Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Краткая характеристика семейства Reoviridae 9
2.2. Основные свойства ротавирусов 10
2.2.1. Строение вириона 10
2.2.2. Физико-химические свойства 12
2.2.3. Структура генома 13
2.2.4. Гены и протеины 15
2.2.5. Репликация 26
2.2.6. Антигенные свойства 30
2.3. Эпизоотология ротавирусной инфекции 32
2.4. Патогенез ротавирусной инфекции телят 34
2.5. Выявление ротавирусов 34
2.6. Заключение по обзору литературы 36
3. Собственные исследования 38
3.1. Материалы и методы 38
3.1.1. Материалы 38
3.1.2. Методы 40
3.2. Результаты собственных исследований и их обсуждение 43
3.2.1. Характеристика изолятов РВ КРС на основе анализа гена VP7 44
3.2.2. Характеристика изолятов РВ КРС на основе анализа гена VP4 67
3.2.3. Комбинации G- и Р-типов российских изолятов РВ КРС 80
3.2.4. Анализ частоты реассортации геномных сегментов ротавирусов КРС в естественных условиях 81
3.2.5. Особенности структуры ротавирусной популяции 82
3.2.6. Изменение генов VP7 и VP4 изолятов РВ в процессе адаптации к культуре клеток 86
Заключение 89
Выводы 94
Практические предложения 96
Список использованной литературы 97
Приложения 120
- Строение вириона
- Эпизоотология ротавирусной инфекции
- Результаты собственных исследований и их обсуждение
- Особенности структуры ротавирусной популяции
Введение к работе
Актуальность темы. Ротавирусная инфекция крупного рогатого скота (КРС) является одной из наиболее частых причин возникновения диареи у телят. Данное заболевание зачастую приводит к падежу или вынужденному убою животных. Поражение желудочно-кишечного тракта способствует развитию вторичных инфекций. Поскольку заболевание распространено практически повсеместно, то, несмотря на относительно небольшой процент отхода животных (5-25%), оно причиняет значительный экономический ущерб животноводству.
Вызывающий данное заболевание вирус относится к роду Rotavirus семейства Reoviridae. На основании антигенных свойств белка VP6, который является основным структурным протеином вириона, ротавирусы (РВ) классифицируют на 7 групп (A-G). Крупный рогатый скот поражается ротавирусами групп А, В и С, но ущерб, причиняемый данной инфекцией, почти полностью обусловлен ротавирусами группы А.
Для предотвращения ущерба, наносимого ротавирусной инфекцией, применяют специфическую вакцинопрофилактику. Однако, как было показано различными исследователями, активная иммунизация телят не дает желаемых положительных результатов (9, 134). Поэтому для профилактики ротавирусной инфекции молодняка применяют вакцинацию стельных коров, которая приводит к увеличению количества вируснеитрализующих антител в молозиве, что обеспечивает защиту новорожденных телят (159, 211). По антигенным свойствам внешних белков VP7 и VP4 ротавирусы группы А классифицируют на G- и Р-серотипы (73). Было отмечено, что после иммунизации коров титр колостральных вируснеитрализующих антител, направленных против вирусов гомологичного серотипа, в несколько раз выше, чем титр антител против вирусов гетерологичных серотипов (37, 227). Было показано, что в первые и последующие дни после отела количество колостральных антител в молозиве стремительно уменьшается (35, 133) и вскоре становится недостаточным для пассивной защиты, особенно от ротавирусов гетерологичных серотипов (30, 226). Поэтому телята, полученные от коров, иммунизированных вакциной из одного вируса, имеют более длительную защиту от ротавирусов гомологичного серотипа. Таким образом, чем более выражено антигенное соответствие штамма, используемого для производства вакцины, и полевых изолятов, тем надежнее и продолжительнее защита при вакцинации, а значит, учитывая серотипы циркулирующих на данной территории ротавирусов, можно значительно повысить эффективность профилактики.
Определение серотипов ротавирусов с помощью серологических реакций требует наличия моноклональных антител или референтных штаммов на каждый серотип, что на практике трудновыполнимо. Кроме того, для изучения вируса в серологических реакциях необходимо сначала его выделить в культуре клеток, что для ротавирусов трудоемко и не всегда удается сделать. Вследствие этого распространение серотипов ротавирусов КРС на территории Российской Федерации остается неизученным. Поэтому разработка методов, позволяющих не только выявлять ротавирусы, но и изучать их наиболее важные с точки зрения профилактики биологические свойства, является в настоящее время актуальной задачей.
Одним из перспективных направлений, способствующих решению задачи выявления ротавируса в патологическом материале и установления его биологических характеристик, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий амплифицировать ДНК-копии (кДНК) фрагментов вирусного генома. Последующее определение нуклеотидной последовательности этих фрагментов способствует не только установлению видовой принадлежности исследованного вируса, но и при сопоставлении первичных структур аналогичных участков генома различных изолятов и штаммов с известными серотипами позволяет решать проблему определения серотипов, а также проводить штаммовую дифференциацию РВ КРС, что невозможно осуществить с помощью традиционных серологических реакций. Кроме того, определение степени сходства вновь изученного изолята со структурами исследованных ранее изолятов может помочь установлению возможного источника инфекции.
Перечисленные обстоятельства явились основанием при определении выбора темы диссертационной работы.
Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась разработка методов выявления ротавирусов КРС в образцах патологического материала и определения серотипов выявленных полевых
6 изолятов, а также изучение распространения ротавирусов КРС и их серотипов на территории Европейской части Российской Федерации с помощью разработанных методов на основе полимеразной цепной реакции и нуклеотидного секвенирования.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Разработать методы: выявления ротавирусов КРС в патологическом материале и определения его наиболее распространенных G-типов на основе ПЦР; определения G-типов РВ КРС на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования; определения наиболее распространенных Р-типов РВ КРС на основе ПЦР; определения Р-типов РВ КРС на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования.
Исследовать полевые изоляты РВ КРС на территории Европейской части Российской Федерации и изучить их генетическую вариабельность; установить, какие G- и Р-типы ротавируса циркулируют на территории Европейской части Российской Федерации; определить частоту встречаемости ротавирусов каждого типа. Научная новизна и теоретическое значение. Разработаны методы выявления ротавирусов КРС в патологическом материале с помощью ПЦР и определения G- и Р-типов РВ КРС на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования.
В результате проведенных исследований определена нуклеотидная последовательность фрагментов генов VP7 и VP4 выявленных полевых изолятов ротавирусов; 24 последовательности фрагмента гена VP7 депонированы в базе данных GenBank.
Изучена частота встречаемости ротавирусов КРС различных G- и Р-типов на территории Европейской части Российской Федерации.
Исследованы вероятные филогенетические отношения между изученными полевыми изолятами РВ КРС.
Практическая значимость. Практическая значимость проведенных исследований состоит в том, что на основании разработанных методов возможно выявление ротавирусов КРС в патологическом материале и показана возможность определения типов ротавирусов на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования.
Разработанные методы выявления ротавирусов КРС и дифференциации их G- и Р-серотипов на основе ПЦР проверены комиссионно, рассмотрены и одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИИЗЖ и используются для анализа патологического материала, поступающего на диагностическое исследование.
Проведено изучение частоты встречаемости РВ КРС каждого типа на территории Европейской части Российской Федерации.
Во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве депонирован штамм ТЕ87 ротавируса КРС.
Положения, выносимые на защиту: методы выявления и дифференциации серотипов РВ КРС на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования; определение первичной структуры фрагментов генов VP7 и VP4 полевых изолятов РВ КРС и сравнительный анализ установленных структур с аналогичными структурами других штаммов вируса; распространение G- и Р-типов ротавирусов КРС на территории Европейской части Российской Федерации на основании изучения изолятов вируса из различных регионов.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на конференциях «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» ВНИИЗЖ г. Владимир (2000 г.), «Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота» ВНИИЗЖ г. Владимир (2002 г.), «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» г. Воронеж (2002 г.), «Генодиагностика инфекционных заболеваний» г. Москва (2002 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 126 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Список литературы включает 264 источника, из них на русском языке 8. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 7 таблицами.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1999-2002 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г. Владимир).
Автор выражает искреннюю благодарность к.б.н. Г.Н. Дороненковой, вед. биол. В.А. Кудрявцеву, вед. биол. Г.С. Скитович, вед. биол. СБ. Лобачевой, вет. вр. A.M. Тиминой, лаб. И.Б. Пастуховой - за помощь в выполнении отдельных этапов работы, а так же д.б.н. Н.А. Перевозчиковой, д.в.н. В.Л. Узюмову, к.б.н. Л.Б. Прохватиловой, к.б.н. Н.Т. Джапаралиеву - за ценные замечания при обсуждении работы.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Ротавирусы считаются одной из важнейших причин неонатальной диареи целого ряда животных. Эти вирусы были открыты сравнительно недавно. В 1969 г. Mebus с соавт. (160) описали реоподобный вирус, именуемый теперь как ротавирус, который вызывал диарею у телят при экспериментальном заражении. Однако эта работа не привлекла большого внимания, пока не было обнаружено, что идентичные вирусы ассоциированы со вспышками диареи у детей. Дальнейший поиск подобных вирусов у других видов животных показал, что ротавирусная инфекция широко распространена среди всех домашних животных (78). В 1971 г. Mebus с соавт. (161) сообщили об успешном культивировании вируса NCDV ("Nebraska calf diarrhea virus"), выделенного от теленка, в первичной эмбриональной культуре клеток теленка; в 1972 г. Fernelius с соавт. (75) сообщили, что NCDV сходен с реовирусами по морфологическим признакам, но отличается от них по антигенным свойствам. В 1978 году Международным комитетом по таксономии вирусов ротавирус был выделен в самостоятельный род семейства Reoviridae (78).
Строение вириона
Интактные ротавирусные частицы имеют сферическую форму. При исследовании в электронной микроскопии они напоминают колесо с широкой ступицей, отходящими от него короткими спицами и четко очерченным гладким ободом. Название рода было предложено на основании этого сходства (от лат. rota - колесо) (77).
При исследовании препаратов ротавируса в электронной микроскопии различают 3 типа частиц. Интактные инфекционные частицы исторически называются двухоболочечными частицами, хотя новые данные по структуре вириона показывают, что они имеют 3 слоя (73). Поскольку эти частицы имеют ровную поверхность, их часто называют «гладкими» частицами. Двухслойные частицы (ранее называвшиеся однооболочечными частицами), потерявшие внешнюю оболочку (внешний капсид), также описывают как «шероховатые» частицы, поскольку по периферии видны выступающие тримерные субъединицы второго слоя (внутреннего капсида). Однослойные частицы сердцевины наблюдают менее часто; они обычно теряют геномную РНК и агрегированы (73).
Трехслойная частица имеет диаметр около 75 нм. Внешний капсидный слой состоит из тримеров гликопротеина VP7 (рис. 1), всего из 780 молекул. Из гладкой поверхности вириона выдаются 60 шипов с расширением на дистальном конце (197). Эти шипы образованы димерами гемагглютинина VP4. Шип имеет в длину около 20 нм и приблизительно на 12 нм выступает над поверхностью вириона (221, 261). Конфигурация шипа, по всей видимости, асимметрична. Вероятно, VP4 на внешней поверхности взаимодействует с двумя молекулами VP7, а внутри большой глобулярный домен VP4 взаимодействует с шестью молекулами VP6. Тесные взаимоотношения VP4-VP7 и VP4-VP6 предполагают, что VP4 может участвовать в поддержании точного геометрического взаиморасположения между внутренним и внешним капсидами.
Двухслойная частица имеет диаметр около 70,5 нм, и ее наружный слой состоит из 260 морфологических единиц или 780 молекул белка VP6, организованных в тримеры (73). Структура \/Р6-оболочки сходна с таковой \/Р7-оболочки вируса блутанга (199). Слой, образованный белком VP6, имеет толщину около 10 нм и взаимодействует с внутренним слоем, состоящим из белка VP2. Однослойные частицы имеют диаметр около 51 нм. Слой VP2 имеет толщину около 3,5 нм. Эта оболочка окружает субсердцевину с диаметром около 44 нм. В состав сердцевины входят также протеины VP1 и VP3. Существование каждой оболочки и способность VP7 и VP4 взаимодействовать непосредственно с VP6 были показаны с помощью получения вирус-подобных частиц, состоящих из комбинаций VP2, VP2/6, VP2/4/6, VP2/6/7 и VP2/4/6/7 путем экспрессии соответствующих протеинов (57, 129) или путем добавления очищенных протеинов каждого слоя к преформированным \/Р2-частицам (47, 48, 262). Эти результаты показывают, что структурным протеинам присущи свойства самосборки, и что между протеинами существуют взаимодействия с высокой аффинностью.
Отличительной чертой структуры вириона ротавируса является наличие 132 глубоких каналов, пронизывающих все три слоя и связывающих внешнюю поверхность с сердцевиной (73). В соответствии с расположением и морфологическими особенностями эти каналы классифицируют на 3 типа. Функция каналов неизвестна, но, возможно, они участвуют в импорте метаболитов, требуемых для транскрипции РНК, и экспорте транскриптов РНК для последующих процессов вирусной репликации (73).
Различные типы ротавирусных частиц обладают разными физико-химическими и биологическими свойствами. В трехслойных частицах, в отличие от двухслойных, обнаружен кальций, который, вероятно, соединен с потенциальными сайтами связывания кальция, присутствующими в протеине VP7 (19, 60, 219). Обработка хелатирующими кальций агентами (например, EDTA и EGTA) удаляет внешний капсид (31, 67). Однослойные частицы могут быть получены с помощью разрушения двухслойных частиц хаотропными агентами, такими как тиоцианат натрия или хлорид кальция, в высоких концентрациях (13, 55).
Трех-, двух- и однослойные частицы могут быть разделены центрифугированием в градиентах CsCI или сахарозы, где они обладают различной плотностью и коэффициентом седиментации. Трехслойные частицы имеют плотность 1,36 г/см3 в CsCI и седиментируют при 520-530 S в сахарозе, в то время как двухслойные частицы с плотностью 1,38 г/см3 седиментируют при 380-400 S (234). Однослойные сердцевинные частицы имеют плотность 1,44 г/см3 в CsCI и коэффициент седиментации 280 S (23). Вирионы ротавирусов не имеют липидной оболочки, и, как следствие, устойчивы к органическим жирорастворителям: фторзамещенным углеводородам, эфиру и дезоксихолату (67, 75, 234, 254). Хлороформ уменьшает инфекционность незначительно и подавляет гемагглютинирующую активность (24, 67). Инфекционность ротавирусной частицы зависит от присутствия внешнего капсидного слоя (61, 63), поэтому механизм ее подавления различными физическими и химическими факторами в основном сводится к удалению наружного капсида или отдельных его компонентов.
РВ относительно устойчивы к инактивации. Вирусные образцы от КРС и людей сохраняют инфекционность в течение нескольких месяцев при 4С или даже 20С, когда их стабилизируют 1,5 мМ СаСЬ (223). Инфекционность РВ КРС и обезьян относительно стабильна даже при 45-50С, но гемагглютинирующая активность быстро исчезает при 45С. Инфекционность и гемагглютинирующая активность исчезают при повторяющихся замораживании и оттаивании (21, 24, 67). Инфекционность РВ остается стабильной в диапазоне рН от 3 до 9 (67, 146, 179, 253, 254). Додецил сульфат натрия (0,1%) инактивирует вирус, однако неионные детергенты могут увеличивать инфекционность, вероятно, благодаря разрушению агрегатов (252). Вирусная инфекционность может быть инактивирована такими дезинфектантами, как фенол, формалин, хлор и бетапропиолактон (215, 250). Этанол, возможно, является наиболее эффективным дезинфектантом, подавляя инфекционность путем удаления внешнего капсида (21, 24, 128, 235).
Эпизоотология ротавирусной инфекции
Два факта имеют важное значение в эпизоотологии ротавирусной инфекции у телят. Во-первых, ротавирусные частицы могут присутствовать в фекалиях инфицированных телят в очень больших количествах (1010-1012 частиц на мл) (158). Во-вторых, вирус устойчив к воздействиям внешней среды. Было показано, что РВ телят могут сохраняться в течение 9 месяцев при комнатной температуре в фекальном материале и выдерживают нагревание до 60С в течение 1 часа (258). Это значит, что РВ могут обильно контаминировать окружающую среду и долго в ней сохраняться. Таким образом, сохранение РВ в окружающей среде от одного массового отела до другого может служить источником инфекции при вспышках этого заболевания.
Рассматривалась также возможность вертикальной передачи инфекции. Так, Woode с соавт. обнаружили, что 2 из 11 коров в период после отела выделяли с фекалиями РВ (258). Однако другие исследования не подтвердили этого предположения. Например, Scherrer с соавт. протестировали на ротавирус 60 коров в период после отела и получили отрицательный результат (216). Другое исследование, касающееся выяснения путей передачи инфекции, было проведено на одной ферме в Ирландии. Оно показало, что из 16 новорожденных телят 15 были инфицированы ротавирусом. После этого была проведена тщательная дезинфекция фермы, и при следующем отеле ротавирусная инфекция была обнаружена только у 2 из 7 новорожденных телят. Дезинфекция на ферме больше не проводилась, и через некоторое время очередное тестирование показало, что 9 из 10 новорожденных телят были поражены ротавирусом (158). Таким образом, более вероятной остается гипотеза о преимущественной горизонтальной передаче инфекции фекально-оральным путем, но вертикальная передача также возможна.
Телята наиболее часто инфицируются ротавирусами в первую неделю жизни. В исследовании, проведенном McNulty с соавт., было установлено, что средний возраст телят, которые начинают выделять РВ с фекалиями, - 6,1 дней (158). Аналогичное исследование в Дании показало, что в стадах, где ротавирусом было инфицировано 60% телят, они начинали выделять вирус в возрасте 7,7 дней, а в стадах, где было инфицировано 40% телят - в возрасте 10,4 дней (166). Исследования в Канаде установили, что возраст телят, начинающих выделять РВ, составляет 5 дней (9). Учитывая, что более 90% взрослых животных имеют антитела к РВ (134, 264), вызывает удивление, что так много телят, выпаиваемых молозивом, подвержены инфекции в столь короткие сроки после рождения. Вероятно, это объясняется тем, что нейтрализующие антитела присутствуют в молозиве и молоке только несколько дней после отела (226). По всей видимости, телята начинают контактировать с ротавирусом сразу же после рождения. Поэтому прекращение поступления антител с молозивом делает телят подверженными инфекции (9), поскольку инфекционный агент постоянно присутствует в окружающей среде.
Не все телята, у которых обнаруживают ротавирус, проявляют клинические признаки диареи. В исследовании, проведенном McNulty с соавт., было показано, что из 57 телят 45 (79%) были инфицированы ротавирусом. Из этих 45 телят диарея наблюдалась лишь у 11 (24%), 15 (33%) телят имели полужидкие фекалии, а у 19 телят (42%) признаков диареи не наблюдалось (158). В аналогичном исследовании, проведенном в Нидерландах, было установлено, что 24% телят, выделяющих РВ с фекалиями, не проявляют клинических признаков диареи (134).
Было показано, что тяжесть заболевания может зависеть от вирулентности штаммов, циркулирующих в данном хозяйстве (41). Было также отмечено, что высоковирулентные штаммы РВ могут вызывать заболевание у животных более старшего возраста, чем низковирулентные штаммы. Так, Bridger с соавт. (32) проводили заражение телят из различных возрастных групп тремя штаммами РВ КРС, обладающими различной степенью вирулентности. Все три штамма были способны вызывать заболевание у телят в возрасте двух дней. Однако телята в возрасте двух недель и старше (до 3 месяцев) оказались невосприимчивыми к двум штаммам РВ КРС, но заражение третьим штаммом с высокой вирулентностью приводило к появлению клинических признаков. Предположительно, причиной вариаций в степени вирулентности различных штаммов является различная скорость репликации этих штаммов в клетках кишечного эпителия животного-хозяина (32).
Экспериментальное инфицирование ротавирусом животных нескольких видов показало, что вирус преимущественно инфицирует зрелые адсорбирующие эпителиальные клетки ворсинок тонкого кишечника. Инфицированные клетки быстро разрушаются и слущиваются с кончиков ворсинок (161, 185, 186, 224). Происходит укорочение ворсинок. На кончиках ворсинок колончатый эпителий замещается на кубический (41). Утраченные клетки замещаются путем ускоренной продукции недифференцированных клеток крипт (225). Эти недифференцированные клетки имеют низкое содержание дисахаридаз и плохо транспортируют электролиты. Поэтому предполагают, что наличие таких клеток на поверхности ворсинок приводит к диарее вследствие нарушения всасывания (164).
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Ротавирусная инфекция является причиной диареи молодняка КРС, в силу чего причиняет значительный ущерб животноводству. Для своевременной и специфичной профилактики этого заболевания необходимо выявлять циркулирующие в хозяйствах ротавирусы и устанавливать их серотипы. Вследствие того, что ротавирусы отличаются большим антигенным разнообразием, серологические методы определения серотипов оказались малоэффективными. В настоящее время зарубежными исследователями разработано несколько методик по определению типов ротавирусов на основе молекулярно-биологических методов. Однако все эти методики обладают рядом недостатков или ограничений. Так, например, при использовании молекулярной гибридизации применяются зонды, изготовленные на матрице определенного гена всего лишь одного штамма для каждого серотипа (181, 204). Использование рестрикционного анализа кДНК (44) также имеет свои недостатки. Для узнавания рестриктазами сайтов рестрикции необходима определенная нуклеотидная последовательность, а ротавирусы отличаются большим генетическим разнообразием, и даже у ротавирусов одного серотипа нуклеотидные последовательности могут значительно различаться, что может повлиять на интерпретацию результатов. Праймеры для существующих методик, разработанных на основе ПЦР (93, 106, 108), рассчитаны по одному штамму для каждого серотипа, что, учитывая вышеупомянутое генетическое разнообразие, опять-таки снижает их надежность. Учитывая вышеизложенное, становится очевидным, что разработка методов выявления РВ КРС и дифференциации их G- и Р-типов является в настоящее время актуальной задачей.
Разработка метода выявления РВ КРС и дифференциации G-серотипов G6, G8 и G10 с использованием типоспецифических праймеров. Протеин, обуславливающий G-серотип ротавирусов, кодируется геном VP7. Поэтому этот ген был выбран для разработки методики определения G-типов РВ КРС.
Для разработки метода дифференциации наиболее распространенных G-серотипов ротавирусов КРС были проанализированы последовательности гена VP7 штаммов РВ КРС, данные о которых имеются в GenBank. Всего было проанализировано 7 последовательностей штаммов серотипа G6, 4 последовательности штаммов серотипа G8 и 7 последовательностей штаммов серотипа G10.
С помощью программы SQ-MAX был построен профиль вариабельности гена VP7 (рис. 7А). Как видно на рисунке, данный ген проявляет большой уровень вариабельности на всем своем протяжении. Поскольку вариабельность гена довольно высока, то любая его область является достаточно информативной для дифференциации. Поэтому основное внимание уделялось степени консервативности участков для отжига праймеров. На основании анализа последовательностей гена VP7 были определены области, консервативные для всех штаммов РВ КРС, и области, консервативные только у штаммов, принадлежащих одному из серотипов, но отличающиеся у штаммов, принадлежащих к разным серотипам.
Для проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции нами были сконструированы праимеры GC1 и GC3, гомологичные участкам, консервативным для штаммов всех трех серотипов (рис. 7Б). Для реамплификации полученного в ходе амплификации фрагмента гена VP7 были сконструированы следующие праимеры: GC2, который соответствовал участку гена VP7, консервативному у всех анализируемых ротавирусов, и парные ему праимеры G6, G8 и G10, каждый из которых соответствовал участку гена VP7, консервативному у РВ одного серотипа и значительно отличающемуся по нуклеотиднои последовательности от аналогичных участков РВ других серотипов. Серотипспецифические праимеры были рассчитаны таким образом, что каждый из них располагался на различном удалении от парного им праймера GC2. Поэтому по длине синтезируемого продукта реамплификации можно судить о том, какой из серотипспецифических праймеров принял участие в реакции, а, следовательно, определить G-серотип тестируемого РВ. Исходя из вышеизложенного, схема проведения ПЦР выглядит следующим образом. Проводят обратную транскрипцию и амплификацию с внешними праймерами GC1, GC3. Продукты амплификации анализируют в агарозном геле. Наличие в продуктах амплификации фрагмента длиной 922 п. н. свидетельствует о присутствии в патологическом материале ротавируса. Для определения его G-серотипа проводят реамплификацию с праймерами GC2, G6, G8 и G10. Продукты реамплификации анализируют в агарозном геле и по длине продукта определяют РВ какого G-типа содержится в тестируемой пробе. Кроме того, использование реамплификации повышает чувствительность реакции и позволяет выявлять РНК ротавируса, даже если результат амплификации был отрицательным.
Особенности структуры ротавирусной популяции
Природной вирусной популяцией называется вирус, циркулирующий в популяции животного-хозяина (8). Животных, выращиваемых в конкретном хозяйстве, можно считать одной популяцией, поскольку они занимают определенный ареал, содержатся в приблизительно одинаковых условиях, зачастую имеют общее происхождение, их контакты с животными из других хозяйств ограничены.
В ходе проведения работы материал на исследование из некоторых хозяйств поступал неоднократно (от двух до семи поступлений из одного хозяйства). Это позволило изучить некоторые аспекты структуры ротавирусной популяции.
На дендрограммах (рис. 22), отражающих уровень нуклеотидной гомологии, представлены изоляты из хозяйств, в патологическом материале из которых выявлено более одного изолята ротавируса. На рисунке видно, что изоляты из одного хозяйства, как правило, имеют отличия друг от друга. Наиболее наглядно это видно на примере изолятов из СПК им. Ленина, поскольку их больше всего.
Таким образом, очевидно, что популяция ротавирусов в каждом хозяйстве гетерогенна. Более подробный анализ первичной структуры данных полевых изолятов РВ КРС позволил установить, какие факторы оказывают влияние на гетерогенность ротавирусной популяции.
Во-первых, как это видно на примере изолятов, выявленных в колхозе им. Крупской Шуйского р-на Ивановской области, хозяйства ООО «Селянин» Собинского р-на Владимирской области и некоторых изолятов из хозяйства СПК им. Ленина Собинского р-на Владимирской области, эти изоляты незначительно отличаются друг от друга. Вероятно, эти изоляты происходят от общего предка, или даже друг от друга, а отличия возникли вследствие точечных мутаций в гене VP7, которые закрепились в популяции в процессе передачи вируса от одного животного к другому.
С другой стороны, на примере изолятов из СПК им. Ленина видно, что изоляты одной популяции разделяются на несколько генетических линий. Так, например, 14 изолятов, выявленных в этом хозяйстве, можно разделить на 4 группы. Отличия между этими группами настолько значительны, что изоляты из разных групп можно отнести к трем серотипам и одному подтипу. Между тем, некоторые изоляты проявляют гораздо больший уровень гомологии со штаммами, выделенными за рубежом, чем с другими членами своей популяции. Это может указывать на то, что представители данных групп происходят от разных предков и были занесены в данное хозяйство независимо друг от друга.
Кроме того, если проанализировать изоляты одновременно по двум генам, VP7 и VP4, то становится очевидным, что некоторые изоляты имеют отличие от других вследствие реассортации геномных сегментов. Так изоляты Собинка/04/02/А/32 и Собинка/04/02/А/44 отличаются друг от друга всего на 2 нуклеотида при сравнении нуклеотидной последовательности фрагментов гена VP7, но разница между ними при сравнении последовательности гена VP4 составляет более 35%. Таким образом, реассортация геномных сегментов является третьим механизмом, приводящим к тому, что ротавирусная популяция неоднородна.
Поскольку материал из одних и тех же хозяйств поступал на исследование в разное время, это позволило оценить, как изоляты РВ изменяются во времени (рис. 22). Почти во всех случаях изоляты, выявленные в разное время в одном и том же хозяйстве, отличаются друг от друга. Поэтому возникает предположение, что, изучая ротавирусную популяцию через определенные промежутки времени, можно наблюдать процесс эволюции ротавирусов в данной популяции. Однако анализ изолятов, выявленных в СПК им. Ленина, показывает, что изоляты, выявленные в разное время не представляют собой непрерывного ряда последовательных изменений, и, наряду с новыми формами, каждый год выявляются изоляты, идентичные ранее выявленным. Это можно объяснить тем, что в генах ротавирусов происходят точечные мутации. Наиболее вероятно, однако, другое объяснение. Поскольку, как было показано выше, популяция ротавирусов гетерогенна, то, возможно, что разные варианты ротавирусов существуют в хозяйстве одновременно, но выявлять каждый раз удается только один из них. Таким образом, показано, что ген VP7 может проявлять стабильность во времени. Что же касается гена VP4, то идентичные изоляты по этому гену выявлялись только в одно и то же время, а изоляты, выявленные в разное время, всегда имели отличия друг от друга. Это может говорить о том, что фиксация мутаций в гене VP4 происходит более интенсивно, чем в гене VP7.
Несмотря на то, что ротавирусная популяция является гетерогенной, разные ротавирусы, очевидно, имеют неодинаковое значение. Так, в СПК им. Ленина, доминирующими являются вирусы с комбинацией серотипов G8P5. Эти ротавирусы выявлялись на протяжении всего срока изучения данного хозяйства, а при проведении массового исследования, в ходе которого было протестировано 49 фекальных образцов, было обнаружено сразу 3 таких изолята. Ротавирусы с другими типами выявлялись лишь в единичных случаях. Возможно, что они циркулируют в хозяйстве наряду с ротавирусами типов G8P5. Но тот факт, что все они выявлялись в единичных случаях, позволяет предположить, что они время от времени заносятся в популяцию извне, но проигрывают в борьбе за существование с доминирующими «аборигенами». Например, изолят Собинка/12/01, который значительно отличается от всех других изолятов и штаммов РВ, был выявлен из материала от взрослой коровы, импортированной из Дании в 2001 году. Поскольку этот изолят представлял значительный интерес, то были предприняты попытки его выделения в культуре клеток, которые, к сожалению, не увенчались успехом. Поэтому вскоре после его выявления было проведено массовое обследование животных данного хозяйства. Но выявить этот ротавирус повторно не удалось. Возможно, он был вытеснен из популяции более сильными конкурентами.
Для того чтобы оценить, как изменяется геном ротавирусов в процессе адаптации, была изучена первичная структура фрагментов генов VP7 и VP4 двух изолятов и одного штамма РВ КРС (изолят Меленки/11/99 был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве как штамм ТЕ87), которые были адаптированы к культуре клеток в течение 9 пассажей. Изолят Юрьев/03/00 и штамм ТЕ87 были адаптированы к культуре клеток MDBK, а изолята Собинка/10/99 - в культуре клеток Mark. Работа по адаптации изолятов была проведена совместно с Г.Н. Дороненковой, Г.С. Скитович и Е.Д. Хохряковой. Анализ предсказанной аминокислотной последовательности показал, что протеин VP7 на данном участке не изменился ни у одного из изученных изолятов (несмотря на одну нуклеотидную замену у изолята Юрьев/03/00 в позиции 116). Напротив, в гене VP4 штамма ТЕ87 произошло 8 нуклеотидных замен (1,9% данного участка гена), из которых 4 приводят к замене аминокислотных остатков (2,4% предсказанной аминокислотной последовательности).
