Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы 10
2.1. Историческая справка о вирусной диарее КРС 10
2.2. Классификация вируса вирусной диареи КРС 11
2.3. Эпизоотологические и клинические характеристики заболевания 12
2.4. Морфологические и физико-химические свойства вириона 16
2.5. Геном вируса вирусной диареи КРС 16
2.6. Протеины вируса вирусной диареи КРС 21
2.7. Репликация вируса вирусной диареи КРС 29
2.8.1. Проникновение вируса в клетку 30
2.8.2. Трансляция генома вируса вирусной диареи КРС 31
2.8.3. Процессинг полипротеина 31
2.8.4. Репликация генома вируса вирусной диареи КРС 33
2.8.5. Сборка вирионов и отпочковывание их от клетки 34
2.9. Цитопатогенные штаммы вируса вирусной диареи КРС 34
2.10. Диагностика вирусной диареи КРС ...35
2.11. Заключение по обзору литературы 41
3. Собственные исследования 43
3.1. Материалы 43
3.1.1. Вирус вирусной диареи КРС 43
3.1.2. Реактивы и ферменты , 46
3.1.3. Растворы и буферные смеси 47
3.1.4. Оборудование 48
3.2. Методы 49
3.2.1. Расчет праймеров для ПЦР 49
3.2.2. Выделение РНК 50
3.2.3. Обратная транскрипция - ПЦР 51
3.2.4. Очистка продуктов ПЦР 52
3.2.5. Реакция секвенирования 52
3.2.6. Анализ первичной и вторичной структур нуклеиновых кислот 53
4. Результаты собственных исследований и их обсуждение...54
4.1. Стратегия разработки метода выявления генома вируса вирусной диареи КРС 54
4.2. Анализ профиля вариабельности 5'-нетранслируемой области генома вируса вирусной диареи КРС 55
4.3. Подбор праймеров для амплификации фрагмента 56
нетранслируемой области генома вируса вирусной диареи КРС 58
4.4. Оптимизация метода выявления генома вируса вирусной диареи КРС в вируссодержащем материале 61
4.5. Выявление генома вируса вирусной диареи КРС в патологическом материале 64
4.6. Выявление контаминации вирусом вирусной диареи КРС клеточных культур 74
4.7. Оптимизация условий секвенирования фрагмента 5'-
нетранслируемой области генома вируса вирусной диареи КРС 77
4.8. Генотипирование и анализ нуклеотидных последовательностей выявленных изолятов вируса вирусной диареи КРС 77
4.9. Анализ предполагаемой вторичной структуры фрагмента 5'-нетранслируемой области генома выявленных изолятов вируса вирусной диареи КРС 86
5. Заключение 92
6. Выводы 98
7. Практические предложения 100
8. Список литературы 101
Приложения 121
- Эпизоотологические и клинические характеристики заболевания
- Цитопатогенные штаммы вируса вирусной диареи КРС
- Анализ первичной и вторичной структур нуклеиновых кислот
- Анализ профиля вариабельности 5'-нетранслируемой области генома вируса вирусной диареи КРС
Введение к работе
Актуальность темы. Вирусная диарея (ВД КРС) - заболевание КРС, преимущественно молодых животных, характеризующееся широким спектром клинических проявлений, способное протекать в различных формах, как в острой с летальным исходом, так и в латентной - вызывая у животного сероконверсию без каких-либо клинических проявлений. Возбудителем данного заболевания является вирус вирусной диареи КРС (по международной номенклатуре имеет название bovine viral diarrhea virus - BVDV), который относится к роду Pestivirus семейства Fiaviviridae. Вирус характеризуется высокой устойчивостью во внешней среде, что способствует его широкому распространению. Статистические данные показывают, что потери в животноводстве от вирусной диареи КРС в мировой экономике составляют несколько десятков млн. долларов в год.
Постановка диагноза и оценка роли инфекции вируса ВД КРС включает эпизоотологический анализ, определение клинических признаков заболевания, оценку результатов патологоанатомических исследований и идентификацию вируса. Клинически вирусная диарея КРС может проявляться в виде эрозивно-язвенных воспалений слизистых оболочек ЖКТ, ринитом, воспалением лимфоузлов, лихорадкой, лейкопенией, диареей, стоматитом, у коров возможны аборты. При эрозивных поражениях вирусную диарею необходимо дифференцировать от таких заболеваний как чума КРС, ящур, злокачественная катаральная горячка, везикулярный стоматит, инфекционный ринотрахеит, катаральная лихорадка овец, стоматиты другой этиологии. При диарейном синдроме это заболевание дифференцируют от сальмонеллеза, гельминтоза, дизентирий, вызванных другими вирусными патогенами (рота-, корона-, парво-, энтеровирусы). В случае выявления клинических признаков заболевания, сходных с инфекцией вируса ВД КРС, необходимо подтверждение диагноза с помощью лабораторных методов.
На данный момент разработано значительное количество лабораторных
методов выявления вируса ВД КРС и антител против него. Относительно новым и
перспективным направлением в лабораторной диагностике является применение
полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методы, основанные на ТТТПР превосходят на
несколько порядков иммунологические тесты ни чунствительигнгги и
| РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА J
2 специфичности. Применение ПЦР позволяет получить однозначный результат в течение нескольких часов, что становится важным при остром течении заболевания, когда оно может за 2-3 дня привести к летальному исходу. Также одним из значительных преимуществ ПЦР-диагностики является независимость от клеточных культур, поскольку нередки случаи контаминации вирусом ВД КРС сывороток крови КРС и самих клеточных культур, применяемых в вирусологических лабораториях. Секвенирование амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома и сравнительный анализ с банком нуклеотидных последовательностей вируса позволяет проводить штаммовую дифференциацию и с максимальной точностью определять изменения происходящие на уровне генома В начале 90-х г, при вспышках вирусной диареи КРС в США и Канаде с выраженными признаками тромбоцитопении и сильными геморрагическими поражениями по всему организму животных, была выявлена генетически отличная от референтных штаммов группа изолятов. Вследствие этого было предложено разделить штаммы вируса ВД КРС на 2 генотипа, при этом референтные штаммы отнесли к первому генотипу, тогда как представителей новой группы- ко второму. Были выявлены антигенные отличия между представителями разных генотипов и показана возможность ускользания ряда представителей второго генотипа от вируснейтрализующих антител, выработанных против вакцинных штаммов, что приводит к неэффективности вакцинации, вследствие чего могут возникать эпизоотии вирусной диареи КРС. Ввиду новых данных об эпизоотологии заболевания возникает необходимость изучения генетической гетерогенности изолятов вируса ВД КРС, циркулирующих на территории Российской Федерации, и их генотипирование.
Таким образом, актуальной задачей является разработка методов на основе ПЦР, позволяющих выявлять широкий спектр штаммов и изолятов вируса ВД КРС, как первого, так и второго генотипов в различных биологических материалах от больных животных и определять их штаммовую принадлежность. Важное значение имеет осуществление контроля с помощью методов, основанных на ПЦР, над контаминацией данным вирусом клеточных культур и компонентов ростовой среды, применяемых в вирусологических лабораториях.
Цель и задачи исследования. Цель данных исследований заключалась в разработке метода вьшвления и штаммовой дифференциации вируса ВД КРС с помощью ПЦР, нуклеотидного секвенирования и сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, а также в изучении распространенности данного вируса в животноводческих хозяйствах Российской Федерации.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- разработать на основе ПЦР метод вьшвления вируса ВД КРС в различных вируссодержащих образцах;
разработать метод определения генотипа и штаммовой принадлежности выявляемых изолятов вируса ВД КРС, используя нуклеотидное секвенирование амплифицируемой области генома;
изучить распространенность вируса ВД КРС в животноводческих хозяйствах Российской Федерации;
провести анализ нуклеотидных последовательностей амплифицируемой области генома полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ВД КРС; провести генотипирование выявленных изолятов вируса ВД КРС и определить генетическое разнообразие данного вируса в Российской Федерации; создать базу данных нуклеотидных последовательностей амплифицируемой области генома вируса ВД КРС.
Научная новизна исследования. Разработан метод вьшвления вируса ВД КРС в различных образцах на основе ПЦР.
Разработан метод определения генотипа и штаммовой принадлежности выявленных изолятов вируса ВД КРС.
Определены нуклеотидные последовательности 5'-нетранслируемой области генома изолятов вируса ВД КРС, выявленных в патологическом материале на территории Российской Федерации в течении 2000-2003 гг. и двух отечественных вакцинных штаммов.
Проведено генотипирование полевых изолятов и определен спектр субгенотипов, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации.
4 Создана база данных нуклеотидных последовательностей 5'-нетранслируемой области генома вируса ВД КРС.
Практическая значимость исследований. Разработан метод выявления вируса ВД КРС, который позволяет с помощью ПЦР обнаруживать геном вируса в различных вируссодержащих образцах, а также проводить генотипирование и штаммовую дифференциацию на основе определения и сравнительного анализа первичной структуры фрагмента 5'-нетранслируемой области генома вируса ВД КРС. Метод прошел комиссионное испытание, одобрен ученым советом, утвержден директором ВНИИЗЖ и в настоящее время применяется в диагностических исследованиях.
С помощью разработанного метода проведен анализ фрагмента 5'-нетранслируемой области генома 25 изолятов вируса ВД КРС, выявленных в различных образцах патологического материала от животных на территории Российской Федерации в 2000-2003 г.г., а также двух отечественных вакцинных штаммов.
Создана база данных нуклеотидных последовательностей позволяет проводить штаммовую дифференциацию вируса ВД КРС вновь выявленных полевых изолятов.
Публикация научных работ. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Апробация работы. Результаты диссертации доложены и опубликованы в материалах научно-практической конференции «Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и других этиологии и меры борьбы с ними», Иркутск 2001 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка», Воронеж 2002 г.; конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота», Владимир 2002 г.; ГУ Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва 2002 г.; Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных», Владимир 2004 г.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор
Эпизоотологические и клинические характеристики заболевания
In vivo спектр хозяев представителей семейства Ffaviviridae представлен довольно широко - от членистоногих до млекопитающих, - тогда как у пестивирусов и вируса гепатита С ограничен небольшим числом близкородственных видов парнокопытных и приматов, соответственно. Это наблюдается и in vitro - представители семейства Flaviviridae могут продуцироваться в культуре клеток членистоногих, птиц и млекопитающих, а пестивирусы только в культурах клеток парнокопытных [84].
Экспериментально вирусом КЧС можно заразить КРС и мелких жвачных животных, а вирус ВД КРС естественным путем заражает свиней, овец, коз и широкий спектр диких жвачных животных. Однако при заражении гетерологичных хозяев клиническое проявление заболевания вызывает только вирус ВД КРС у овец и свиней [16, 188, 204].
Пестивирусы КРС, овец и свиней также способны инфицировать культуры клеток любого из данных видов животных и реплицироваться в них, но инфекция в гетерологичных клетках, как правило, не ведет к морфологическим изменениям [30, 79, 121, 145, 203]. Такие вирусы называют нецитопатогенными. Нецитолатогенность характерна для вирусов КЧС и ПБО. Для вируса ВД КРС характерно существование как нецитопатогенных штаммов и изолятов, так и обладающих способностью индуцировать ярко выраженное ЦПД [95, 137, 193, 206]. По этому признаку штаммы и изоляты вируса ВД КРС разделяют на два биотипа: цитопатогенный (ЦП) и нецитопатогенный (НЦП). При изучении лизата клеток, инфицированных цитопатогенным и нецитопатогенным штаммами вируса ВД КРС, было выявлено, что способность пестивирусов вызывать ЦПД в культуре клеток связана с продукцией неструктурного протеина p80/NS3 [69,155].
Симптомы болезни, тяжесть переболевания, широта распространения и процент летальности зависят от вирулентности штамма, чувствительности животных и наличия неблагоприятных факторов. Различают острое, подострое, хроническое и латентное течение заболевания. В естественных условиях клиническое проявление заболевания чаще наблюдается у животных в возрасте до двух лет.
При остром течении заболевания симптомы появляются внезапно и выражаются лихорадкой в течение 12-60 часов, умеренной или сильной депрессией, потерей аппетита, появлением множества эрозий и язв на слизистых оболочках ротовой полости и всего желудочно-кишечного тракта. Особенностью острой формы заболевания является тромбоцитопения. У больных животных наблюдается истощение, обезвоживание и ацидоз. Отмечают также хромоту, затрудняющую движение, связанную с эрозиями и некрозом кожи межкопытной щели, ламинитом и воспалением венчика. Профузная диарея часто развивается на второй или третий день после появления клинических признаков, но при остром течении заболевания смерть может наступить раньше развития этого симптома [7,167].
При подостром течении данного заболевания инкубационный период, который сопровождается легкой лихорадкой и лейкопенией, составляет 5-7 дней. Клиническими признаками является отсутствие аппетита, ринит, катаральный энтерит, кашель и кратковременная (12-24 ч) диарея.
Хроническое течение заболевания чаще наступает после острой вспышки. При этом характерна длительная диарея. Часто инфекция протекает в стертой форме и может сопровождаться абортами, поносами и появлением слабого потомства. У лактирующих коров могут снизиться надои. При латентном течении болезнь протекает бессимптомно и переболевание определяют по наличию вирусспецифических антител.
Нейтрализующие антитела обычно появляются через 3-4 недели после заражения и могут сохраняться в высоких титрах в течение многих лет. Поэтому среди взрослых коров до 90% животных могут иметь вирусспецифические антитела, при отсутствии клинических признаков заболевания [74, 85].
Широкая серопозитивность КРС при отсутствии клинических признаков является характерным проявлением вирусной диареи в полевых условиях [139]. Необычным и редким проявлением болезни у КРС в естественных и экспериментальных условиях является острое течение с поражением слизистых оболочек. Причина данного явления заключена в существовании цитопатогенных и нецитопатогенных биотипов вируса ВД КРС. Как правило, инфицирование животного цитопатогенным типом вируса ВД КРС приводит к развитию клинических признаков. Нецитопатогенные штаммы вызывают персистентную инфекцию без клинического проявления, либо слабовыраженное поражение слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, а также респираторные заболевания и изредка поражения центральной нервной системы [27, 41]. Однако, инфицирование вирусом ВД КРС любого биотипа телят с иммунодефицитом, вызванным дексаметазоном, приводит к летальному исходу [183].
Цитопатогенные штаммы вируса вирусной диареи КРС
Последней стадией в жизненном цикле вируса является агрегация наработанных вирусных структурных протеинов с плюс-цепью РНК. Неизвестно, что служит сигналом для инкапсидации вирусной РНК, а также нет данных о сайтах связывания РНК с р14/С. Данные, полученные с помощью электронной микроскопии, позволяют сделать предположение, что процесс сборки вирионов происходит в ЭПР или аппарате Гольджи (АГ) [20]. В инфицированных клетках нуклеокапсидные структуры до выхода в просвет ЭПР или АГ не выявляются [169, 199]. Во время проникновения нуклеокапсида в просвет везикулы, вероятно, происходит контакт между р14/С и др53/Е2, в результате чего вирионы приобретают липидную оболочку и накапливаются в просвете везикулярных компартментов. Вирионы выходят из клетки путем экзоцитоза не ранее чем через 10 часов после инфекции.
Репликация нецитопатогенного вируса ВД КРС в культуре клеток in vitro проходит без оказания угнетающего действия на жизненные процессы клетки [87]. Попытки выяснить более тонкие изменения в клеточной физиологии также не выявили отличий между инфицированными и неинфицированными клетками [21, 53].
Развитие патологии индуцируется синтезируемым цитопатогенным вирусом ВД КРС протеином p80/NS3. В свою очередь, синтез этого протеина часто обусловлен рекомбинациями в геномной РНК вируса [73, 94, 130, 131, 132, 163]. Так, в геноме ЦП вируса ВД КРС штамма Osloss между генами, кодирующими p54/NS2 и p80/NS3, выявлена инсерция РНК, кодирующая убиквитин-подобный протеин. Также у штамма NADL в гене, кодирующем P125/NS2-3, выявлена инсерция фрагмента клеточной РНК. В некоторых случаях при развитии ЦПД в культуре клеток были выявлены дефектные интерферирующие частицы вируса ВД КРС. В их геноме отсутствовали все структурные протеины и 5 -часть гена p125/NS2-3. Дефектный вирус самостоятельно продуцироваться не способен. Для этого ему необходим вирус-хелпер. Изучение системы вирус-хелпер - дефектная частица показало, что вирус-хелпер относится к НЦП биотипу. Вирус-хелпер и дефектная частица, выделенные из одного животного, имеют очень близкое родство и названы «вирусной парой». Это позволило сделать предположение, что возникновение цитопатогенной дефектной частицы является результатом мутации долговременно персистирующего не цито патоген ного изолята вируса ВД КРС [186]. Однако существуют штаммы и изоляты, продуцирующие P80/NS3, в геноме которых отсутствуют аберрации в области кодирующей p125/NS2-3(pHC. 5).
Экспрессия p80/NS3 в инфицированных клетках коррелирует с индукцией цитопатических изменений в клетках [69, 155]. Изменения могут происходить из-за непосредственного взаимодействия p80/NS3 с макромолекулами клетки. Также p80/NS3 может ускорять репликацию вирусной РНК. Не исключено существование обоих механизмов индукции ЦПД одновременно. Постановка диагноза и оценка роли инфекции вирусом ВД КРС включают распознавание клинических признаков заболевания, идентификацию вируса и оценку результатов патологоанатомических исследований. Клинические проявления вирусной диареи описаны выше достаточно подробно, однако, стоит еще раз упомянуть коротко, какие поражения и синдромы могут быть вызваны данным вирусом: 1. Быстрое и острое течение заболевания со смертельным исходом с лихорадкой, профузной диареей и выраженными эрозиями в ротовой полости, с обширными геморрагическими поражениями; 2. Хроническое течение заболевания с персистентной диареей, с изъязвлением ротовой полости и поражением кишечника; 3. Респираторные заболевания; 4. Мумификация плодов, аборты, задержка родов, врожденные уродства и гипотрофия у потомства; 5. Хронические ламениты; 6. Инапарантное заболевание с легкой лихорадкой, слабой лейкопенией, анорексией и диареей. При эрозивных поражениях вирусную диарею необходимо дифференцировать от таких заболеваний как чума КРС, злокачественная катаральная горячка, везикулярный стоматит, инфекционный ринотрахеит, катаральная лихорадка овец, стоматиты другой этиологии, ящур. При диарейном синдроме вирусную диарею дифференцируют от сальмонеллеза, гельминтозов (особенно от астеридиоза и кокцидиоза), диарей вызванных другими вирусными патогенами (рота-, корона-, парво-, энтеровирусы), токсикоза мышьяка и дефицита молибдена [112]. В случае выявления клинических признаков заболевания, сходных с инфекцией вирусом ВД КРС, необходимо подтверждение диагноза с помощью лабораторных методов. За последние десятилетия знания о биологии пестивирусов значительно расширились, что позволило разработать более специфичные и чувствительные методы выявления вирусных протеинов, антител против них, а также генома вируса. Использование специфических МКАТ предоставило достаточно обширную информацию об антигенном разнообразии данных вирусов [22, 71, 76, 153], что также сыграло огромную роль в развитии лабораторных методов выявления пестивирусов. Нуклеотидное секвенирование полного вирусного генома стало научной базой для разработки молекулярно-биологических методов выявления, а также классификации пестивирусов [51, 62,167]. Наиболее удобным для скрининговых обследований стада является проверка молока невакцинированных коров на содержание антител к вирусу ВД КРС. Однако не все животные в стаде способны к лактации, поэтому необходимы дополнительные исследование сывороток крови. Исследования в диагностических лабораториях могут проводиться, как со сгустком, так и с гепаринизированными образцами крови. Зачастую это зависит от специфики лабораторного обеспечения, так что перед сбором материала необходимо проконсультироваться у специалистов данной лаборатории. Сыворотки проверяются на содержание, как вируса, так и антител.
Анализ первичной и вторичной структур нуклеиновых кислот
Сверху наслаивали минеральное масло. Температурный режим реакции имел следующий вид: денатурация при 94С - 30 с, отжиг праймеров 58С - 30 с, элонгация 72С - 30 с. Анализ продуктов реакции осуществляли после 25 циклов с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Наличие в геле ДНК длиной 170 п.н. свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале РНК вируса ВД КРС. Результаты электрофореза фотографировали через красный фильтр. Амллифицированные фрагменты использовали для реакции секвенирования после очистки от непрореагировавших праймеров и dNTP. Очистку продуктов реакции от не прореагировавших праймеров и dNTP проводили с помощью наборов «Magic PCR Preps DNA Purification System», либо следующим способом. Реакционную смесь с продуктами амплификации отбирали из-под масла и помещали в новую 1,5 мл пробирку. Затем добавляли 500 мкл 4 М раствора ГГЦ и инкубировали 3 мин. при комнатной температуре. После этого смесь пропускали через GF/F-фильтр и промывали 2 мл 80% изопропанола с помощью вакуумного насоса. Остатки изопропанола из фильтра удаляли центрифугированием в течении 1 мин. при 10 000 д, а затем проводили элюцию 40 мкл денонсированной воды, как описано выше. Реакцию секвенирования проводили по методу F. Sanger [179] с помощью набора «fmol DNA Cycle Sequencing System» согласно инструкции с праймерами HCV10 и PV2. Пробирки с реакционной смесью помещали в предварительно прогретый до 94С амплификатор и начинали программу циклов. Температурный режим реакции состоял из денатурации (94С в течение 30 с), отжига праймеров (58С - 30 с) и элонгации (72С - 1 мин.). Реакцию останавливали после 15 циклов, добавляя в реакционную смесь 3 мкл стоп-раствора. Продукты реакции секвенирования разделяли электрофорезом в 5% ПААГе. Непосредственно перед электрофорезом прогревали реакционную смесь в течение 2 мин. при 72С. В лунки геля вносили по 1,0-1,5 мкл каждой пробы. После окончания электрофореза, гель отмывали от мочевины с помощью 10% раствора уксусной кислоты в течение 30 мин., сушили в сухожарном шкафу при 120С и закладывали на радиоавтографию на 16-18 ч.
Для анализа установленных нуклеотидных последовательностей использовали пакет прикладных программ «BioEdit», версия 5.0.6. (Т. Hall, North Carolina State University, Department of Microbiology, 2001 г.). Для графического построения дендрограмм применяли программу «TreeView», версии 1.5.2. (D.M. Roderic, 1998). Анализ предполагаемых вторичных структур проводили с помощью пакета прикладных программ PCGENE версии 5.15. (A. Bairoch, University of Geneva, 1988 г.). Расчет значений AG для самокомплементарных фрагментов нуклеотидной последовательности проводили по методу М. Zuker [236]. ВД впервые зарегистрировали на территории СССР и описали в 1967 г. К.Н. Бучнев с соавт. [1]. После этого данное заболевание периодически регистрировалось в нашей стране, что отмечено в ежегодном бюллетене Международного Эпизоотического Бюро (МЭБ). Борьба с данным заболеванием осуществляется с помощью специфической профилактики поголовья, а также противоэпизоотическими мероприятиями.
На данный момент разработано большое количество методов выявления возбудителя данного заболевания - вируса ВД КРС, позволяющих выявлять как вирусные антигены, так и антитела против них. Одним из перспективных методов выявления вируса ВД КРС является полимеразная цепная реакция, получившая широкое распространение в клинической диагностике вирусных заболеваний [19]. ПЦР превосходит на несколько порядков современные иммунологические тесты по чувствительности и специфичности, а также позволяет работать с исходным материалом без предварительного выделения вируса в культуре клеток. Секвенирование амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома является надежным методом штаммовой дифференциации и позволяет с максимальной точностью определять изменения, происходящие на уровне генома.
Целью нашей работы было разработать метод выявления и штаммовой дифференциации вируса ВД КРС на основе ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК. В связи с поставленной целью необходимо было решить многие вопросы, направленные на выбор фрагмента генома вируса ВД КРС, анализ первичной структуры которого способен обеспечить достаточно полную информацию для дифференциации штаммов; на выявление консервативных участков для гибридизации с праймерами, и оптимизировать пары праймеров для выявления и дифференциации штаммов и изолятов вируса ВД КРС; на оптимизацию ПЦР для выявления вируса ВД КРС; на изучение возможности применения разработанного метода для выявления вируса ВД КРС в различных вируссодержащих материалах; на оптимизацию условий секвенирования амплифицированных фрагментов; кроме того, необходимо было определить и провести сравнительный анализ первичных структур исследуемого фрагмента генома полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ВД КРС и создать базу данных, включающую последовательности российских и зарубежных полевых и вакцинных штаммов вируса ВД КРС, для последующего анализа и определения штаммовой принадлежности вновь выявленных изолятов. На решении поставленных задач были сосредоточены наши исследования.
Анализ профиля вариабельности 5'-нетранслируемой области генома вируса вирусной диареи КРС
Анализ ряда научных работ, посвященных изучению молекулярно-биологических свойств вируса ВД КРС, показал, что для выявления генома данного вируса чаще используется 5 -НТО. Консервативные участки в данной области позволяют подобрать универсальные праймеры, универсальные для широкого спектра штаммов и изолятов как первого, так и второго генотипа вируса ВД КРС. Также было показано, что посредством сравнительного анализа первичной структуры данного фрагмента можно определять генотип изолята и проводить штаммовую дифференциацию.
С помощью программы «Align» нами было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей семи штаммов вируса ВД КРС, имеющихся в базе данных Европейского Биоинформационного Института (EMBL). (Табл.4)
На основе выравнивания последовательностей с использованием программы "SQMAX" был построен профиль вариабельности 5 -НТО генома вируса (рис.6). Профиль вариабельности был получен последовательным сравнением (с шагом 1 нуклеотид) фрагментов 5 -НТО длиной 25 н. Сравнение участков такого размера наглядно представляет характер изменения вариабельности на протяжении всего данного фрагмента генома. Вариабельность в данном случае выражена как процент нуклеотидов в пределах каждого фрагмента, несовпадающих с усредненной (консенсусной) нуклеотиднои последовательностью, независимо от того, сколько штаммов имеют нуклеотидные замены в этих позициях.
Анализ профиля вариабельности 5 -НТО показал, что при пошаговом сравнении фрагментов длиною в 25 н., вариабельность варьирует в достаточно широких пределах, что выражается на графике резкими подъемами с вершинами от 40% до 80%, и, также, резкими спадами до 10% и ниже. Таким образом, график наглядно представляет положение вариабельных и консервативных участков в данной области генома. Применение пошагового сравнения в 25 н. при составлении профиля вариабельности, позволяет выявлять места наиболее подходящие для посадки праймеров на матрицу, поскольку их длина обычно варьирует в пределах 20-30 н. Как видно из рисунка, число фрагментов, характеризующихся минимальной степенью вариабельности и теоретически применимых в качестве мест посадки праймеров ограничено. Кроме того, более детальный анализ с помощью программы «Oligo» показал, что не все косервативные фрагменты соответствуют требованиям, предъявляемым к участкам гибридизации с праймерами. Так на участке с 87 по 126 н. фрагменты имеют достаточно низкую вариабельность в пределах от 10% до 30%, однако дальнейший анализ показал, что данный участок содержит самокомплементарные последовательности. Вследствие этого праимеры на данную область способны к димеризации либо образованию вторичных структур, мешающих взаимодействию с матрицей. Таким образом, в 5 -НТО можно выделить только 4 потенциальных места посадки праимеров. По-видимому, этот факт объясняет то, что в работах зарубежных авторов праимеры для амплификации 5-НТО располагаются на аналогичных позициях с некоторыми отличиями.
Для амплификации 5 -НТО генома вируса ВД КРС был выбран ряд праимеров, описанных в работах J.B.Katz и J.F.Ridpath (рис.7) [113, 166]. Из этой группы олигонуклеотидов предполагалось подобрать праимеры, наиболее эффективные для амплификации фрагмента 5 -НТО генома вируса ВД КРС, поскольку методы, предложенные данными авторами, на наш взгляд, не оптимальны для выявления генома данного вируса в патологическом материале. Так, в работе J.F. Ridpath с помощью первой пары праимеров (BD1, BD4) амплифицируется фрагмент генома вируса ВД КРС длиной около 150 п.н., а вторая реакция с праймерами BD2 и BD3 применяется для выявления только второго генотипа. Такая схема не позволила бы выявлять геном вируса ВД КРС генотипа 1 непосредственно в полевом материале без предварительного выделения вируса в культуре клеток, т.к. в патологическом материале данный вирус, как правило, находится в малых титрах, и для его выявления часто необходимо проведение Nested-ПЦР. К тому же при выявлении генотипа 2 амплифицируется фрагмент величиной около 100 п.н., что может вызвать затруднение при визуальном наблюдении результата реакции на электрофоре грамме, поскольку часто в смеси находятся неспецифические продукты реакции, образующие пул на уровне 70-100 п.н.
В методе выявления генома всех пестивирусов, предложенном J.B. Katz с соавт. [113], вследствие универсализации праймеров для всех представителей рода пестивирусов, может сузиться спектр выявляемых штаммов и изолятов вируса ВД КРС. На это указывало то, что 2 крайних нуклеотида З -конца праймера HCV11 некомплементарны нукпеотидной последовательности 5-НТО вируса ВД КРС (рис. 8). Следует отметить, что специфичность к матрице З -конца праймера имеет критическое значение при функционировании праймера, т.к. именно с него начинает достраиваться новая цепь. Также, ряд несовпадений с консенсусной последовательностью для вируса ВД КРС имеет праймер HCV9. Вследствие этого, на участки, аналогичные праймерам HCV9 и HCV11, были дополнительно рассчитаны 2 праймера PV1 и PV2, соответственно. Так как по литературным данным известны случаи только экспериментального заражения КРС вирусом КЧС [57, 123, 185], и вследствие этого не возникает проблемы дифференциации данных вирусов при исследовании полевого материала от КРС, поэтому новые праймеры рассчитывались для взаимодействия только с 5-НТО генома вируса ВД КРС первого и второго генотипов.
Для расчета более специфичных праимеров был проведен сравнительный анализ 5 -НТО 80-ти штаммов и изолятов вируса ВД КРС, как первого, так и второго генотипа. На основе полученных данных рассчитали первичную структуру новых праимеров (PV1 и PV2) в соответствии с требованиями, указанными в главе 3.2.1. Данные праймеры не содержали критических отличий от консенсусной последовательности вируса ВД КРС. Таким образом, для эксперимента были подобраны 4 пары праимеров для первой амплификации и две - для nested-ПЦР. Праймеры BD2 и BD3 не использовались в эксперименте, поскольку с их помощью амплифицируется слишком короткий фрагмент, и данная пара имеет выраженную специфичность ко второму генотипу. Праймеры BD1 и HCV10 полностью соответствовали друг другу и в дальнейшем использовались под одним обозначением - HCV10. Для подбора наиболее эффективных пар праимеров применяли изолят МДБК/ВНИИЗЖ/06.00, который является персистентным контаминантом культуры клеток МДБК.
