена третичная структура участка (64-242 а.о.), включающего домен связывания сиаловой кислоты. Отмечено, что этот домен закрыт двумя Р-складками, подобно, как в галестинах - белках, связывающих сахара [54].

Механизмы изменчивости и возникновения новых G[P] типов ротавирусов

Для ротавирусов человека идентифицировано четыре механизма, являющихся источниками разнообразия ротавирусов: точечные мутации, реассортация генов, перестройки сегментов РНК конкатамерного типа и внутримолекулярная рекомбинация.

Точечные мутации приводят к изменению нуклеотидной последовательности и обеспечивают «дрейф» генов. Большинство мутаций носит нейтральный характер, поэтому к изменению фенотипа ведут только те мутации, которые влекут за собой изменение активных центров белковой молекулы, т.е. к изменению аминокислотной последовательности, определяющей функциональную активность белка. Сами по себе мутации, изменяющие генетические признаки лишь отдельных вирусных частиц, не могут привести к изменению наследственных свойств вирусной популяции в целом, поскольку количество возникающих мутантов значительно меньше общего числа вирусных частиц, сохраняющих исходные генетические признаки. Некоторые мутации могут сохраняться и переходить к вирусным потомкам, где накапливаются. Такие мутации могут использоваться для определения генетических линий и сублиний, идентификация которых имеет эпидемиологическое значение, например, при анализе вспышек [17, 96].

Частота возникновения мутаций в геноме ротавируса была исследована на модели РВ свиней с дуплицированным 11 сегментом, который сохранил открытую рамку считывания (ОРС). Секвенирование дуплицированного не транслируемого региона 11-го сегмента родительского вируса и очищенного потомства вируса, показало частоту мутаций 5х10"5 на нуклеотид за один репликативный цикл, что соответствует высокой частоте мутаций [159].

Реассортация представляет собой разновидность рекомбинации и проявляется перераспределением фрагментов генома у вирусов с сегментированным геномом. При этом вирусы обмениваются отдельными молекулами нуклеиновой кислоты, так что у потомства, называемого реассортантами, в геном входят молекулы, полученные от каждого из родителей [15].

Реассортация вносит большой вклад в разнообразие ротавирусов и по всей вероятности является основным механизмом их изменчивости. Реассортации возникают в условиях in vitro и in vivo при смешанной инфекции разными вариантами РВ. В дополнение к простому перераспределению сегментов генома, реассортация может изменять фенотипическое проявление генов в реассортантах, что может вносить вклад в появление новых антигенных типов вируса, обеспечивая так называемый «шифт» генов. Понятно, что любая мутация или перестройка, дающая вирусу селективное преимущество, теоретически может быстро распространяться в вирусной популяции путем реассортации [183].

Физическая демонстрация реассортации требует, чтобы сегменты генома двух родительских вирусов были различны. Наиболее часто для идентификации реассортантов и выявления происхождения сегментов генома используют методы электрофореза РНК и молекулярную гибридизацию. Одиннадцать сегментов родительского штамма ротавируса могут теоретически давать 211 различных комбинаций генома, если реассортация является случайной [159].

Отмечено, что гены VP4 и VP7 могут изменять антигенность друг друга и специфичность к рецептору, когда в реассортантном потомстве соединяются гены от разных родителей. Происходит независимая сегрегация генов (перераспределение), кодирующих эти белки. Известно, что наиболее распространенными среди ротавирусов человека являются G1-4 и Р[4] и Р[8] типы, которые формируют наиболее часто определяемые G[P] комбинации. Независимая сегрегация генов способствует формированию, других, достаточно редких комбинаций, что имеет важное эпидемиологическое значение [94].

Реассортация генов ротавирусов может происходить не только между РВ человека разных G[P] типов. Большой вклад в этот процесс вносят ротавирусы животных [79, 96, 134]. Реассортация является одним из механизмов, обеспечивающих межвидовую трансмиссию РВ. Межвидовая трансмиссия - это естественный процесс смешения популяций, приводящий к нарушению их изоляции и влекущий за собой одно или двухсторонний обмен генами. В результате этих процессов происходит увеличение запасов наследственной изменчивости популяций за счет поступления генов из генофонда другой популяции [17]. Для ротавирусов источником новых генов служат ротавирусы животных, при этом описаны случаи, когда приобретение ротавирусами животных только одного гена РВ человека приводило к его способности реплицироваться и вызывать диарею у человека. В Бельгии от шестилетнего ребенка был выделен штамм РВ - В4106 (G3P[14]). Филогенетический анализ генов VP4, VP7 и NSP4 показал, что этот штамм имеет общую эволюционную линию с ротавирусами кроликов, выделенных в разные годы в Италии и США [50].

В Индии штаммы PB-G10P[11] типа, чаще всего идентифицируемые у КРС, были ассоциированы с асимптоматической инфекцией новорожденных. В 1999-00 гг. РВ G10P[11] были выявлены у детей с острой диареей. Характеристика генов VP7, VP4, VP6 и NSP4 показала, что эти штаммы имеют высокую гомологию с соответствующими генами асимптоматического штамма новорожденных - 1321, который в свою очередь связан с РВ КРС, циркулирующими в Индии. Существенных различий в последовательностях генов у штаммов РВ, полученных от бессимптомных новорожденных и детей с симптоматикой, найдено не было [97].

Также в Индии, при вспышке гастроэнтерита среди новорожденных, изолирован штамм с необычной G9P[19] комбинацией. Анализ нуклеотидных последовательностей генов VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP2, NSP3, NSP4 и NSP5 этого штамма показал, что все гены, кроме VP7, имели гомологию с РВ свиней и при филогенетическом анализе образовывали единый кластер с РВ свиней. Только VP7 по аминокислотной последовательности имел высокое сродство с РВ человека. Кроме того, штамм имел NSP4(B) генотип и обладал SI субгруппой специфичностью, что характерно для РВ животных.

Особенности циркуляции ротавирусов разных G[P] типов в Нижегородской области в 1997-2005 гг

Методом ЭФ в ПААГ было исследовано 6545 образцов фекалий от детей в возрасте до 14 лет с диагнозом ОКИ, включающих 4950 образцов из г. Н. Новгорода и 1595 образцов из г. Дзержинска. Ротавирусы были обнаружены в 35,8±0,68% и 46,9±1,25% (р 0,001) случаев, соответственно (Табл. 5). Из представленных результатов видно, что частота обнаружения РВ у детей с гастроэнтеритом в г. Дзержинске достоверно выше, чем в г. Н. Новгороде, что может свидетельствовать о более высоком уровне заболеваемости детей РВГЭ. Среди заболевших 91% составили дети в возрасте до 3-х лет. Среднемноголетний показатель заболеваемости РВГЭ детей в данной возрастной группе составил для г. Н. Новгорода - 7 о/оо, для г. Дзержинска -15 о/оо. Это значительно выше, чем в таких развитых странах, как США (3,5 на 1 тыс. детей до 5 лет) и Швеция (3,7 на 1 тыс. детей до 4-х лет) [99, 192]. По всей вероятности высокий уровень заболеваемости РВГЭ детей г. Дзержинска связан с экологическим фактором.

При электрофоретипировании РВ, ЭФ-тип РНК был определен у 2454 изолятов РВ, идентифицировано 60 профилей миграции сегментов РНК. Выявлено 35 вариантов «длинных» Wa-подобных, 12 вариантов «коротких» DS-1-подобных и 13 вариантов «широких» Аи-1 подобных ЭФ-типов РНК. Наиболее часто встречающиеся в каждой геногруппе ЭФ-типы РНК представлены на рисунке 10. Следует отметить, что доминирующие генетические варианты ротавируса, обнаруженные у детей из городов Н. Новгород и Дзержинск, были идентичны. В таблице 6 видно, что доминирующими генетическими вариантами вируса и на той и на другой территории явились варианты с 61-м и 72-м ЭФ-типами РНК. Также часто выявлялись ротавирусы с 3-м ЭФ-типом РНК. Данный генетический вариант ротавируса выявляется на территории г. Н. Новгорода с 1984 года и в период 1984-90 гг. вызвал наибольшее число случаев РВГЭ, протекающего в тяжелой и среднетяжелой формах [12]. Идентифицировано 28 общих для двух территорий вариантов ротавируса. В тоже время в г. Н. Новгороде выявлено 26 вариантов РВ, отсутствовавших в изолятах г. Дзержинска. Среди изолятов РВ из г. Дзержинска обнаружено только 6 вариантов вируса, характерных для данной территории. Большая гетерогенность популяции РВ в г. Н. Новгороде может быть связана как с большим числом типированных штаммов РВ, так и с большей миграцией населения.

Проведено G- и [Р]-типирование природных штаммов ротавируса с доминирующими и необычными ЭФ-типами РНК, собранных в анализируемый период времени на территориях двух городов Нижегородской области - г. Нижнего Новгорода и г. Дзержинска.

Методология определения G серотипа с использованием ОТ-ПЦР детально описана в литературе, в частности в работах Gouvea V. с соавт. (1990) и Das В.К. с соавт. (1994). Предложенные этими авторами методики позволяют определять G1-G4 и G9 серотипы в мультиплексных постановках. В нашей работе определение принадлежности ротавируса к G серотипу мы проводили с использованием схемы Das В.К., включающей один общий F-праймер и несколько типовых R-праймеров. Данная схема была оптимизирована введением праймера для идентификации серотипа G3 в совместной работе с к.б.н. Епифановой Н.В. (см. раздел «Материалы и методы»). Определяли серотипы G1-G4, G9.

Определение [Р]-генотипа проводили по схеме предложенной Gentsch J.R. с соавторами (1992 г.). Для идентификации генотипов Р[4] и Р[8] использовали модифицированные нами праймеры. Определяли наиболее распространенные в мире Р[4], Р[6], Р[8] и Р[9] генотипы тех же изолятов ротавируса, что и при G типировании.

При отнесении изолята РВ к нетипируемому с использованием праймеров RGl-4,9 и RP[4], RP[6], RP[8], RP[9] ставилась контрольная реакция с использованием праймеров Ro4-l Ro4-2, подтверждающая наличие РНК ротавируса в пробе.

Определение G и [Р] типа ротавирусов, изолированных в г. Нижнем Новгороде. Проведено определение G серотипа и [Р]-генотипа 1721 природных штаммов ротавируса, выделенных от детей с гастроэнтеритом, госпитализированных в стационары города (Табл. 7). Аллель гена VP7, определяющий серотип G1, был обнаружен у 82,5±0,9 % изолятов ротавируса в ассоциации с генотипами Р[8] и Р[6]. Абсолютно-доминирующее положение на территории г. Н. Новгорода в изучаемый период времени заняли PB-G1P[8]. Их доля среди PB-G1 серотипа составила 95,5%.

Молекулярно - биологическая характеристика ротавирусов, выделенных от новорожденных детей

Ротавирусная инфекция новорожденных привлекает внимание исследователей во всем мире. Причиной этого являются особенности проявления неонатальной инфекции. Клиническая картина ротавирусной инфекции у новорожденных и грудных детей характеризуется преобладанием среднетяжелых и тяжелых форм инфекции. В тоже время, отмечено, что у новорожденных РВИ может протекать бессимптомно [89]. Iosef С. с соавторами показали, что у 10,1% детей грудного возраста РВИ протекает без диарейного синдрома. Все дети поступали в стационар по поводу острых респираторных заболеваний [91]. Показано, что часто бессимптомное течение заболевания связано с необычными штаммами ротавируса, которые могут быть причиной внутриболышчной инфекции. Известно, что ротавирус, как нозокомиальный агент, встречаются в несколько раз чаще, чем другие возбудители ОКИ [82].

При изучении клинико-эпидемиологических особенностей РВИ в стационарах для новорожденных, сотрудниками Омской государственной медицинской академии Стасенко В.Л. и Милениной В.М., совместно с сотрудниками Центра ГСЭН в Омской области, по эпидпоказаниям было проведено обследование новорожденных детей методом ИФА для обнаружения ротавирусного антигена. Были обследованы новорожденные дети, находящиеся в акушерском стационаре, и дети, госпитализированные в Городской клинический перинатальный центр (ГКПЦ) по поводу соматической патологии (церебральная ишемия, нарушение цервикального кровообращения, острый катаральный отит и др.). Ротавирусы были выявлены в 40,6+2,73% случаев.

Представляло научно-практический интерес изучить спектр G[P] типов ротавируса, обнаруженных в закрытом учреждении и молекулярно-генетические особенности ротавирусов, обнаруженных у новорожденных. Для проведения таких исследований в лабораторию поступило 82 образца фекалий детей, положительных на ротавирусный антиген, собранных в период с мая 2002 по сентябрь 2004 гг. Изоляты РВ были изучены с использованием молекулярно-генетических методов: G[P] генотипирования, ЭФ типирования РНК, секвенирования гена NSP4.

На первом этапе работы проведено электрофоретипирование РНК неонатальных изолятов РВ. Обнаружено два различных профиля миграции сегментов (Рис. 16). В 20,7 % случаев идентифицирован типичный для РВ группы А «длинный» электрофоретип РНК, который характеризовался быстро мигрирующим 4-м сегментом и соответствовал 72-му ЭФ-типу РНК нижегородских штаммов. Другие изоляты РВ (79,3%) имели необычный профиль миграции сегментов: четвертый класс генов содержал один сегмент, а второй класс - три. Изменение стандартной картины распределения сегментов РНК на классы, характерной для РВ группы А, свидетельствует о наличии геномных перестроек у данных штаммов. Находки аномальных штаммов РВ, у которых происходит перемещение генов из одного класса в другой, описаны в литературе. Показано, что пропущенные сегменты в аномальных профилях заменены дополнительными, относительно более медленно мигрирующими сегментами. Медленно мигрирующие сегменты представляют собой конкатамерные формы днРНК, содержащие последовательности, определенные для отсутствующих сегментов [65]. В нашем случае произошла конкатамеризация 11-го сегмента РНК, кодирующего NSP5. Для установления этого факта был проведен эксперимент: из геля были вырезаны участки, содержащие сегменты второго и третьего класса генов, проведено выделение РНК и амплификация с праймерами для обнаружения 11-го геномного сегмента. Использовали праймеры предложенными Gault Е. с соавторами, дающие специфический фрагмент размером 338 н.о. [65]. На рисунке 16 Б видно наличие сигнала при амплификации сегментов РНК И-го класса. Это свидетельствует о том, что реорганизованным явился 11-й сегмент РНК.

РВ с аномальным ЭФ-типом РНК были идентифицированы у детей, госпитализированных в перинатальный центр в 2002 г. (71,2% при п=35), в 2003 г. (76,2%, при п=21) и в 2004 г. (92,3%, при п=26). Обнаружение в течение длительного периода времени у госпитализированных детей необычного, генетически измененного, варианта ротавируса свидетельствует о формировании лечебном учреждении нозокомиалыюго агента.

По результатам комплексных исследований с учетом полученных нами результатов сотрудниками Омской медицинской академии и Центра ГСЭН для предупреждения заноса и распространения РВИ в стационарах и отделениях для новорожденных детей разработан комплекс профилактических рекомендаций и проведены адекватные противоэпидемические мероприятия.

Похожие диссертации на Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов

Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типовФёдорова Оксана Фёдоровна

Идентификация и характеристика нового фактора инициации митохондриальной трансляции дрожжей S.CerevisiaeКузьменко, Антон Викторович

Выделение, идентификация и характеристика изолятов вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц Батченко Галина Владимировна

Метил-ДНК связывающие белки с доменами "цинковые пальцы": молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаутаПрохорчук, Егор Борисович

Молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской ФедерацииПлотников Вадим Алексеевич

Выявление ротавирусов КРС группы А с помощью ПЦР и их характеристика на основе анализа геномаЧупин Сергей Александрович

Идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и иммуноферментный анализ специфических альфа-2 глобулинов мозгаКоротеева, Елена Анатольевна

Идентификация функциональных типов растений степей Бурятии Белоусов Иван Владимирович

Интегрированный анализ различных типов данных постгеномных исследований для идентификации ключевых путей мультигенных заболеванийИшкин, Александр Александрович

Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету типа 1, на хромосомах 6 и 10 Серегин Юрий Александрович