Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1 Цель и задачи исследований 7
12.. Научная новизна работы 7
1.3.Практическая значимость 8
1.4.Личный вклад соискателя 8
1.5. Апробация результатов исследований 9
1.6. Апробация результатов исследований 9
2. Методы и исследования 11
2.1. Распространение болезни 11
2.2. Характеристика возбудителя 13
2.2.1. Организация генома Teschovirus 14
2.2.2. Полипептидный состав вириона 16
2.2.3. Антигенные свойства вируса 18
2.3. Патогенез и клинические проявления болезни 19
2.4. Профилактика и меры борьбы 20
2.5. Диагностика болезни Тешена 22
2.5.1 Серологические методы диагностики 24
2.5.2. Методы ДНК-диагностики . 26
2.6. Филогенетический анализ генома тешевирусов 31
2.7. Заключение по обзору 33
3.Собственные исследования 35
3.1. Материалы и методы 35
3.1.1. Вирусы 35
3.1.2. Ферменты 36
3.1.3. Реактивы 36
3.1.4. Культуры клеток 37
3.1.5.Питательные среды и растворы 37
3.1.6.Лабораторное оборудование 37
3 1. 1. Животные 38
3.2. Методы 38
3.2.1. Получение вируссодержащего материала 38
3.2.2. Вирусовыделение из исследуемого материала 39
3.2.3. Титрование вируса болезни Тешена 40
3.2.4. Идентификация и типизация вируса болезни Тешена в реакции нейтрализации 40
3.2.5. Очистка вируса болезни Тешена 40
3.2.6. Выделение РНК 41
3.2.7. Синтез к ДНК 42
3.2.8. Постановка ОТ-ПЦР 42
3.2.9. Анализ ПЦР продуктов 42
3.2.10. Рестрикционный анализ ПЦР продуктов 43
3.2.11. Компьютерный анализ и сравнение первичных последовательностей нуклеиновых кислот, расчет олигонуклеотидов..43
4. Результаты исследований 44
4.1. Разработка «Набора препаратов для идентификации энтеро-вирусов свиней с помощью полимеразноЙ цепной реакции» 44
4.1.1. Отработка методов выделения вирусной РНК 44
4.1.2. Подбор праймеров 46
4.1.3. Оптимизация синтеза кДНК 46
4.1.4. Оптимизация условий постановки ПЦР 47
4.1.5. Определение специфичности и чувствительности метода ПЦР..48
4.2. Изучение культуральных свойств полевых изолятов вируса болезни Тешена 51
4.2.1. Типизация изолятов ВБТ в реакции нейтрализации 59
4.3. Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней методом рестрикционного анализа 60
4.4. Разработка «Набора препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена методом полимеразноЙ цепной реакции» 62
4.4.1. Подбор праймеров 62
4.4.2. Оптимизация условий постановки ПЦР 63
4.4.3 .Определение специфичности и чувствительности метода ПЦР. „65
4.4.4. Выявление РНК вируса болезни Тешена в пробах органов 70
4.5. Дифференциация штаммов и полевых изолятов вируса болезни Тешена 72
4.5.1.Дифференциация вируса болезни Тешена методом типоспецифической ПЦР 72
4.5.2. Дифференциация штаммов и полевых изолятов вируса БТ методом рестрикционного анализа ПЦР продуктов 79
5. Обсуждение результатов исследований 83
6.Выводы 90
7 .Практические предложения 92
5. Список использованной литературы 93
8. Приложения 107
- Апробация результатов исследований
- Патогенез и клинические проявления болезни
- Идентификация и типизация вируса болезни Тешена в реакции нейтрализации
- Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней методом рестрикционного анализа
Введение к работе
Болезнь Тешена (энтеровирусный энцефаломиелит свиней) -инфекционная болезнь, поражающая поросят и приносящая значительный ущерб свиноводству. Впервые она была описана в 1929 году в Чехословакии. В бывшем СССР заболевание было диагностировано в 1972 году в Закарпатской области Украины. Эпизоотическая обстановка в России по болезни Тешена осложнилась в середине 90-х годов и, несмотря на значительные усилия, предпринимаемые ветеринарной службой России, заболевание было зарегистрировано в Брянской, Смоленской, Орловской, Воронежской и Тульской областях, а также в Белоруссии, Украине и Молдавии [9].
Возбудитель данной болезни относится к роду Teschovirus, семейства Picornoviridae [123]
Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена тесным антигенным родством вируса болезни Тешена с энтеровирусами свиней и сходными клиническими признаками болезни, вызываемыми этими возбудителями, что затрудняет проведение диагностических исследований [76].
В частности, энцефаломиелиты у свиней, кроме вируса болезни Тешена, вызывают и энтеровирусы свиней, что создает дополнительные сложности при разработке мер борьбы с этой болезнью. Репродуктивные расстройства, также характерные для болезни Тешена, вызывают представители энтеровирусов 8 серотипа. В то же время ряд штаммов вируса болезни Тешена не вызывает характерных для данной болезни признаков, являясь слабовирулентными [82].
Используемые в настоящее время методы лабораторной диагностики болезни Тешена: выделение вируса в культуре клеток, реакция нейтрализации со специфическими сыворотками, а иммунофлюоресцентный анализ являются не всегда позволяет дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов.
Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции и их рестрикционный анализ, дополняя серологические методы, открывает новые возможности для совершенствования дифференциации вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней. Одним из перспективных направлений является разработка тест-системы, основанной на использовании ПЦР, с последующим рестрикционным анализом и секвенированием ампликонов участков РНК ВБТ и энтеровирусов свиней.
В связи с вышеизложенным, разработка методов дифференциации вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней имеет важное эпизоотологическое и диагностическое значение и является актуальной.
Апробация результатов исследований
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2002-2005 гг. во ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями НИР Россельхозакадемии (темы; 01.01.02., 01.01.03., 01.02.03.). Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ, Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» ВНИИВВиМ (г. Покров 2003 г.), Международной научно-практической конференции «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» ВНИИЗЖ (г. Юрьевец 2004 г.). - результаты испытания наборов препаратов на основе полимеразной цепной реакции для выявления РНК энтеровирусов и вируса болезни Тешена с использованием праймеров, комплементарных различным областям их геномов; - специфичность ПНР при идентификации различных штаммов энтеровирусов свиней и болезни Тешена, выделенных из патологических материалов; - использование ПЦР для дифференциации производственных и музейных штаммов вируса болезни Тешена, выделенных в культуральных и патологических материалах; - дифференциация различных штаммов и изолятов вируса болезни Тешена методами ПЦР и рестрикционного анализа.
Болезнь Тешена — инфекционное вирусное заболевание свиней, протекающее в форме энзоотии, характеризующееся негнойным энцефалитом и развитием параличей. К заболеванию наиболее восприимчивы поросята-отъемыши и молодые подсвинки [5, 25]. Болезнь Тешена впервые была диагностирована в Чехословакии, в округе Тешен и описана Trefny в 1930 году [135,79]. Летальность, вызываемая этой инфекцией, достигала 80-100%, в связи с чем болезнь получила свое второе название - «Богемская чума». В зависимости от формы течения заболевания и клинических признаков, болезнь Тешена называют энзоотическим энцефаломиелитом, полиомиелитом свиней, менингоэнцефалитом свиней и др. [80, 83, 86]. В научной литературе при описании данного заболевания наиболее часто употребляется ее синоним - энтеровирусный энцефаломиелит свиней [9, 56]. Изучение вспышек заболевания по характеру их развития и уровню смертности среди заболевших животных в Чехословакии и на Мадагаскаре, с одной стороны, и в Дании и Англии, с другой, показало существенные различия в характере течения и клинических проявлениях болезни [121]. При изучении возбудителя в ходе эпизоотии в Дании и Англии были получены новые данные об эпизоотической картине и патогенезе болезни и предложено два новых ее названия (два очага - два названия) полиомиелит свиней и болезнь Тальфана [75,76,92,136]. В то же время, сравнение гистоморфологических изменений, которое было проведено несколько позднее, показало, что они, во всех случаях, были практически идентичны. Это послужило основой для осуществления сравнительного анализа выделенных вирусов [81, 87,91,109].
С использованием реакции перекрестной нейтрализации в культуре клеток, было четко установлено, что возбудители болезни Тешена и болезни Тальфана - являются в антигенном отношении близкородственными вирусами. В результате этого родства данную болезнь начали называть болезнью Тешена-Тальфана [85, 89], К 1964 году болезнь регистрировали почти во всех странах Западной и Восточной Европы. Болезнь Тешена была диагностирована также в США, Бразилии и Корее. В 1972 г. болезнь Тешена впервые была диагностирована в СССР, в Закарпатской области Украины [56]. Вторая волна распространения этой болезни, начавшаяся в 1973 г., продолжалась до 1995 г. В этот период болезнь была установлена впервые в пяти странах Восточной Европы, в двух государствах Азии, вновь в Америке и Африке. В 1973 г. болезнь Тешена появилась в Львовской, Житомирской, в 1974 - в Винницкой и Киевской областях Украины [43, 57]. В 1980г. очаги болезни установлены в Ровенской и Волынской областях. В декабре 1979 г. - январе 1980 г. болезнь была зарегистрирована в Латвии в 4-х неблагополучных пунктах в Краславском районе. В 1981 г. ее появление установили в соседней с Латвией Псковской области, ставшей неблагополучной по болезни Тешена на многие годы [27,9]. В 1982 году вспышки болезни Тешена были зарегистрированы в Брянской области, граничащей с Украиной, а затем, несмотря на проведение противоэпизоотических мероприятий ветеринарной службой России, в Смоленской, Орловской и Тульской областях [13, 31, 39,40].
Успех ликвидации болезни в Европе и Америке был достигнут за счет введения жесткой системы мер борьбы с инфекцией. Ликвидацию болезни проводили путем тотального убоя всего поголовья свиней в очагах возникновения и кольцевой вакцинации свиней в угрожаемой зоне. Благодаря принятым мерам в 1964 г. болезнь Тешена была ликвидирована в Германии и Венгрии, в 1974 г. - Польше и Чехословакии, в 1984 г. -Австрии [112].
Патогенез и клинические проявления болезни
При естественном заражении свиней алиментарным и аэрозольно-капельным путем, вирус проникает в организм через ротовую и носовую полости. В большинстве случаев первичными очагами размножения вируса являются лимфоидная ткань носоглотки и эпителий стенок кишечника. Инкубационный период составляет, в среднем, около 14 дней [73, 10]. Болезнь характеризуется преимущественным поражением центральной нервной системы. У некоторых свиней отмечается рвота, афония, повышение температуры тела до 41 С [9]. Заболевание продолжается от 4 до 10 дней и как правило заканчивается гибелью животного. В завершении клинической стадии развиваются прогрессирующие параличи, которые распространяются по телу животного от тазовых конечностей к голове, оно практически не реагирует на внешние раздражители. Паралич терморегуляторного центра приводит к гипотермии. Животное гибнет от асфиксии из - за паралича мышц, участвующих в процессе дыхания [15]. Заражение свиней возбудителем болезни Тешена от переносчиков разных биологических видов вызывает различные формы проявления болезни [83]. Острое течение болезни у свиней наблюдается при заражении их вирусом, прошедшим пассаж на собаках или морских свинках. Заболевание в подострой форме, но также с проявлением клинических признаков болезни, вызывает вирус болезни Тешена, прошедший пассаж на крысах.
Заражение вирусным материалом, однократно пассированным на кроликах, вызывает у свиней латентную инфекцию, характеризующуюся длительным выделением возбудителя в окружающую среду с фекалиями без проявления клинических признаков болезни и образованием вируснейтрализующих антител (В НА) в сыворотки крови [3, 15]. Передача вируса посредством насекомых не установлена [112, 73]. Специфических изменений у свиней, связанных с кишечной инфекцией энтеровирусами и вирусом болезни Тешена, отмечено не было [75]. В настоящее время недостаточно изучена роль энтеровирусов свиней и вируса болезни Тешена как кишечных патогенов. Часто удавалось изолировать энтеровирусы из фекалий поросят с диареей. Удалось экспериментально воспроизвести умеренную диарею на серонегативных СПФ-поросятах при заражении энтеровирусами свиней и вирусом болезни Тешена [94, 113, 129]. В то же время отмечалось выделение энтеровирусов и слабовирулентных штаммов вируса болезни Тешена от клинически здоровых животных, не имевших в анамнезе кишечной патологии. Обычно энтеровирусы свиней и вирус болезни Тешена репродуцируются в тканях кишечного и респираторного эпителия. Круг естественных хозяев вируса ограничен свиньями.
По данным Бузуна А.И. (2001 г.) и Андреевой О.Н. (2003 г.) в результате моделирования эпизоотического процесса при болезни Тешена установлено, что грызуны и плотоядные являются одним из необходимых звеньев в эпизоотической цепи и обусловливают формирование и поддержание природных очагов болезни [11,12,30,37,4,28]. Меры борьбы с болезнью Тешена, как и при большинстве вирусных инфекций, основываются, прежде всего, на предупреждении заноса в благополучные хозяйства возбудителя инфекции [19,14]. Искоренение энтеровирусной инфекции и болезни Тешена путем замены поголовья на SPF- животных предпринимались, но положительного результата на сколько-нибудь длительный период не давали. Это обусловлено тем, что энтеровирусы, а иногда и слабовирулентные варианты вируса болезни Тешена, удавалось выделить от свиней коммерческих СПФ- стад. С другой стороны, отмечали случаи заноса вируса болезни Тешена в СПФ-стада даже при строгой изоляции [25]. Ликвидация болезни Тешена может быть достигнута путем поголовного убоя свиней в очаге инфекции и вакцинацией в угрожаемой зоне [24]. Эффективным для ограничения распространения этой болезни оказалось запрещение импорта свиней и продукции свиноводства из районов, неблагополучных по болезни Тешена. В 1976 году во ВНИИВВиМ Сергеевым В.А., Жестеревым В.И. и соавт. была разработана и испытана на свиньях в лабораторных условиях инактивированная гидроокись алюминиевая, сапониновая вакцина, приготовленная из вируса, выращенного в первичной культуре клеток почки свиньи. В ноябре 1977 г. она была применена с положительным результатом в неблагополучных хозяйствах Винницкой области [27]. В 1978г. этими авторами была разработана более эффективная вакцина против БТ, технология изготовления которой включала перевиваемых культур клеток и маслянного адьюванта. Вакцина вводилась свиньям однократно в дозе 2 см3 [41,42]. Применение отечественных вакцин способствовало улучшению эпизоотической ситуации по БТ на Украине [108]. В результате в Закарпатской области произошло резкое снижение числа неблагополучных пунктов: с 47 в 1977г. до 2 в 1980г., а число заболевших свиней уменьшилось с 1086 до 53 животных в год. С профилактической целью в этот период вакцинация свиней была увеличена с 56 тыс. (1977 г.) до 218 тыс. животных (1980 г.). В течение 1-3 месяцев с помощью масляной эмульгированной вакцины удалось стабилизировать ситуацию и обеспечить дальнейшее благополучие по данной болезни также в Латвии [27].
Идентификация и типизация вируса болезни Тешена в реакции нейтрализации
Идентификацию изолятов ВБТ проводили с использованием диагностического «Набора препаратов...» для идентификации ВБТ реакцией нейтрализации. Типизацию изолятов ВБТ проводили в РН с сыворотками, полученными на штаммы «Закарпатский» и «Навля-96». При постановке реакции использовали постоянную дозу вируса (1000 ТЦД даем ._) и двукратно возрастающие разведения сывороток. К каждому разведению сывороток объемом 0,5 см добавляли такое же количество вируса. Инкубировали при 37 С в течении 60 минут, затем этим материалом заражали по 4 пробирки с культурой клеток в объеме 0,2 см . Инкубировали 60 минут и добавляли в них до 1,0 см3 поддерживающую среду. Материал инкубировали до наступления ЦПД в контролях вируса.
Для очистки вируса БТ использовали вируссодержащий материал, полученный в культурах клеток ПТП и ПСГК-60 с активностью не ниже 7,0 1ёТЦД50/СМ3. Исходную вируссодержащую суспензию после замораживания при минус 70С и оттаивания разделяли низкоскоростным центрифугированием при 2500 об/мин в течение 20 мин на клеточный детрит и надосадочную культуральную жидкость.
После осветления вирусной суспензии от клеточного детрита, вирус из надосадка осаждали сульфатом аммония (40 % насыщение) и выдерживали 20 часов при 4 С. После чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 40 минут. Затем концентрат вируса ресуспендировали в ОД М ТЕ буфере рН 7,5 и использовали для выделения РНК. Вторым методом подготовки проб для выделения РНК вируса болезни Тешена являлось замораживание зараженной культуры клеток при 30%-м ЦПД с добавлением буфера, содержащего 4 М гуанидинтиоционат. Выделение РНК энтеровирусов проводили с помощью гуанидин-тиоционатного метода, фенольно-детергентного метода и с использованием тризола («TRIzol Reagents», Gibco BRL).
Для фенольно-хлороформной экстракции была использована методика, разработанная Bemhard Hirt (1967) в нашей модификации. Освобождение РНК от белков осуществляли денатурирующим раствором, содержащим 0,1 % додицилсульфат натрия (SDS), в течение 5 мин при комнатной температуре, затем добавляли кислый фенол (рН 4,5) и хлороформ в смесь в соотношении 1:1 по объему.
Из мозговой суспензии экстракцию РНК проводили с помощью буфера, содержащего 4 М ГТЦ, по методу, разработанному Chromczynski et.all. Для этого 50-100 мг суспензии лизировали в 1 см3 буфера в течение 5 мин, затем добавляли смесь фенол — хлороформа в соотношении 1:1, перемешивали и полученную смесь центрифугировали 15 мин при 10000 g. Отбирали водную фазу и РНК осаждали добавлением 0,6 объема изопропанола. Осадок промывали 75% этанолом и центрифугировали при 10 000 g в течение 5 мин при 4 С. Осадок РНК высушивали в течение 15 мин при комнатной температуре и ресуспендировали в бидистиллированной воде.
Выделенные образцы вирусной нуклеиновой кислоты переосаждали 96% этанолом при минус 20С. Перед постановкой синтеза образцы РНК осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течении 20 мин, высушивали и ресуспендировали в 50 мкл бидистиллированной воды. Синтез кДНК проводили с использованием наборов «Universal RiboClone» cDNA Synthesis System» фирмы Promega, а также наборов фирмы «Fermentas» и «СибЭнзим», согласно рекомендациям производителя. В качестве затравок использовали олигонуклеотиды длиной 19-30 оснований, комплементарные последовательностям генов вирусов БТ и энтеровирусов свиней. Раствор кДНК (5 мкл) амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20 рМ каждого праймера, 2,5 мМ смеси dNTP, 10х buf(10 mM Трис НС1 рН 8.3, 50 mM КС1,2,0 mM MgCl2, 2 ед. Taq-полимеразы.
Затем в пробирки наслаивали 25 мкл легкого минерального масла и помещали в термоцикл ер. Амплификацию в термоцикл ере проводили по следующим программам -первый цикл: денатурация 95 С - 40 сек, отжиг 50 - 55 С -30 сек, элонгация 72 С- 30 сек. Всего 40 циклов. Аликвоты ПЦР-продуктов от 5 до 10 мкл разрезали соответствующими ферментами рестрикции и разделяли в 1,5 — 2,0% агарозном и полиакриламидном гелях. Учет результатов проводили по размеру ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле. На основании размеров и расстояний пробегов маркерных ДНК (рестрицированные Hindll ДНК фага лямбда) вычисляли размеры исследуемых фрагментов ДНК [24]. Полученные результаты документировали на фотопленке ("Микрат"-300) с помощью фотоаппарата типа "Зенит". Фотографирование гелей проводили с оранжевым светофильтром.
Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней методом рестрикционного анализа
Целью данного этапа работы явилась дифференциация ВБТ от энтеровирусов свиней посредством проведения рестрикционного анализа ПЦР продуктов (праймеры dl0+dl2, размер 375 п.о.), комплементарных гену РНК - полимеразы. Для эксперимента были взяты культуральные материалы: вирус. БТ-шт. «Навля-96», шт. «Закарпатский», шт. «Konratice», шт. «Talfan», полевые изоляты вируса БТ-«Смоленский», «Тульский», «Орловский», «Молдавский» и энтеровирусы свиней- шт. «А-1» (10-й сероип), шт. «V-13» (9-й серотип), а также органные материалы инфицированных подсвинков. Отбор ферментов рестрикции проводили на основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей гена РНК- полимеразы вируса БТ, выполненного при помощи пакета программ DNASIS. Было использовано несколько эндонуклеаз, имеющих сайты рестрикции в этом гене: Drall, Dral, EcoRV, EcoRII, Aval, Mspl, Seal, BamHI, Hindlll, Sail, PstI. В результате проведенной работы нами была отобрана только одна рестриктаза, пригодная для дифференциации ВБТ от энтеровирусов свиней. Данные этих опытов приведены в табл.10. При расщеплении ПЦР продуктов размером 375 п.о, эндонуклеазои PstI было обнаружено, что гены вируса БТ и энтеровирусов свиней разрезались на два фрагмента размерами 75, 300 п.о. и 175, 200 п.о. соответственно Таким образом, при расщеплении ПЦР продуктов размером 375 п.о., эндонуклеазои PstI, комплементарных гену РНК-полимеразы, полученных на матрице РНК вирусов из культуральных и органных материалов можно дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов свиней. В связи с тем, что вирус болезни Тешена имеет близкое антигенное родство с энтеровирусами свиней и может вызывать сходные клинические симптомы заболеваний у животных, нами была поставлена задача разработать «Набор препаратов для выявления РНК болезни Тешена методом полимеразной цепной реакции».
Выделение вирусной РНК проводили с использованием буфера, содержащего ГТЦ (см. пункт 4.1Л.). На основании анализа нуклеотидных последовательностей различных участков генома семейства Picomaviridae в качестве мишени был выбран ген структурного белка VP1, который отвечает за синтез вируснейтрализующих антител и содержит как вариабельные, так и консервативные участки. Были подобраны две пары праймеров (наружные- Е49+Е52 и внутренние- Е50+Е51), фланкирующие ПЦР продукты размерами 560 и 260 п.о. соответственно, комплементарные нуклеотидным последовательностям гена VPI штамма «Konratice» (табл.11.). Наружные праймеры были использованы как для синтеза кДНК, так и для постановки ПЦР. Для выделения РНК были взяты те же вируссодержащие материалы, что и при работе по идентификации энтеровирусов свиней. Но в дополнение к ним были задействованы полевые изоляты, изучение которых представлены в главах 4.2, 4.3. - «Тульский», «Смоленский», Орловский» и «Молдавский». В качестве отрицательного контроля использовали 9-й (шт. V-13») и 10-й (шт. «А-1») серотипы энтеровирусов свиней. Выделение суммарной РНК вируса болезни Тешена проводили методами фенольно-хлороформной экстракции и при помощи лизирующего буфера, содержащего ГГЦ. Как и в случае с энтеровирусами при проведении электрофоретического анализа в агарозном геле наиболее четкие полосы полноразмерных фрагментов РНК вируса БТ были получены при использовании ГТЦ. Оптимальными условиями синтеза кДНК, так же как и в случае с энтеровирусами, оказалось сочетание температурной денатурации кДНК при использовании предварительного отжига праймеров при 80 С с обратной транскриптазой мышиного лейковируса (M-MLV). Поэтому в дальнейших опытах при подготовке проб для ПЦР использовали только эту методику. В результате проведенных исследований установлено, что оптимальная концентрация ионов магния в реакционной среде составила 2,5 тМ, значение рН буферного раствора 8,5, а температура отжига обоих праймеров, специфичных для вируса болезни Тешена, составила 50С. При подборе оптимальной температуры отжига праймеров для выявления РНК вируса вируса болезни Тешена были проведены исследования при следующих температурах: 45 С, 50 С. Результаты выявления различных штаммов вируса болезни Тешена методом полимеразной цепной реакции при различных температурах отжига праймеров представлены в табл. 12.
