Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 8
2.1. Коронавирусная диарея новорожденных телят 8
2.1.1. Эпизоотология 8
2.1.2. Клинические признаки 9
2.1.3. Патогенез и патологоанатомические изменения 10
2.1.4. Диагностика 11
2.1.5. Специфическая профилактика 12
2.2. Коронавирусная инфекция дыхательных путей 13
2.3. "Зимняя дизентерия" 14
2.4. Характеристика семейства Coronaviridae 15
2.5. Структура вириона и физико-химические свойства коронавируса крупного рогатого скота 17
2.6. Геном коронавируса крупного рогатого скота 19
2.7. Основные структурные белки коронавируса крупного рогатого скота 20
2.7.1. Нуклеокапсидный протеин 20
2.7.2. Интегральный мембранный протеин 20
2.7.3. Спайковый гликопротеин 21
2.7.4. Гемагтлютинин-эстеразный гликопротеин 22
2.8. Репликация коронавируса крупного рогатого скота 23
3. Собственные исследования 30
3.1. Материалы 30
3.1.1 Штаммы вируса 30
3.1.2. Оборудование 30
3.1.3. Растворы и реактивы 31
3.2. Методы 32
3.2.1. Выделение суммарной РНК 32
3.2.2. Реакция обратной транскрипции 33
3.2.3. Амплификация кДНК 33
3.2.4. Вариант ПЦР "continuous" 34
3.2.5. Очистка продуктов ПЦР 35
3.2.6. Реакция секвенирования 35
3.2.7. Компьютерный анализ данных 36
4. Результаты и обсуждение собственных исследований 36
4.1. Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования фрагмента НЕ гена 36
4.1.1. Исследование профиля вариабельности НЕ гена 36
4.1.2. Выбор первичной структуры праймеров 40
4.1.3. Оптимизация условий постановки ПЦР и секвенирования 44
4 1 .4, Апробация метода и анализ полученных данных 46
4.2. Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области S гена 58
4.2.1. Исследование профиля вариабельности S гена 58
4.2.2. Выбор праймеров, условий постановки ПЦР и секвенирования 61
4.2.3. Апробация методам анализ полученных данных 62
Выводы 86
- Коронавирусная инфекция дыхательных путей
- Гемагтлютинин-эстеразный гликопротеин
- Методы
- Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области S гена
Введение к работе
Актуальность темы. Инфекционные болезни желудочно-кишечного тракта молодняка КРС представляют собой одну из важнейших проблем современного животноводства. Многочисленными исследованиями было установлено, что одним из основных факторов в этиологии диареи телят является коронавирус КРС (KB КРС), который относят к роду Coronavirus семейства Coronaviridae. Вирус поражает преимущественно органы пищеварительного тракта животных, вызывая острые энтериты, однако он также может являться причиной воспаления верхних дыхательных путей и пневмонии. Заболевание наносит серьезный ущерб сельскому хозяйству во всем мире ввиду высокой контагиозности, высокого процента гибели и выбраковки телят (до 40-50% и более) и продолжительного, до нескольких месяцев, снижения молочной продуктивности у коров. Наиболее широко и остро болезнь протекает в стойловый период, особенно при массовых отелах.
KB КРС способен персистировать в стадах на протяжении нескольких лет без видимых клинических проявлений, периодически вызывая вспышки заболевания. В период бессимптомного персистирования вируса для его выявления требуются высокочувствительные методы. Низкая устойчивость вирионов к внешним воздействиям также осложняет выявление патогена, поэтому традиционные методы выявления KB КРС (электронная микроскопия, иммунофлуоресцентный анализ, реакция гемагглютинации) не всегда способны установить присутствие вируса. Кроме того, проведение тестов, основанных на гемагглютинации. затруднено тем. что образцы фекалий, используемые для диагностики этого заболевания, содержат неспецифические гемагглютинирующие агенты. Выявление в сыворотке крови животных вирусспеиифических антител не всегда позволяет судить о наличии возбудителя, т.к. у телят их присутствие может быть обусловлено колостральным иммунитетом, а у взрослых животных вакцинацией или заболеванием, прошедшим в более раннем возрасте.
Применение методов молекулярной биологии, таких как ПНР и секвенирование открывает широкие возможности для выявления и изучения инфекционных агентов. От традиционных методов диагностики ПЦР отличает высокая аналитическая чувствительность и специфичность, что позволяют установить присутствие вируса в исследуемой пробе даже по фрагменту генома. Секвенирование амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и
последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вируса. Поскольку проводимые ранее диагностические исследования показали широкое распространение KB КРС на территории РФ, разработка методики выявления и штаммовой дифференциации вируса на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования с последующим анализом амплифицированных нуклеотидных последовательностей генома изолятов, выявленных на территории Российской Федерации, которая прежде не изучалась, имеет как научное, так и практическое значение.
Цель и задачи исследований. Основной целью данных исследований являлась разработка методов выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС, а также анализ первичной структуры изолятов, выявленных на территории РФ и штаммов, изученных ранее.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- разработать методы выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС
из различных биоматериалов на основе ПЦР и секвенирования вариабельных областей генома;
на примере референтных штаммов коронавируса КРС определить оптимальные условия проведения ПЦР и секвенирования;
изучить возможность применения разработанных методов для выявления коронавируса КРС в патматерналах от телят и взрослых животных;
установить первичную структуру амплифицированных. фрагментов генома
штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС, создать банк данных нуклеотидных последовательностей;
- провести сравнительный анализ первичной структуры штаммов и полевых
изолятов коронавируса КРС.
Научная новизна исследований. Впервые разработаны методы выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов генома вариабельных областей гемагтлютинин-эстеразного (НЕ) и спайкового (S) генов. Определены оптимальные условия проведения ПЦР и секвенирования. Показана возможность применения разработанных методов для выявления коронавируса КРС в образцах патматер нала от телят и взрослых животных.
Впервые определена первичная структура вариабельных фрагментов НЕ и S генов изолятов коронавируса КРС, выявленных на территории РФ. Проведен
сравнительный анализ первичной структуры исследованьж фрагментов генома штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС. Нуклеотидные последовательности вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена тринадцати выявленных изолятов депонированы в GenBank (AY184411-AY184423).
Практическая значимость исследований. Разработаны, одобрены ученым
советом и утверждены директором института: в 1999г. - "Методика вьшвления и
штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР
и секвенирования фрагмента НЕ гена" и в 2003г- "Методика вьшвления и штаммовой
дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и
секвенирования вариабельной области S гена". Установлена первичная структура
вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена 3 штаммов коронавируса
крупного рогатого скота из коллекции музея ВНИИЗЖ и 17 полевых изолятов.
выявленных на территории РФ. Определена первичная структура вариабельной
области спайкового гена 2 штаммов коронавируса крупного рогатого скота из
коллекции музея ВНИИЗЖ и 8 полевьж изолятов, выявленных на территории РФ.
Данные методы применяются для вьшвления и штаммовой дифференциации KB КРС
в образцах различных биоматериалов как от живых, так и от павших животных.
Результаты исследований учитываются при постановке диагноза.
Основные положения выносимые на защиту:
метод вьшвления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого
скота, основанный на амплификации вариабельной области гематглютинин-
эстеразного гена и сравнительном анализе первичной структуры
амплифицированного фрагмента;
метод вьшвления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота, основанный на амплификации фрагмента S1B области спайкового гена и сравнительном анализе первичной структуры амплифицированного фрагмента: - оптимизация условий проведения ПЦР и секвенирования при выявлении и штаммовой дифференциации коронавируса КРС;
первичная структура исследуемых областей гемагглютинин-эстеразного и спайкового генов, ранее изученных и выявленных на территории РФ штаммов и полевьж изолятов коронавируса крупного рогатого скота;
сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и изолятов коронавируса крупного рогатого скота.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота" ВНИИЗЖ, г. Владимир (2002 г.), Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы болезней молодняка" г. Воронеж (2002 г.) и на 4-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" г. Москва (2002 г.).
Публикация результатов исследований. Результаты исследований изложены в 6 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложения. Список литературы включает 142 источника. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 10 таблицами.
Коронавирусная инфекция дыхательных путей
Кроме энтерических патологий KB может являться причиной инфекции дыхательных путей у КРС различного возраста. Инфекция обычно проходит в субклинической форме, но клинические признаки часто наблюдаются у телят в возрасте 2-16 недель [47, 48, 50, 51, 68, 75, 90, 95, 96, 109, 121, 124]. В дыхательных путях поражаются эпителиальные клетки носовой полости и трахеи, где инфекция может вызывать признаки респираторного заболевания, такие как риниты, чихание и кашель. Для диагностики этих инфекций может быть использован метод иммунофлуоресцентного окрашивания клеток носового эпителия с применением вирусспецифических антител [90]. Вирус может поражать и нижние дыхательные пути, являясь причиной небольших легочных повреждений, но клинические признаки при этом часто отсутствуют. Тем не менее, наряду с этим, описано множество тяжелых случаев поражения нижних дыхательных путей [56]. KB инфекция дыхательных путей обычно не так тяжела, чтобы нуждаться в лечении, но может создать предрасположенность к очень тяжелой вторичной инфекции нижних дыхательных путей. Экспериментальные исследования подтвердили, что инфекция имеет два пути проникновения - назальный и оральный [95]. Таким образом, KB КРС может поражать как кишечный, так и респираторный тракт [68, 90, 121, 124, 127]. Инфекция часто поражает одновременно и кишечный тракт и дыхательные пути [51, 90, 95]. У вновь инфицированных животных при репликации вируса в верхних дыхательных путях может продуцироваться большое количество инфекционных частиц защищенных слизью, которые затем переносятся в кишечник, где начинается вторичная инфекция. Распространение вирусной инфекции воздушно-капельным путем способствует продлению заболевания и поддерживает вирусоносительство [46, 51,96]. 2.3. "Зимняя дизентерия" В последние годы KB КРС широко известен как этиологический агент зимней дизентерии. Заболевание встречается в стойловый период на фермах, где содержится взрослый скот молочного и мясного направлений, и характеризуется кровавыми диареями, сопровождаемыми снижением молочной продуктивности. У пораженных животных могут так же наблюдаться выделения из носа и кашель, животное становится вялым и может страдать анарексией. Высокая скорость распространения заболевания в стаде приводит к высокой заболеваемости (50-100%), но смертность при этом низка, не более 2%. Экономические же потери, проявляющиеся в уменьшении молочной продукции, могут, быть очень высокими, так как выработка молока может не возвращаться к норме в течение нескольких месяцев.
Клинические синдромы и патологические изменения при зимней дизентерии связаны с особенностями штамма вируса, вызвавшего заболевание [126]. Вирус часто обнаруживали и выделяли из образцов фекалий больных животных. Однако существует предположение, что причиной возникновения зимней дизентерии может являться и некоторая часть нормальной микрофлоры кишечника взрослых животных [14, 19, 38, 39, 41, 53, 98, 99, 119, 120]. Эпидемиология зимней дизентерии сходна с той, что вызывает KB КРС. Стада, ранее переболевшие зимней дизентерией, с большой вероятностью в дальнейшем будут претерпевать вспышки дизентерии, поскольку содержат животных-вирусоносителей. Коронавирус способен переживать низкие температуры окружающей среды, поэтому в зимний период часто вызывает заболевание [86]. Широкое распространение KB инфекции как оральным, так и респираторным путем способствует увеличению рождения недоношенных телят в зимние месяцы. KB, вызывающий зимнюю дизентерию у взрослых животных, очень сходен с вирусом, вызывающим диарею новорожденных телят [12]. Имея небольшие различия, вирусные штаммы могут вызывать два заболевания. Как продемонстрировали Benfield и Saif [14], два из трех вирусных изолятов зимней дизентерии не могли вызвать агглютинацию эритроцитов крыс и мышей. Хотя данные литературы указывают на связь KB и зимней дизентерии, не всегда удается вызывать диарею у взрослого КРС оральной инокуляцией вируса, выделенного из фекалий животных, заболевших в естественных условиях, хотя на телятах-гнотобионтах коронавирусная диарея была воспроизведена [97]. Неудачи воспроизведения болезни на взрослых животных могут быть связаны с другими факторами, например такими, как смена питания, низкие температуры, а так же присутствие различной микрофлоры. 2.4. Характеристика семейства Coronaviridae В семействе Coronaviridae выделяют два рода - Coronavirus и Torovirus. Вирионы коронавирусов имеют плейоморфную липопротеиновую оболочку с большими (12-14 нм) булавовидными выступами. Свое название коронавирусы получили благодаря сходству этих выростов с corona spinarum - терновым венцом вокруг головы святого на средневековых религиозных картинах. Внутри вирусной частицы находится нуклеокапсид диаметром 11-14 нм. Диаметр вирионов 75-160 нм. Геном представлен несегментированной одноцепочечной позитивной молекулой РНК с молекулярной массой 5,5-8,Г106Да. Геномная РНК полиаденилирована и имеет кэп. Вирусные частицы содержат от четырех до шести основных структурных полипептидов вируса, некоторые из которых гликозилированы, Коронавирусы способны вызывать слияние клеток, некоторые вызывают гемагглютинацию (в том числе KB КРС) и обладают проте инкиназ ной активностью. Репликация коронавирусов уникальна и происходит в цитоплазме, а сборка включает этап отпочковывания, обычно от внутриплазматических мембран. Высвобождение вирусных частиц осуществляется путем слияния мембран и экзоцитоза. Большинство представителей семейства обладает тропностью к клеткам эпителия дыхательных путей и желудочнно-кишечного тракта. Для коронавирусов характерна видовая специфичность и ограниченный круг хозяев. Устойчивость KB КРС, как и других коронавирусов, зависит от ряда факторов - температуры, рН, ионного и коллоидного состава окружающей среды. При 59С в течение одного часа разрушается около 90% вирусных частиц, при 37 С коронавирусы выживают несколько дней, а при 4 С - в течение нескольких месяцев. При -70С и ниже коронавирусы сохраняются на протяжении многих лет без существенного снижения инфекционного титра. Считают, что двухвалентные катионы не оказывают на коронавирусы стабилизирующего влияния при прогревании. Тем не менее, по данным R.L. Sharpee и соавторов [107], термостабильность коронавируса повышается в среде с 1 М MgCl2. Кислая и щелочная среда (рН 3,0 и рН 12,0) оказывает инактивирующее действие на KB КРС, хотя при кислых рН коронавирусы более устойчивы, чем при щелочных. Максимальная устойчивость вируса наблюдается в растворах с рН 6,0-6,5. Коронавирусы резистентны к фенолу (0,5% раствор - в течение 20 минут), перманганату калия (1:20000 - в течение 20 минут), и трипсину (0,5%-ный раствор - в течение 20 минут при 37С). Инактивация наблюдалась под действием этанола (50, 25, 12,5%-ные растворы - за 3 минуты при комнатной температуре), формалина (0,5% раствор - за 10 минут при комнатной температуре), а также эфира (10%-ный раствор - за 24 часа при 20С) и хлороформа (5%-ный раствор - за 10 минут при комнатной температуре).
Гемагтлютинин-эстеразный гликопротеин
НЕ гликопротеин является дисульфидно-связанным димером с молекулярной массой 120-140 кДа. 2-меркаптоэтанолом он разделяется на два идентичных мономера с молекулярной массой 65 кДа. Ген, кодирующий НЕ гликопротеин, содержит две открытые рамки считывания (ОРС1 и ОРС2). НЕ ген очень консервативен [57, 80]. Кодируемый белок состоит из 424 а.о., содержит сигнальный пептид, девять потенциальных сайтов N-гликозидной связи и С-концевой гидрофобный домен, закрепленный в мембране, Продукт трансляции имеет молекулярную массу 42,5 кДа. Далее мономер гликозилируется, после чего его молекулярная масса составляет 59 кДа, и сразу подвергается димеризации, образуя дисульфидные мостики [34, 52, 81]. Высокий уровень гликозилирования является отличительной чертой этого белка. Олигосахариды составляют 35% от его массы, в то время как у S белка они составляют 17%, а у матриксного гликопротеина только 13% [62]. Сходный уровень гликозилирования (около 30%) наблюдается у G гликопротеина респираторно-синцитиального вируса. KB КРС вызывает гемагглютинацию и гемадсорбцию - процесс адсорбции эритроцитов на мембранах инфицированных клеток [57, 85, 107]. Первоначально предполагалось, что НЕ является единственным гемагглютинирующим белком KB КРС [58, 59], но теперь доказано, что и S и НЕ гликопротеины вызывают гемагглютинацию прикрепляясь к рецепторам плазматической мембраны, содержащим Neu 5, 9 Ас2 [104, 105]. Гемагглютинирующие свойства НЕ гликопротеина фактически слабее, чем у S гликопротеина т.к. он агглютинирует эритроциты мышей и крыс и не агглютинирует эритроциты взрослых цыплят, которые имеют меньше поверхностных рецепторов [104]. В настоящее время еще не ясно, почему коронавирус КРС содержит два пепломера, связывающихся с клеточными рецепторами, т.к. многие коронавирусы не содержат НЕ гликопротеин. S и НЕ гликопротеины содержат важные нейтрализующие эпитопы. МКАТ к НЕ гликопротеину могут нейтрализовать вирус как in vitro, так и in vivo [36]. В этом белке были обнаружены два независимых эпитопа (А и С) и третий кроющий эпитоп (В). Все нейтрализующие МКАТ картированы по эпитопу А [33, 80, 81,129]. НЕ гликопротеин содержит рецептор-разрушаюший фермент (РРФ), который отщепляет Neu5,9Ac2, инактивируя таким образом клеточные рецепторы для KB КРС. Активация этого фермента происходит при эллюции вируса с эритроцитов, когда температура повышается до 37 С [81, 105, 118, 129, 133, 134]. РРФ, по-видимому, участвует в ранних стадиях репликации вируса, так как ингибирующее действие фермента сильно снижает инфекционность вируса [133]. НЕ гликопротеин КВКРС по структуре и функциям сходен с НЕ белком вируса гриппа типа С.
Сходство аминокислотной последовательности между НЕ белком KB КРС и субъединицей HAI белка НЕ вируса гриппа типа С составляет 29,7% [57], тем не менее НЕ белок обоих вирусов вызывает гемагглютинацию, связывается с рецепторами содержащими Neu5,9Ac2 и обладает рецептор-разрушающим ацетилэстеразным ферментом [103, 104, 105, 118, 133, 134]. На основе наблюдений предполагается, что коронавирусы могли приобрести НЕ ген от вируса гриппа типа С в процессе негомологичной рекомбинации [66]. 2.8. Репликация коронавируса крупного рогатого скота KB КРС прикрепляется к рецепторам клетки посредством S и НЕ гликопротеинов (рис. 2) [104, 105, 134]. Для инициации процесса рецепторы клетки должны содержать К-ацетил-9-0-ацетилнейраминовую кислоту (Neu5,9Ac2) [106]. Для проникновения в клетку KB КРС, возможно, требуется два типа рецепторов [106]. Механизм проникновения вируса в клетку точно неизвестен - это достигается либо прямым слиянием вирусной оболочки с плазматической мембраной клетки, или эндоцитозом, с последующим слиянием вирусной оболочки и мембраны эндоцитозной везикулы [27, 83, 139]. Тот факт, что инфекционность коронавирусов подавляется лизосомотропным препаратом хлорокином, свидетельствует о том, что основным способом проникновения коронавирусов в клетку является абсорбционный эндоцитоз. Репликация вируса полностью проходит в клеточной цитоплазме. Сначала геномная РНК прикрепляется к рибосомам и инициирует синтез РНК зависимой РНК S пепломеров; вирус проникает в клетку при слиянии вирусной оболочки с плазматической мембраной или посредством эндоцнтоза. Геномная РНК служит в качестве мРНК при синтезе РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая на геномной РНК синтезирует полноразмерную минус цепь. При считывании минус-цепи образуется новая геномная плюс-РНК и набор субгеномных мРНК. Геномная РНК и мРНК имеют кэп, полиаденилированный участок, а также общую лидерную последовательность. При трансляции каждой мРНК образуется один белок. Вирионы отпочковываются только от мембран ШЭПР и аппарата Гольджи, но не от плазматической мембраны. Выход вирусных частиц из клетки осуществляется с ее лизисом или в везикулах, образованных в аппарате Гольджи. полимеразы. Вирусную РНК-полимеразную активность обнаруживают в мембранной фракции зараженных клеток спустя 2-3 часа после инокуляции вируса. Этот фермент с (+) цепи генома транскрибирует комплиментарную (-) цепь РНК полной длины, содержащую на 5 -конце последовательность poly U. Синтез этой РНК заканчивается через 5-6 часов после заражения. Негативная (-) РНК служит матрицей для синтеза полной геномной РНК и девяти субгеномных мРНК, которые имеют общие 3 -концы. Каждая мРНК включает всю нуклеотшшую последовательность следующей, меньшей мРНК и дополнительный ген на 5 конце который и представляет собой уникальную область. Таким образом, с мРНК транслируется лишь последовательность, прилегающая к 5 -концу. Кроме того, 5 конец имеет общую лидирующую последовательность 60-70 н., и это позволяет предположить, что именно лидерная последовательность, полученная с 3 конца (-) цепи РНК, запускает механизм транскрипции. Лидерная РНК транскрибируется с 3 -конца (-) цепи РНК и отделяется от матрицы, при этом оставаясь связанной с полимеразой. Затем лидерная последовательность, ассоциированная с полимеразным комплексом, связывается со специфическими не кодирующими областями, называемыми сайтами реинициации, где она действует как праймер для синтеза мРНК. Транслируются только уникальные области мРНК, и большинство из них включают одну рамку считывания, которая кодирует только один белок. Одна из мРНК кодирует II кДа белок-предшественник, который позже подвергается рестрикции с образованием двух неструктурных белков 4,8- и 4,9 кДа. Трансляция мРНК, кодирующих N протеин и неструктурные белки, происходит на полисомах клеточной цитоплазмы.
В дальнейшем N белок подвергается фосфорилированию. Функции неструктурных белков не известны. Однако то, что они содержат гидрофобные и высоко заряженные домены позволяет предположить, что они могут принимать участие в установке больших структурных протеинов при сборке вириона или могут корректировать действие вирусной полимеразы во время репликации [16, 17,63,110,111]. Синтез М, S, НЕ протеинов происходит на рибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭПР), однако в их процессинге и трансляции имеются важные отличия, S и НЕ гликопротеины имеют N-концевой сигнальный пептид, который ответственен за перенос синтезируемой полипептидной цепи через мембрану в полость ШЭПР. Сигнальный пептид имеет центральный участок, состоящий из незаряженных, в основном гидрофобных аминокислот, с N-конца ограниченный положительно заряженным остатком. Во время переноса через мембрану сигнальный пептид отщепляется от вновь синтезированного белка "сигнальной пептидазой". Далее S и НЕ гликопротеины подвергаются гликозилированию путем переноса олигосахаридов с долихолфосфатных интермедиантов на аспарагиновые остатки растущей полипептидной цепи. Обработка зараженных клеток туникамицином предотвращает их гликозилирование. Во время переноса гликопротеинов от ШЭПР через аппарат Гольджи к плазматической мембране клеточные ферменты модифицируют олнгосахариды и ацилируют гликопротеины путем добавления остатков жирных кислот. Расщепление S гликопротеина на две большие субъединицы протеазами клетки-хозяина, необходимое для увеличения вирусной инфекционности, происходит в аппарате Гольджи или на плазматической мембране. Избыток S и НЕ гликопротеинов, не использованных в процессе сборки вирионов, транспортируются к плазматической мембране клеток, что делает клетки чувствительными к лизису под действием противовирусных антител и комплемента или клеток иммунного ответа. Кроме того, оба гликопротеина на поверхности клеточной мембраны способны вызывать слияние клеток с образованием синцития.
Методы
Выделение РНК с некоторыми модификациями осуществляли по методу, разработанному во ВНИИЗЖ [3, 4]. 30% суспензию тканевого материала или фекалий отбирали в количестве 250 мкл и вносили в 1,5 мл пробирку, содержащую 500 мкл 6 М гуанидин тиоционата (ГТЦ). Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. Далее вносили 500 мкл деионизированной воды, пробу тщательно перемешивали и центрифугировали 1 мин. при 13 тыс. g. Супернатант отбирали и добавляли 96% этанол до объема 1,5 мл. Полученную смесь под вакуумом пропускали через стекловолокнистые фильтры GF/F или GF/C. Далее фильтр с сорбированной на нем РНК промывали 80% этанолом. Остатки этанола с фильтра удаляли центрифугированием при 13 тыс. g. в течении 30 секунд. После этого на фильтры наносили 50 мкл деионизированной воды и центрифугировали 10 секунд при 13 тыс. g. Полученную РНК хранили при - 20 "С. 3.2.2. Реакция обратной транскрипции. Для синтеза первой цепи кДНК к 10 мкл раствора суммарной РНК добавляли по 5 пмоль праймеров CHlb и СН4 или CS1 и CS4, соответственно, 2,5 мкл 10 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), 2,5 мкл 5х ревертазного буфера, 5 ед. РНК-зависимой ДНК-полимеразы из вируса миелобластоза птиц или 15 ед. РНК-зависимой ДНК-полимеразы из вируса лейкемии мыши Молони, воду до конечного объема 25 мкл, перемешивали и инкубировали с AMV ревертазой 15 мин. при 50 С и с M-MLV 40 мин. при 37 С, 3.2.3. Амплификация кДНК. Для приготовления реакционной смеси в тонкостенную пробирку объемом 200-500 мкл вносили 3 мкл раствора первой цепи кДНК, по 5 пмоль праймеров CHlb и СН4 или CS1 и CS4, 2,5 мкл 10 х ПЦР буфера, 1 мкл 10 мМ dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы и воду до конечного объема 25 мкл, сверху наслаивали 15 мкл минерального масла. Для амплификации фрагмента НЕ гена 30 циклов ПЦР проводили при следующем режиме: денатурация 94 С -15 с; отжиг праймеров 59С - 30 с; элонгация 72С - 45 с; Анализ продуктов реакции проводили в 2% агарозном геле. Наличие в геле фрагмента ДНК длиной 606 пар нуклеотидов (п.н.) свидетельствовало о присутствии РНК коронавируса КРС в исследуемом материале. Для проведения второй реакции ПЦР составляли смесь следующего состава: 3 мкл реакционной смеси первой реакции амплификкаций, 1 мкл 10 мМ dNTP, 2,5 мкл 10 х ПЦР буфера, по 5 пмоль праймеров СН2 и СНЗ, 2 ед. Taq-полимеразы и воду до конечного объема 25 мкл и сверху наслаивали 15 мкл минерального масла. Реакцию проводили при следующих условиях: денатурация 94С -10 с; отжиг праймеров 60 С - 30 с; элонгация 72 С - 30 с: Анализ продуктов реакции осуществляли после 25 циклов.
Реакция считалась положительной, если полученный фрагмент соответствовал по размеру фрагменту положительного контроля и составлял 289 п.н., при этом в отрицательном контроле не должно наблюдаться никаких фрагментов. Если искомый продукт не был обнаружен дополнительно проводили 5-7 циклов при тех же температурно-временных параметрах реакции. Для амплификации фрагмента S гена проводили 30 циклов ПЦР при следующем режиме: денатурация 94С - 20 с; отжиг праймеров 56С - 30 с; элонгация 72С - 70 с; Анализ продуктов реакции осуществляли в 2% агарозном геле. Наличие в геле фрагмента ДНК длиной 953 п.н. свидетельствовало о присутствии РНК коронавируса КРС в исследуемом материале. Вторую реакцию амплификации проводили при следующих условиях: денатурация 94С - 15 с; отжиг праймеров 58С - 30 с; элонгация 72С - 45 с; Анализ продуктов реакции осуществляли после 25 циклов. Реакция считалась положительной, если полученный фрагмент соответствовал по размеру фрагменту положительного контроля и составлял 686 п.н., при этом в отрицательном контроле не должно наблюдаться никаких фрагментов. Если фрагмент необходимой длины не выявляли, дополнительно проводили 5-7 циклов при тех же температурно-временных параметрах реакции. 3.2.4. Вариант ПЦР "continuous". Вариант Continuous включает в себя реакции реверсии и первой стадии амплификации. Реакционная смесь идентична используемой для постановки первой реакции амплификации, но дополнительно содержит 5-Ю ед. ревертазы. Температурно-временной режим реакции: 1. Реверсия 50С - 15 мин.; 2. Инактивация ревертазы 95С - 3 мин.; 3. Денатурация 94С - 15 с; 4. Отжиг праймеров 59С - 30 с; 5. Элонгация 72С - 45 с; Шаги 3-5, как и при первой амплификации, повторяли 30 циклов. 3.2.5. Очистка продуктов ПЦР. Пробу, содержащую амплифицированную ДНК забирали из-под масла и переносили в 1,5 мл пробирку. Добавляли 500 мкл 4 М ГТЦ и перемешивали. Смесь пропускали через стекловолокнистые фильтры GF/F, используя вакуумный коллектор и фильтры с сорбированной на них ДНК промывали 80% этанолом. Остатки этанола удаляли центрифугировнием при 13 тыс. g. в течении 30 с. После этого на фильтры наносили 50 мкл деионизированной воды и центрифугировали 10 с. при 12 Tbic.g. Очистку продуктов ПЦР также можно провести используя набор Magic PCR Preps DNA Purification System, по инструкции производителя. 3.2.6. Реакция секвенирования. Секвенирование продуктов амплификации проводили по модифицированному методу Сенгера [100], используя набор fmol DNA Sequencing System по инструкции производителя. Пробирки с реакционной смесью помещали в предварительно прогретый до 94С амплификатор и проводили реакцию с праймером СН2 или СНЗ при следующих параметрах: денатурация 94еС -10 с; отжиг праймеров 62С - 30 с; элонгация 72С - 1мин.; Для праймеров CS2 и CS3 эти параметры имели вид: денатурация 94С - 15 с; отжиг праймеров 58С - 30 с; элонгация 72С - 1мин.; Количество циклов 10-25 в зависимости от количества продукта и активности радионуклеидов. После завершения реакции на стенку каждой пробирки добавляли З мкл стоп-раствора и осаждали центрифугированием. Непосредственно перед проведением электрофореза реакционную смесь прогревали в течение 2 минут при 80С. В лунки геля вносили 2,5-3,0 мкл каждой пробы. После окончания электрофореза секвенирующий гель отмывали от мочевины, сушили и закладывали на авторадиографию.
После экспозиции (10-20 ч.) пленку проявляли, промывали и высушивали. 3.2.7. Компьютерный анализ данных. Расчет праимеров и анализ нуклеотидных последовательностей штаммов и изолятов KB КРС, полученных из компьютерной базы данных GenBank, а также анализ нуклеотидных последовательностей, установленных в собственных исследованиях изолятов KB КРС, осуществляли с помощью компьютерных программ OLIGO, version 3.3-251 (Rychlik W., 1988-1990), SQ-MAX, версия 1.01В [5], ALIGN, version 1.01 (Scientific and Educational Software, 1989), SEQPROGS (Knowles N.J., 1991-1992). 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 4,1. Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ГЩР и секвенирования фрагмента НЕ гена 4.1.1. Исследование профиля вариабельности НЕ гена. Исследование первичной структуры генома вирусов имеет большое как научное, так и практическое значение. Полученные данные нуклеотидной последовательности вирусного генома позволяют разработать методы его выявления, которые по сравнению с традиционными методами отличаются высокой чувствительностью и специфичностью. Сравнение нуклеотидных последовательностей подтверждает видовую принадлежность выявленного вируса, позволяет идентифицировать, дифференцировать и устанавливать степень родства между исследованными штаммами и изолятами вирусов. По нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты можно установить аминокислотную последовательность белков, осуществить направленный синтез отдельных фрагментов генома, их клонирование и экспрессию, что позволяет анализировать иммунологические свойства отдельных антигенных детерминант вирусных протеинов. Анализ первичной структуры вирусного генома дает представление обо всех потенциальных вирусных белках, их структурных особенностях, свойствах, изменчивости, а также филогенетических отношениях вируса. Таким образом, исследование первичной структуры генома вирусов позволяет более глубоко изучать биологические свойства возбудителей и совершенствовать методы их диагностики. Одним из методов индикации возбудителя по наличию в материале его генома является ПЦР
Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области S гена
Разработка нового метода выявления и штаммовой дифференциации KB КРС прежде всего связана с тем, что ранее предложенный метод не позволял дифференцировать некоторые штаммы и изоляты вируса. Поскольку антигенные различия между штаммами и изолятами вируса невелики, применять серологические тесты для их дифференциации не эффективно. Тем не менее, это имеет большое практическое значение даже при использовании инактивированных вакцин. Кроме того, сравнительный анализ вариабельного фрагмента НЕ гена различных штаммов и изолятов вируса показал отсутствие зависимости между уровнем отличий нуклеотидных последовательностей и местом, а также временем выявления штаммов и изолятов, что, как уже было отмечено, может иметь немаловажное значение для установления путей распространения инфекции. Полученные данные относительно вариабельности анализируемого фрагмента НЕ гена дают основания предполагать, что сравнительный анализ его первичной структуры не позволяет устанавливать филогенетические отношения между штаммами и изолятами вируса. В данном случае анализ другого фрагмента генома может подтвердить наличие корреляции между степенью филогенетического родства различных штаммов KB КРС и уровнем сходства их нуклеотидных последовательностей, или предположение относительно особенностей возникновения нуклеотидных замен в исследуемом фрагменте НЕ гена. Таким образом, разрабатываемый метод должен обладать не менее высокой чувствительностью и специфичностью, но более высокой дифференцирующей способностью, а также, по возможности, сравнительный анализ анализируемого участка генома должен отражать филогенетические отношения между штаммами и изолятами вируса. Изучению структурно-функциональных особенностей белков-рецепторов традиционно уделяется большое внимание, поэтому первичная структура S гена KB КРС, наряду с НЕ геном, при сравнении с другими участками генома, изучена хорошо. Особенно в этом отношении выделяется область S1B субъединицы S1, кодирующая наиболее важные антигенные детерминанты белка, и его сайт протеолитического расщепления. Эта область длиной 1147 н. была изучена у десяти штаммов KB КРС, выделенных во Франции, Канаде и Америке (табл. 8). При 30 циклах первой стадии ПЦР и 25 циклов "nested -стадии появление неспецифических продуктов реакции не наблюдалось, однако значительное увеличение числа циклов приводит к их появлению. Количество праймеров на одну реакцию не должно превышать 10 пмоль, поскольку это также приводит к появлению неспецифических продуктов реакции.
Концентрацию ионов Mg2+ меняли в пределах от 1 до 5 мМ. Концентрация 1,5 мМ не приводила к потере чувствительности реакции и не вызывала снижения специфичности реакции. Состав и концентрация других компонентов реакции (буфер, dNTP, фермент) соответствовали рекомендации фирмы-производителя ("Promega"). Оптимальная температура отжига праймеров для реакции первой амплификации составляет 56С, а для "nested" ПЦР 58еС. При повышении температуры отжига на 2С резко уменьшалась чувствительность реакции, а при ее понижении, соответственно, снижалась ее специфичность. Секвенирование осуществляли с помощью праймеров для "nested" ПЦР. Реакцию проводили при тех же условиях, что и "nested" ПЦР с увеличением элонгации до 1 мин. 4.2.3. Апробация метода и анализ полученных данных. Апробацию метода проводили как на лабораторных штаммах KB КРС, так и на полевых изолятах вируса, в том числе и выявленных ранее. В исследовании были использованы штаммы Nebraska и ВНИИЗЖ, пробы патматериала от больных, павших или вынуждено убитых телят и взрослых животных с кишечной или респираторной клиникой. Чувствительность этого метода не уступала ранее разработанному и составляла около 1,5 lg ТЦДзо/мл. Специфичность реакции была подтверждена секвенированием амплифицированных фрагментов. В ходе исследования были установлены нуклеотидные последовательности фрагмента S гена (1551 - 2149 н.) штаммов KB КРС Nebraska и ВНИИЗЖ, а так же 8 полевых изолятов, выявленных на территории РФ. Полученные и ранее опубликованные нуклеотидные последовательности этого участка S гена 30 штаммов и изолятов KB КРС сравнили между собой. Эти данные представлены на рис. 13. Различия первичной структуры штаммов и изолятов KB КРС в анализируемой области S гена выше, чем в исследованой области НЕ гена. Максимальные различия между двумя сравниваемыми последовательностями в данном случае составляют 9,38%. Это обстоятельство обуславливает более высокую дифференцирующую способность исследуемой области S гена. При сравнении первичной структуры 30 штаммов и изолятов KB КРС, в том числе и филогенетически близких, нуклеотидные последовательности анализируемого фрагмента S гена были идентичны только у штаммов ВНИИЗЖ и Quebec. Таким образом, выбранный фрагмент генома прекрасно подходит для штаммовой дифференциации вируса. По данным авторов в 531 позиции у трех из четырех сравниваемых штаммов обнаружен глицин (G), однако это не совсем так. В действительности у сравниваемых штаммов Ontario/BCO.43277 и Ontario/BC0.44175 находятся аспарагиновая кислота (D) и аспарагин (N), соответственно (в обоих случаях данные были взяты из GeneBank, accession nubers AF239308 и AF239309). Таким образом, как видно из таблицы, в 531 позиции специфичной аминокислотной замены для респираторных штаммов и изолятов KB КРС не наблюдается. В 578 позиции у штаммов ОК-0514-3, Ontario/BCO.43277 и Ontario/BCO.44175 наблюдается замена треонина (Т) на серии (S), а в 691 позиции у штаммов Ontario/BCO.43277 и Ontario/BCO.44175 вместо аланина (А) стоит треонин (Т). Однако, поскольку эти замены были выявлены в первом случае у трех, а во втором у двух штаммов из восьми сравниваемых, вряд ли их можно назвать специфическими.
Скорее они носят случайный характер. Изоляты Муром/01/01 и Юрьев-Польский/02/02, выявленные одновременно из респираторного и желудочно-кишечного трактов, в 531 позиции имели аспарагиновую кислоту (D), в 578-треонин (Т), а в 691-аланин (А). Таким образом, достоверной корреляции между респираторными и энтеропатогенными штаммами и изолятами KB КРС по данным позициям нет. Корреляция наблюдалась только по 510 позиции (у всех респираторных штаммов был выявлен треонин, а у энтеропатогенных серии), однако подтвердить или опровергнуть эти данные с помощью наших исследований, к сожалению, мы не можем, поскольку эта позиция не вошла в область исследуемого нами фрагмента S гена. Тем не менее, довольно странным кажется то, что одни и те же штаммы вируса, что нашло подтверждение и в наших исследованиях, способны вызывать как респираторную клинику, так и энтериты [51, 90, 95]. При этом значительных отличий в антигенных свойствах и по цитопатическому действию между респираторными и энтерическими штаммами и изолятами не наблюдается [142]. Подобные различия, скорее всего, должны были найти свое отражение в особенностях вирусных рецепторов, ответственных за проникновение вируса в клетку. Однако, как можно судить и по собственным исследованиям, сравнительный анализ полноразмерных аминокислотных последовательностей и функционально важных областей НЕ и S гликопротеинов не выявил или выявил лишь незначительные различия [43], Поскольку одни и те же штаммы могут вызывать диарею неонатальных телят и зимнюю дизентерию [123], и отличий по гемагглютинирующим, ацетил-эстеразным, антигенным свойствам и первичной структуре между ними не выявлено [60], можно предположить, что различные клинические проявления, вызванные KB КРС, обусловлены разницей в возрасте, иммунном статусе животных и вирулентности полевых изолятов, поэтому разделение штаммов и изолятов KB КРС на респираторные, диареи неонатальных телят и зимней дизентерии не целесообразно. Однако для подтверждения этого предположения необходимо провести серию заражений серонегативных в отношении KB КРС телят и взрослых животных несколькими штаммами и изолятами вируса, вызывающими у пораженных животных различные клинические признаки. На рис. 15 в виде дендрограммы представлен сравнительный анализ первичной структуры выбранного фрагмента S гена.
