Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Современнные сведения о ринопневмонии лошадей 10
2.2. Диагностика ринопневмонии лошадей 15
2.2.1. Лабораторная диагностика 18
2.3.Современные методы анализа генома герпесвирусов 19
2.3.1. Рестрикционный анализ ДНК герпесивирусов 19
2.3.2. Использование молекулярной гибридизации для выявления ДНК герпесвирусов 24
2.3.3. Определение первичной последовательности нуклеиновых кислот 25
2.3.4. Использование метода ПЦР для выявления нуклеиновых кислот при герпесвирусных инфекциях 26
2.4. Заключение по обзору литературы 32
3. Собственные исследования 34
3.1. Материалы и методы 34
3.1.1 .Материалы 34
3.1.1.1. Вирусы 34
3.1.1.2. Культура клеток 34
3.1.1.3. Среды и растворы 34
3.1.1.4. Реактивы и ферменты. 34
3.1.1.5. Оборудование 35
3.1.2. Методы 35
3.1.2.1.Выращивание культур клеток 35
3.1.2.2. Выращивание вируса ринопневмонии в культуре клеток 36
3.1.2.3.Определение инфекционной активности вируса.,36
3.1.2.4.Концентрирование вируса 36
3.1.2.5. Инактивация вируса ринопневмонии лошадей...37
3.1.2.6. Определение полноты инактивации вируса 37
3.1.2.7. Выделение ДНК из препаратов очищенного вируса 37
3.1.2.8. Рестрикция ДНК, разделение продуктов гидролиза электрофорезом в геле агарозы 38
3.1.2.9. Дот- гибридизация 38
3.1.2.10. Выявление биотина с помощью конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза 39
3.1.2.11. Постановка ПЦР 39
3.1.2.12. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот, расчет олигонуклеотидов 39
3.1.2.13.Статистическая обработка результатов исследований 40
3.2. Результаты исследований 41
3.2.1. Оптимизация параметров репродукции вируса ринопневмонии лошадей 41
3.2.2. Рестрикционный анализ ДНК вируса ринопневмонии лошадей 47
3.2.2.1 .Стабильность генома вируса ринопневмонии при пассировании в культуре клеток МДВК 50
3.2.3. Разработка «Набора препаратов» для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей на основе полимеразной цепной реакции 53
3.2.3.1. Оптимизация условий постановки ПЦР 53
3.2.3.2. Определение специфичности ПЦР при выявлении ДНК вируса ринопневмонии лошадей в пробах патматериала 62
3.2.4. Изучение инактивации вируса ринопневмонии лошадей сернокислой медью 72
3.2.5. Оценка полноты инактивации концентрированных ных препаратов вируса ринопневмонии лошадей методом ПЦР 74
4. Обсуждение 80
5. Выводы 94
6. Практические предложения 96
7. Список литературы 97
8. Приложение 118
- Использование молекулярной гибридизации для выявления ДНК герпесвирусов
- Использование метода ПЦР для выявления нуклеиновых кислот при герпесвирусных инфекциях
- Рестрикция ДНК, разделение продуктов гидролиза электрофорезом в геле агарозы
- Разработка «Набора препаратов» для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей на основе полимеразной цепной реакции
Введение к работе
Инфекционная ринопневмония лошадей наносит значительный экономический ущерб коневодству, который складывается из потери воспроизводительной способности конематок, выбраковки ценных в племенном отношении животных, проведения ветеринарно-санитарных мероприятий.
Ринопневмония лошадей, возникнув в коневодческом хозяйстве, принимает характер стационарной инфекции. Острое течение инфекции чередуется с периодами стертого атипичного проявления болезни, что крайне осложняет диагностику заболевания. В естественных условиях вирус ринопневмонии поражает лошадей, ослов и мулов, независимо от пола, породы и возраста. Отмечено, что чистокровные лошади более восприимчивы, чем полукровки и местные породы.
Поэтому в системе мер, направленных на борьбу с ринопневмонией лошадей, важное значение имеют быстрые и точные методы лабораторной диагностики. Используемые в настоящее время в ветеринарной практике серологические методы диагностики имеют определенные недостатки. Предварительная клиническая диагностика респираторной формы болезни затруднительна, так как симптомы заболевания сходны с клиникой других вирусных болезней, особенно гриппа лошадей.
Диагностика инфекционной ринопневмонии включает клинический осмотр, учет нарастания случаев абортов во второй половине жеребости, выделение и идентификация вируса на культуре клеток, выявление антител методами ретроспективной диагностики (МФА, РН, ИФА, РТГА, РГА, РСК).
В последние годы проводятся интенсивные исследования по разработке новых методов диагностики ринопневмонии лошадей, которые основаны на достижениях молекулярной биологии. Особенностью этих методов является то, что в их основе лежит изучение структурной
6 организации генома герпесвирусов животных или продуктов его экспрессии - вирусспецифических белков.
В настоящее время для идентификации герпесвирусов животных широко применяют такие высокочувствительные методы исследования генома, как рестрикционный анализ, молекулярная гибридизация, секвенирование и полимеразная цепная реакция.
На территории Кабардино-Балкарской Республики (КБР) размещается три государственных конных завода, около десяти племенных конеферм, Государственная Заводская Конюшня, Республиканский ипподром и свыше 30 конеферм, где разводят в основном местную породу. Кроме, местной, кабардинской породы, в республике разводят племенные английскую и арабскую чистокровные породы, а также полукровных лошадей этих пород, которые выращиваются в основном для спорта и продажи.
За последние 3-4 года в КБР наблюдается тенденция сокращения поголовья лошадей. Так, на 1 января 1996 года в республике насчитывалось лошадей свыше 12 тыс. голов, к началу 1997 года сократилось до 8,5 тыс. голов. К концу 1998 года поголовье лошадей уменьшилось до 6428 голов. Ежегодно в республике отмечаются вспышки гриппа, ринопневмонии, мыта жеребят, лептоспироза, случной болезни лошадей.
Анализ воспроизводства лошадей в двух племенных конефермах Чегемского района КБР ( Коллективно-Долевое Хозяйство "Чегем" и Акционерное Общество "Шаджем") показал, что в КДХ "Чегем" за 1995, 1996, 1997 годы выход жеребят составил 45 %, 49%, 51% , а в АО "Шаджем" за этот же период (1995-1997 гг) выход составил 52%, 57%, 43% соответственно. При этом падеж молодняка в возрасте до одного года равнялся от 42 до 45 % от количества всех павших лошадей. Помимо скрытых и поздних абортов среди конематок, отмечается высокий уровень заболевания молодняка респираторными заболеваниями. При исследовании материалов от абортированных плодов в Республиканской ветеринарной лаборатории возбудителей вирусных болезней лошадей традиционными
методами не выявлено, в то же время исходя из клинико-эпизоотологических данных и результатов серологических исследований, очевидно, что одной из причин такого положения может быть хроническая форма ринопневмонии лошадей. Эти данные свидетельствуют о необходимости разработки более чувствительных и специфичных диагностических тест-систем, особенно для выявления латентных и персистирующих форм вируса ринопневмонии лошадей.
Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение возможности использования ПЦР для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей и применения этого метода для диагностики болезни.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить факторы, влияющие на уровень накопления референс-
штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей в перевиваемых
клетках, и определить оптимальные параметры его культивирования;
Провести рестрикционный анализ ДНК вируса ринопневмонии лошадей (референс-штамм «Кентукки-Д») , выращенного в монослое перевиваемых клеток МДВК;
Подобрать специфичные праймеры и оптимизировать условия постановки полимеразной цепной реакции для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей;
Разработать «Набор препаратов ...» для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей в пробах патматериала на основе метода полимеразной цепной реакции и оценить его специфичность и чувствительность;
Изучить возможность использования полимеразной цепной реакции для оценки полноты инактивации вируса ринопневмонии лошадей .
Научная новизна работы. Научная новизна работы заключается в следующем:
впервые, применительно к вирусу ринопневомнии лошадей подобраны специфичные праймеры комплементарные гену гликопротеина , выявляющие ДНК вирулентного и вакцинного штаммов вируса, определены оптимальные параметры постановки ПЦР для обнаружения вирусной ДНК с целью диагностики;
с помощью рестрикционного анализа установлена генетическая однородность референс-штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей;
впервые изучен механизм инактивации вируса ринопневмонии лошадей сернокислой медью.
Практическая значимость. По результатам исследований разработаны: - «Набор препаратов для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей методом ПЦР», временное наставление и методические указания по постановке ПЦР для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей в пробах органов, утвержденные директором ВНИИВВиМ; - метод рестрикционного анализа генома вируса ринопневмонии лошадей, который может быть использован для идентификации и дифференциации штаммов вируса, паспортизации производственных и референс-штаммов, а также для контроля за изменениями вируса в процессе культивирования;
способ оценки полноты инактивации вируса ринопневмонии
лошадей сернокислой медью, заключающийся в определении целостности вирионной ДНК методами полимеразной цепной реакции и электрофореза в геле агарозы.
Положения выносимые на защиту:
оптимизация параметров культивирования и рестрикционного анализа ДНК референс- штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей;
результаты разработки «Набора препаратов» для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей в пробах патматериала методом полимеразной цепной реакции;
способ контроля полноты инактивации вируса ринопневмонии лошадей сернокислой медью методом полимеразной цепной реакции. Апробация результатов исследований. Материалы исследований доложены и обсуждены на: - заседании ученого совета Кабардино-Балкарской Государственной сельскохозяйственной академии 1998 г; Всероссийских научных конференциях по ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии, г. Москва, ВИЭВ,1998 г; ВНИИВВиМ, г. Покров , 1998 г.
Публикация результатов исследований. По результатам исследований опубликовано 5 статей. Исследования по теме диссертации выполнены по теме 01.03.02.М. в лаборатории Биофизики ВНИИВВиМ и на кафедре Акушерства и незаразных болезней КБГСХА. Отдельные фрагменты экпериментальных исследований выполнены совместно с сотрудниками лаб. «Биофизики» и «Музейных штаммов» ВНИИВВиМ Цыбановой Л.Я., Чевелевой Т.С., Щетниковой Л.А., Балышевым В.М., которым автор выражает искреннюю благодарность.
Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на Ь І9 стр. страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, приложение и список литературы, содержащий 35 отечественных и 120 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 9 рисунками.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Использование молекулярной гибридизации для выявления ДНК герпесвирусов
С помощью метода молекулярной гибридизации наиболее полно исследованы вирусы простого герпеса типа 1 и 2 человека, что объясняется не столько интересом исследователей к соответствующим этиологическим агентам, сколько разработанностью на их основе модельных систем генной и клеточной инженерии (Бектемиров Т.А., 1988; Hukkanen Veijo, 1990; Tenover F. С, 1988, 1989). Были изучены механизмы развития герпетической инфекции, а также способность к интеграции вирусного генома с ДНК клетки-хозяина и образования трансформированных клеточных линий (Альжанова А.Г., 1991; Тарантул В.З., 1979; DictorM., 1990). У вируса герпеса лошадей были изучены закономерности репликации, транскрипции и трансформации клеточных линий (Schmidt Р., 1994).
Анализ ДНК ряда герпесвирусов австралийских сумчатых позволил обнаружить две четко различающиеся группы - так называемые, вирусы герпеса кенгуру 1 и 2 типов (Gou Deng Fu 1991). У различных штаммов герпесвирусов Saimiri был также выявлен высоко вариабельный участок генома. С помощью технологии рекомбинантных ДНК в трансфе-цированных клетках были обнаружены делеционные мутанты вируса псевдобешенства (Brown Т.М., 1990). Вирусы болезни Ауески, ИРТ КРС, инфекционного ларинготрахеита птиц, энтеровирусы и др. были выявлены в клинических образцах и пробах патматериала с помощью различных ДНК-зондов (Gutekunst D.E., 1979; Keam L., 1991; Bruce Christine, 1990; Dunn, D.C., 1986; Dunger, C.A., 1988; Brock, K.V., 1990). При изучении кинетики репликации и транскрипции генома вируса ринопневмонии лошадей было показано, что некоторые клонированные рестрикционные фрагменты ДНК человеческого цитомегаловируса при жестких условиях гибридизуются с клеточной ДНК человека и мыши в участках начала репликации (Дрокин Т.А., 1992; Kulski, J.K., 1985; Tenover F. С, 1988, 1989). При исследовании транскрипции генома вируса Эпштейн -Барр в различных клеточных культурах был обнаружен участок ДНК, ответственный за инициацию трансформации (Николаева Т.С., 1990; McNicol Patricia 1990; Brytting Maria, 1991). При анализе образцов клеточных суспензий были отобраны субклоны с высоким содержанием вирусной ДНК (Day Philip J.R., 1990). При обследовании пациентов с неопластическими и лимфопролиферативными нарушениями в ряде случаев были выявлены последовательности ДНК вируса Эпштейн-Барр ( Золотарев Т.Н... 1990; Chou S., 1985; Metcalf Theodore G.,1988). Наиболее точным и прямым методом типирования возбудителей является метод определения первичной последовательности генов, ответственных за проявление вирулентных свойств, а также участков генома ДНК и РНК-содержащих вирусов (Андреев В.Г., 1994; ; Drygin V.V., 1994; Щербаков А.В., 1995; Перевозчикова Н.А., 1995). В настоящее время известны полные нуклеотидные последовательности генома многих вирусов (Сосновцев В.А., 1993). Создан компьютерный банк данных, который постоянно пополняется ( Рыбаков С.С., 1992; McColl К. А., 1994).
Для типирования вирусов не обязательно знать полную нуклеотидную последовательность всего генома. Обычно с помощью компьютерного анализа рассчитывают те участки генома, которые наиболее информативны для дифференциации штаммов (Drygin V.V., 1994; Griffin A.M., 1990). Это чаще всего участки размером в 500-1000 нуклеотидов на стыке консервативных и вариабельных областей генома (Cheney I.W., 1995). С этих участков синтезируют специфические затравки, которые используют для прямого секвенирования исследуемых проб. В настоящее время этот метод применяется для типирования различных штаммов вирусов непосредственно в пробах патматериала (пикорнавирусы, флавивирусы, орто-парамиксовирусы и другие) (Ломакина Н.Ф., 1995; Аянот П.В., 1996; Meyer G., 1991, 1995; McColl К.А., 1994; Drygin V.V., 1994).
Использование метода ПЦР для выявления нуклеиновых кислот при герпесвирусных инфекциях
Сущность полимеразной цепной реакции заключается в использовании двух синтетических олигонуклеотидов-затравок, способных специфически гибридизоваться с комплементарными последовательностями на противоположных цепях ДНК, для одновременного синтеза комплементарных цепей с помощью термостабильной ДНК-полимеразы (Мухаметгалиев Х.Г., 1990; Ломакина Н.Ф., 1995; Low Т. J., 1990). Таким образом, в ходе повторяющихся циклов (денатурация, отжиг и ферментативная достройка затравок) in vitro из одной молекулы ДНК можно получить до одного миллиона копий фрагмента ДНК, которые имеют достаточную концентрацию для анализа другими методами, указанными выше. Такая высокая чувствительность метода позволяет обнаруживать всего несколько копий молекул ДНК, а последующее секвенирование полученной последовательности позволяет выявить замену всего одного нуклеотида (Рыбаков С.С., 1992; Перевозчикова Н.А., 1995; Безбородова СВ., 1995). Разработка указанных выше методов анализа генома является крупным достижением в области диагностики вирусных инфекций, изучения структурных особенностей генома и генетических исследований популяции (Белохвостов А.С., 1995; Перевозчикова НА., 1995). ПЦР широко используется в ветеринарной вирусологии. Ее применяют для обнаружения и идентификации различных ДНК- и РНК-содержащих вирусов (Drygin V.V., 1994; Еремин Н.С., 1991). Чувствительность метода ПЦР при обнаружении герпесвирусов лошадей в 100 - 1000 раз превосходила чувствительность выявления инфекционных вирусов титрованием в культурах тканей (Mccann S.H. 1995; OsterriederN., 1994; Lawrence G.L., 1994). С использованием праймеров, комплементарных 5"-концевой области генома, проведена дифференциация всех исследованных штаммов вирусов диареи крупного рогатого скота, классической чумы свиней и вируса пограничной болезни овец (Liu S.T., 1991; Vilcek S., 1994). С помощью ПЦР осуществлено типирование австралийских, европейских, американских изолятов вируса катаральной лихорадки овец по их серотиповой принадлежности (McCol Kenneth А., 1991).
Чувствительность определения нуклеотидных последовательностей генома вируса псевдобешенства с помощью ПЦР составила 1фг ДНК вируса, что эквивалентно 6 копиям вирусного генома в общем пуле клеточной ДНК (Lockensgard J.R., 1991). Разработана ПЦР и для обнаружения различных штаммов вируса ящура в органах зараженных животных, что позволило быстро и с высокой эффективностью идентифицировать все 7 серотипов ящура. (Щербаков А.В., 1995; Drygin V.V., 1994; Meyer R. R, 1991, 1995). Сравнение чувствительности методов ПЦР и ИФА при выявлении ротавирусов в фекалиях зараженных животных показало преимущество ПЦР (Wilde James et al., 1991; Eiden J.J., Wilde J., Firoozmand R, Yolken R., 1991). Изучена возможность амплификации РНК вируса бешенства в суммарных препаратах РНК, вьщеленных из мозга зараженных животных (Ermine A., etaL 1990), Чувствительность метода ПЦР при амплификации ДНК вируса ИРТ КРС составила 100 фг вирусной ДНК. Кроме того, использованные в реакции праймеры позволили дифференцировать четыре серотипа герпес вируса КРС (Vanengelenburg FA, 1995, Xia J.Q., 1995, Yason C.V., 1995). С помощью ПЦР проведено генотипирование изолятов вируса простого герпеса различных типов (Piiparinen Н.? 1991; Vanschie F.W., 1995). Единственно пригодными методами для выявления вируса папилломы являются гибридизация in situ и ПЦР. ПЦР имеет преимущества перед гибридизацией in situ в тех случаях, когда не нужно сохранять архитектуру исследуемой ткани или определять количество копий ДНК-мишеней. Рассматриваются возможности комбинации этих двух методов в одном тесте (Gravitt Patti, Hakenewerth Anne, Stoerker Jay, 1991;Day Philip J. R, Bevan Ian S., Gurney Susan J., et аЦ 1990;Arends M.J., 1991). Сравнение эффективности двух методов обнаружения цитомегаловируса в культурах инфицированных клеток показало, что метод ПЦР в 100 раз чувствительнее метода культивирования вируса (Amos R.A., Rowley Anne Н., 1991). Использование одной пары праймеров при амплификации ДНК цитомегаловируса в образцах мочи, позволило выявить 100 фг вирусной ДНК, а при применении последовательно двух пар праймеров чувствительность возрастает до 1-10 фг (Bevan I.S., 1991). ПЦР нашла широкое применение для обнаружения латентных форм герпесвирусов животных с целью ранней диагностики инфекции (Piiparinen Н., 1991; Xia J.Q., 1995; Yason C.V., 1995). Более 50 референс-штаммов и полевых изолятов ВРЛ-1 были исследованы с использованием праймеров, комплементарных внутренним и наружным вариабельным повторам генома ВРЛ-1 типа (Osterriede N. 1994). Дифференциацию полевых изолятов и вакцинных штаммов осуществляли по размеру продукта амплификации. Было установлено, что у вакцинного штамма «RacH», прошедшего большое число пассажей в культуре клеток и имеющего делецию размером 850 п.о., размер ПЦР продукта составлял 310 п.о, тогда как референс-штаммы ВРЛ-1 типа и полевые изоляты имели размер продукта 495 п.о.
Рестрикция ДНК, разделение продуктов гидролиза электрофорезом в геле агарозы
Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили по методу, описанному Маниатисом Т. , применяя 10 х рестрикционный буфер согласно паспорту, прилагаемому изготовителем для каждой рестриктазы. В реакционную смесь (50 мкл) эндонуклеазу вносили из расчета 2-5 ед. на 1 мкг ДНК. Смесь выдерживали при 37 С в течение 2-4 часов. Для проверки полноты расщепления ДНК отбирали аликвоты по 5 -10 мкл и проводили электрофорез на минигеле агарозы в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением в смесь 2 мкл 0.5 М ЭДТА и пробы вносили в лунки агарозы для электрофореза (0.5- 1 мкг ДНК на лунку). Электрофоретическое разделение вирусной ДНК и ее фрагментов проводили в гелях 0.6 - 1.0 % агарозы (длина геля 25 см), приготовленных на трис-ацетатном буфере (ТАБ), в течение 16-18 часов при 4 С.
По окончании электрофореза гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали. Для определения молекулярных масс и размеров полученных фрагментов использовали маркеры ДНК фага лямбда, рестрицированная EcoRI, Hindlll, EcoRI + Hindlll и по длине их пробегов в геле агарозы строили интерполяционные кривые. Размеры фрагментов определяли и с помощью пакета прикладных программ DNASIS. Подготовку проб ДНК, иммобилизацию их на мембранных фильтрах, приготовление зондов и гибридизацию проводили по Мазин А. В. качестве меток использовали радиоактивный фосфор и Био-11- дУТФ. Мембранный фильтр с иммобилизованной на нем ДНК после отмывки погружали на одну минуту в буфер ФСБ. Этим же буфером разводили конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза в соотношении 1: 2 000. Фильтр инкубировали с конъюгатом в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем фильтр отмывали 2 раза по 15 минут в 100-200 мл буфера ФСБ. Фильтр переносили для окрашивания в буфер, содержащий 45 мкл раствора NBT, 35 мкл раствора ВСІР и 10 мл буфера ФСБ. Цветовое окрашивание начиналось через несколько минут. Пробу исследуемой ДНК в объеме 10 мкл амплифицировали в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 тМ каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 10mMTrisHClpH8,3, 50 тМ КС1, 3,0 тМ MgC12 и 2,5 ед. Taq-полимеразы . Амплификация проходила в термоциклере Hybaid (Англия) по следующим программам: 3 цикла (денатурация ДНК при 94 С - 30-60 сек, отжиг ДНК при 50 С - 30 - 90 сек, синтез при 72 С - 60 - 90 сек)? следующие 30 циклов (денатурация 94 С - 30 сек, отжиг 50 С - 40 сек, синтез 72 С - 50 сек). Аликвоты ПЦР продуктов объемом 5 - 10 мкл разделяли в 2,0% агарозном геле. Учет результатов амплификации проводили при помощи электрофореза в агарозном геле по размеру ПЦР-продуктов. Сравнивая размеры и расстояния пробегов маркерных ДНК (рестрицированная Hindlll ДНК фага лямбда), и полученных ПЦР продуктов вычисляли размеры исследуемых фрагментов ДНК. Обработку информации первичной структуры ДНК проводили с использованием пакетов прикладных программ DNASIS/PROSIS версия 3.00 и PC Gene, версия 5.15 1988. Расчет вероятных схем спаривания праймеров осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с использованием соответствующих энергетических правил по программе "OLIGO".
Все опыты ставили с числом повторностей ( 3), обеспечивающих получение достоверных результатов . Цифровые данные подвергали статистической обработке средних величин и их ошибок (Меркурьев Е.К., 1979; Урбах В.Ю., 1975; Лакин Г.Ф., 1980). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента - Фишера, согласно которому для большинства биологических экспериментов уровень вероятности Р 0,05 свидетельствует об отсутствии закономерных отличий между сравниваемыми величинами. Обнаруженные отличия считаются достоверными, если уровень вероятности Р 0,05, а при Р 0,01 и Р 0,001 существенность разницы приобретает более значимую достоверность. Проведенные ранее опыты по культивированию вируса показали, что при выращивании в стационарном монослое клеток МДВК референс-штамм «Кентукки Д» вируса ринопневмонии лошадей накапливался в титрах 5,5 - 6,0 lg ТЦД 50/мл, что оказалось недостаточным для выделения вирионной ДНК. Поэтому целью данного этапа работы было изучение влияния некоторых факторов на накопление вируса и определение оптимальных условий его выращивания, обеспечивающих выход вируса с активностью не ниже 7,0 - 7,2 lg ТЦД 50/мл. Накопление вируса с такой активностью, позволяла получить извируссодержащей культуральной жидкости высокоочищенный вирус, пригодный для выделения вирионной ДНК. Для оценки продуктивной способности и выбора перспективной клеточной модели с целью выращивания вируса ринопневмонии лошадей в опытах использовали перевиваемые линии клеток: МДВК, ПС, ПСГК, ПЭКр, РК-15, CV-1. Вирус культивировали в матрасах с монослоем этих клеток в одинаковых условиях в течение 2-6 суток до появления специфических дегенеративных изменений в клетках.
Разработка «Набора препаратов» для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей на основе полимеразной цепной реакции
Оптимизация условий постановки ПЦР. Для выбора праймеров была использована нуклеотидная последовательность гена глнкопротеина В референс-штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей (Riggio М.Р., 1989; Borchers К., 1993) (Таблица 6). В процессе оптимизации условий постановки ПЦР были отработаны различные режимы амплификации, буферные растворы, концентрация праймеров, ионов Mg и дНТФ. Было установлено, что наиболее оптимальная концентрация ионов магния ( в случае амплификации участков вирусной ДНК с выбранными праймерами) составила 3 мМ и значение рН буферного раствора, равной 8,6 . Для амплификации ДНК нами был выбран следующий циклический температурный и временной режим. Каждый цикл состоял из трех стадий: денатурация ДНК (95 С, 40 сек), отжиг праймеров (55 С, 40 сек), элонгация цепи (72 С, 60 сек). На последнем цикле ПЦР стадию полимеризации проводили в течении 7 минут для достройки цепей ДНК. Для амплификации в ПЦР фрагмента гена гликопротеина В вируса ринопневмонии лошадей были использованы две пары праймеров: «внешние» (Д1+Д2) и «внутренние» (ДЗ+Д4). При применении в процессе амплификации этих праймеров получены продукты ПЦР размерами 472 и 602 п.о. При использовании в качестве матриц генома других ДНК -содержащих герпесвирусов (ИРТ КРС, болезнь Ауески) и ДНК, выделенных из неинфицированных клеток МДВК, ПС, ПСГК, органов здоровых лошадей, ПЦР продукт не обнаружен. Результаты этих исследований показаны на рис.3. Б Треки: 1.- Гол. мозг, аборт.плод №5; 2. Лимф, уз., аборт, плод №5; 3. Лимф, уз., павший жеребенок №10; 4. Гол. мозг, павший жеребенок №10; 5. Лимф, уз., аборт, плод №3; 6. Гол. мозг, лошадь №1; 7. Лимф, уз., лошадь №1; 8. Гол. мозг, лошадь №3; 9. Лимф, уз., лошадь №3; 10.
Гол. мозг, лошадь №5; 11. ИРТ КРС; 12. Вирус бол. Ауески. Результаты выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей методом полимеразнои цепной реакции при различных температурах отжига праймеров представлены в таблице 7 и рис.4. Из представленных в таблице 6 данных видно, что из исследуемых штаммов вируса ринопневмонии лошадей (референс-штамм «Кентукки -Д», вакцинный штамм «СВ69») и гетерологичных вирусов ( болезни Ауэски, штамм «БУК», ИРТ КРС, штамм «ТК-А») данная пара праймеров (Д1+Д2) при температурах отжига 50 С, 55 С, 60 С обнаружила только ДНК штаммов вируса ринопневмонии лошадей, кроме ДНК гетерологичных вирусов. На рис.4 показано, что при всех температурах отжига (50? 55? 60 С) количество ПЦР продуктов было одинаковым и при этом не выявлялись неспецифические продукты амплификации. В дальнейшей работе была использована температура отжига, равная 55 С? при которой получены наиболее четкие результаты ПЦР. В результате подбора праймеров. режима и условий (буферного раствора, концентрации ионов магния) проведения ПЦР был разработан набор препаратов для идентификации вируса ринопнвемонии лошадей. Были проведены межлабораторные комиссионные испытания и подготовлены методические указания по применению набора. Для проверки специфичности полимеразной цепной реакции с указанными праймерами в качестве матриц были использованы различные препараты ДНК с соответствующими контролями (рис.3). Для выявление ДНК разных штаммов вируса ринопневмонии лошадей при помощи ПЦР нами были исследованы вирулентный (референс-штамм «Кентукки-Д») и вакцинный штамм (СВ-69).
Результаты опытов показали, что ДНК обоих исследованных штаммов определяются одинаково эффективно с помощью ПЦР при использовании специфических праймеров Д1+Д2 (размер 602 п.о), ДО- Д4 (размер 472 п.о.). При этом не обнаружено различий продуктов ПЦР по молекулярной массе. Нами не наблюдалось амплификации ДНК при использовании в качестве матриц препаратов ДНК вирусов болезни Ауески и ИРТ КРС. Эти контроли были включены в опыт на том основании, что герпесвирусы животных имеют сходную структуру, гомологичные последовательности нуклеотидов и организацию генома.
