Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Структура вируса кори и функциональная активность вирусных белков 10.
ГЛАВА 2. Геном вируса кори и генотипирование диких штаммов коревого вируса 22.
ГЛАВА 3. Географическое распространение штаммов вируса кори разных генотипов 37.
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 46.
ГЛАВА 5. Подбор праймеров и условий для проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции 60.
ГЛАВА 6. Анализ нуклеотидной последовательности СООН-концевого участка N-гена штаммов вируса кори, изолированных на территории России 66.
ГЛАВА 7. Анализ нуклеотидной последовательности полноразмерного Н-гена штаммов вируса кори, изолированных на территории России 89.
Обсуждение 97.
Выводы 110.
Список литературы 113.
Приложение 133.
- Геном вируса кори и генотипирование диких штаммов коревого вируса
- Подбор праймеров и условий для проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции
- Анализ нуклеотидной последовательности СООН-концевого участка N-гена штаммов вируса кори, изолированных на территории России
- Анализ нуклеотидной последовательности полноразмерного Н-гена штаммов вируса кори, изолированных на территории России
Введение к работе
До настоящего времени среди инфекционных болезней человека значительное место занимает корь. Это заболевание имеет огромное социально-экономическое значение на протяжении всей истории цивилизации. Повсеместное распространение этой инфекции с периодическими эпидемическими подъемами, высокая восприимчивость к ней человека ставят корь в ряд тех болезней, которые наносят значительный урон здоровью населения.
Реальная возможность борьбы с корью появилась в 1954 году, когда J. Enders и Т. Peebls (75) получили первый штамм вируса кори, ставший родоначальником многих вакцинных и диагностических препаратов. Со времени создания эффективных вакцин против кори, это заболевание стало контролируемым в некоторых странах мира (43,125), но, тем не менее, несмотря на явные успехи в борьбе с корью, достигнутые с помощью вакцинации, корь остается серьезной проблемой для многих стран.
Впервые вопрос о ликвидации кори встал в 1975 году, когда специалистами ВОЗ была разработана Расширенная Программа Иммунизации (РПИ), результатом которой, в частности, стало сокращение числа случаев кори на территориях, включившихся в выполнение РПИ. Позднее в 1991 году Панамериканская конференция выдвинула задачу элиминации кори на американском континенте к 2000 году. Результатом усилий, предпринимаемых для достижения поставленной задачи, явилось искоренение кори в Америке, где с 2000 года не было зарегистрировано ни одного случая этого заболевания, вызванного эндемичными штаммами вируса кори (19,43).
4 Та же стратегия намечена в программе Всемирной Организации
Здравоохранения «Здоровье для всех», провозгласившей в 1998 году в качестве
одной из основных задач XXI века - глобальную ликвидацию кори к 2010 - 2020
гг. При этом Восточно-Средиземноморский и Европейский регионы должны
сертифицировать элиминацию кори в 2007-2010 гг. (8).
Наличие в России высокоэффективной живой коревой вакцины позволило разработать Национальную программу ликвидации кори, утвержденную Приказом Минздрава России от 19.08.2002 года № 270. Одним из важных пунктов программы является подробная молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса кори с целью слежения за их циркуляцией среди населения на более современном уровне, так как молекулярно-генетические методы позволяют проводить оценку эпидемиологических связей между выделяемыми штаммами вируса кори и изучать пути их трансмиссии.
В мировом плане, изучение вируса кори на молекулярно - генетическом уровне позволило выявить существование различных генетических групп коревого вируса и соотнести эти группы с ареалами распространения, что дало возможность классифицировать все получаемые изоляты вируса кори. Это явилось предпосылкой для создания стандартной номенклатуры описания генетической характеристики диких штаммов вируса кори и его генотипирования. В 1998 г. все известные штаммы вируса кори были подразделены на 15 генотипов, которые объединены в 8 групп:А, В, С, D, Е, F, G, Н (151). Генотипы различаются по количеству нуклеотидных замен на участке генома коревого вируса, состоящего из 450 нуклеотидов, кодирующих СООН - конец N-белка.
5 К 2001 году, с момента первой публикации стандартной номенклатуры,
применяемой для классификации диких штаммов вируса кори (1998), количество
охарактеризованных и изученных генотипов возросло с 15 до 22, что
свидетельствует не только о расширении регионов изучения, но и о постоянном
накоплении мутаций в геноме коревого вируса (152, 153).
Анализ данных литературы демонстрирует усилившееся в последние годы внимание исследователей к характеристике диких штаммов вируса кори, циркулирующих в настоящее время в разных географических регионах. При этом авторы преследуют несколько целей: во-первых, осуществление наблюдения за изменчивостью вируса кори и определение ее эпидемиологической значимости; во-вторых, генотипирование вируса кори, определение местных и завозных случаев кори и прерывание трансмиссии эндемичных штаммов коревого вируса для контроля выполнения программы элиминации кори на данных территориях.
Необходимо заметить, что если за рубежом такие исследования уже вошли в повседневную практику, то в России имеются только разрозненные данные о генотипах диких штаммах вируса кори, циркулирующих на территории Российской Федерации, тогда как только постоянное наблюдение за всеми изменениями вирусного генома на определенной территории в течение длительного времени позволяет документировать прерывание трансмиссии эндемичного генотипа вируса кори на данной территории и является одним из основных методов оценки эффективности выполнения программы элиминации кори.
В связи с изложенным ЦЕЛЬЮ настоящей работы явилась молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса кори, циркулирующих среди населения на территории Российской Федерации.
В соответствии с поставленной целью в ЗАДАЧИ исследования входило:
Подбор праймеров и отработка условий проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.
Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности СООН-концевого участка N-гена и полноразмерного Н-гена разных штаммов вируса кори.
Определение генотипов штаммов вируса кори, циркулирующих на территории России в разные годы вакцинопрофиоактики.
Многоплановость исследований потребовала при выполнении работы комплекса с различными специалистами. В этой связи в диссертации нашли отражения результаты работ, проведенных совместно с вирусологами и эпидемиологами ГУ «МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского» МЗ РФ; с сотрудниками лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций Всероссийского Научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН; с сотрудниками Measles Virus Section, Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:
Впервые проведен анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности СООН - концевого участка N-гена 21 штамма вируса кори и полноразмерного Н-гена 5 штаммов вируса кори, выделенных на территории Российской Федерации в период с 1988 по 2003 годы. Установлено, что в настоящее время наблюдается изменение генотипической картины штаммов вируса кори, циркулирующих на
7 территории России. Если в 80-е годы на данной территории циркулировали
штаммы генотипа А, который являлся эндемичным для России в довакцинальный
период, то в последнее время циркуляция данного генотипа не зафиксирована. В
настоящее время на территории Российской Федерации наиболее постоянной
циркуляцией отличается вирус кори, принадлежащий к генотипу D4, который и
является эндемичным для России в данный момент.
Выявлено, что для вируса кори, циркулирующего на территории России
характерно ежегодное увеличение количества мутаций, как на нуклеотидном, так и
на аминокислотном уровне, что свидетельствует о необходимости постоянного
слежения за изменчивостью вируса кори.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ заключается в создании на основе разработанных специфических праймеров для СООН-концевого участка N-гена вируса кори и определении оптимальных условий проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции "Набора реагентов для выделения РНК и диагностики вируса кори методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в одной пробирке" (ДВК-ПЦР) в соответствии с п.3.6. ГОСТ Р15.013-94. Проект технических условий данного набора был представлен и рассмотрен на заседании комиссии по РИА - и ИФА-наборам Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ 20.10.2002 года.
8 МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ НАШЛИ ОТРАЖЕНИЕ:
В депонировании одного из изученных штаммов вируса кори
MVi/Moscow.Rus/05.99[D4] в Государственную коллекцию вирусов (ГУ
«НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН», Москва, Россия).
Данному штамму присвоен номер ГКВ № 2360.
В депонировании 11-ти изученных штаммов вируса кори,
циркулирующих на территории Российской Федерации, в
Международную коллекцию штаммов (CDC, Atlanta, США) и передачи
нуклеотидных последовательностей данных штаммов в Genebank (NCBI,
Bethesda, США).
НА ЗАЩИТУ ДИССЕРТАЦИИ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ
ПОЛОЖЕНИЯ:
С помощью реакции обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции и секвенирования установлено, что на территории России в период с 1988 по 2003 годы циркулировали штаммы вируса кори четырех генотипов: A, D4, D6 и HI.
В течение последних 15 лет на территории России произошли изменения в генотипическом пейзаже штаммов вируса кори. Циркуляция штаммов генотипа А, эндемичного для России в довакцинальный период, в последние годы не зафиксирована. Наиболее постоянной циркуляцией отличается вирус кори, принадлежащий к генотипу D4, который и является эндемичным для России в настоящее время.
9 3. Для штаммов вируса кори генотипа D4, выделенных на территории
Российской Федерации характерно интенсивное ежегодное накопление
мутаций на нуклеотидном и аминокислотном уровне, что свидетельствует
о важности постоянного слежения за дикими штаммами вируса кори с
помощью методов молекулярной эпидемиологии.
Геном вируса кори и генотипирование диких штаммов коревого вируса
В работе Santibanez S. с соавт. (132) был охарактеризован изолят Nov/97 из Сибири, полученный в 1997 году сотрудниками НИИ молекулярной биологии «Вектор». Анализ 285 нуклеотидов СООН-конца N-гена показал, что данный изолят относится к генотипу D6. Это был первый зафиксированный случай кори в России, вызванный представителем группы D. В материалах VIII Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2002) было опубликовано краткое сообщение о результатах изучения нуклеотидных последовательностей СООН-концевой части N-гена и полной последовательности Н-гена 15 коревых изолятов, выделенных в европейской части России в 2000-2001 гг. (15). Все изоляты были охарактеризованы как генотип D4. К сожалению, проанализированный в данной работе участок СООН-концевой части N-гена несколько короче участка, требуемого для генотипирования, что значительно затрудняет использование полученных результатов при сравнительном анализе штаммов, изолируемых на территории России. Анализ данных литературы показал, что геном вируса кори кодирует информацию о 8 структурных белках, три из которых (Н, F и М) связаны с оболочкой вириона коревого вируса, а три (L, Р и N) связаны с нуклеокапсидом.
Детальное изучение строения и функций вирусных белков показало существование у вируса кори выраженных антигенно-генетических мутаций, особенно в N и Н белках. Это диктует необходимость дальнейшего наблюдения за изменчивостью вируса кори. Анализ данных литературы свидетельствует об усилившемся в последние годы внимании исследователей к характеристике диких штаммов вируса кори, циркулирующих в настоящее время в разных географических регионах. При этом авторы преследуют несколько целей: во-первых, осуществление наблюдения за изменчивостью вируса кори и определения ее эпидемиологической значимости; во-вторых, генотипирование вируса кори, определение местных и завозных случаев кори и прерывание трансмиссии местных штаммов коревого вируса для контроля за выполнением программы элиминации кори на данных территориях. Нетрудно заметить, что если за рубежом такие исследования уже вошли в повседневную практику, то в России имеются только разрозненные данные о диких штаммах вируса кори, циркулирующих на территории Российской Федерации. Принятая Всемирной организацией здравоохранения программа глобальной элиминации кори и Национальная программа ликвидации кори к 2010 году на территории Российской Федерации (Приказ Минздрава России от 19.08.2002 года № 270), требуют подробной молекулярно-генетической характеристики штаммов вируса кори, циркулирующих на территории России, с целью слежения за их циркуляцией среди населения.
Таким образом, анализ данных литературы дал возможность сформулировать основную задачу данной работы: изучить и генотипировать штаммы вируса кори, изолированные на территории России в разные годы массовой вакцинопрофилактики. Выделение изолятов вируса кори из инфекционного материала проводили на базе лаборатории прикладной иммунохимии Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского. Материалом для выделения вируса служили: взвесь мононуклеарных клеток, полученная из гепаринизированной венозной крови больных корью, плазма и сыворотка крови. Венозную кровь собирали в стерильных условиях в пробирки с гепарином (5 мл + 0,2 мл гепарина). Взятые образцы доставлялись в лабораторию для выделения вируса. При выделении фракции моноцитов из гепаринизированной крови в пробирку с кровью добавляли желатин из расчета 1 мл 10% желатина на 5 мл крови. Полученную смесь тщательно перемешивали. Затем пробирку помещали в термостат фирмы Jouan (Франция) на 40 минут при температуре 37С. По истечении данного времени жидкость, образовавшуюся над осадком, отсасывали в центрифужную пробирку, добавляли 5 мл среды RPMI-1640 и центрифугировали в центрифуге с качающимся ротором фирмы Jouan (Франция) при 1000 об/мин. в течение 10 минут. Затем аккуратно отсасывали среду и клеточную взвесь суспендировали в небольшом объеме питательной среды. Изоляты вируса кори культивировали на перевиваемых культурах клеток В-95а и Vero. Культуры клеток выращивали в среде RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (BioClot (Pty)Ltd, Германия) при температуре 37С. Инфицирование клеточных культур вирусом кори осуществляли путем внесения вируса непосредственно в питательную среду. Все манипуляции по получению вируссодержащей жидкости проводили в строго стерильных условиях, в ламинаре II степени защиты SterilCARD III фирмы The Baker Company (США). Всего исследованы 21 штамм вируса кори, полученные от больных в период с 1988 по 2003 годы (табл.4). Определение генотипов данных штаммов проводили на базе двух лабораторий - на базе лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций Всероссийского Научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии, РАСХН и на базе Measles Virus Section, Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Атланта, США.
Подбор праймеров и условий для проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции
Изучение генотипов вируса кори, проводимое в рамках данной работы, потребовало, прежде всего, адаптации известных методов анализа нуклеотидных последовательностей для использования их в России. Подбор оригинальных праймеров для СООН-концевого участка N-гена вируса кори проводили на базе лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций Всероссийского Научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии, РАСХН.
Участок был выбран в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения для молекулярно-генетической характеристики штаммов вируса кори и их генотипирования(151, 152, 153). Для получения необходимого фрагмента были разработаны оригинальные праймеры MV-R1 и MV-F2; Me-N-Rl и Me-N-Fl, фланкирующие 685 и 545 нуклеотидов (соответственно) С-концевого участка гена нуклеопротеина. Для подбора праймеров использовали нуклеотидную последовательность С-концевого участка N-гена справочно-эталонного штамма вируса кори "Эдмонстон" (MEV, strain Edmonston, genotype А), полученную из GenBank (accession number AF266288). Как известно, успешное прохождение реакции и получение желаемого продукта обуславливают нуклеотидная последовательность и концентрация праймеров (6). Анализ данных литературы (6, 22, 61) позволил сформулировать следующие характеристики, которым должна отвечать нуклеотидная последовательность праймеров: Отсутствие внутренних вторичных структур Сбалансированное сочетание G/C - и А/Т - обогащенных доменов Отсутствие комплементарности между 3 -концами (для того, что бы ни образовывались димеры праймеров) Специфичность созданных в соответствие с изложенными выше требованиями праймеров MV-R1 и MV-F2 проверяли с помощью программы BLAST. Как показали исследования, разработанные праймеры не реагировали ни с близкородственным вирусами, ни с вирусом краснухи, вызывающим клиническую картину, схожую с корью. Данный факт подтверждали экспериментально, при анализе панели гетерологичных вирусов (рис. 6).
Для проверки специфичности праймеров были использованы вирусы, имеющие близкое антигенное и генетическое родство с вирусом кори - вирус чумы собак (штаммы "ВНИИВВиМ-88" и "Snayder Hill"), чумы крупного рогатого скота (штамм "ЛТ") и чумы мелких жвачных (штамм "45g35"). Кроме того, были использованы вирус полиомиелита (штамм "Sabin") и вирус краснухи (штамм "Rubella"). Следует подчеркнуть, что РНК использованных вирусов были выделены из действующих вакцин и показали положительные результаты в реакциях со специфичными к данным вирусам праимерами.
Специфичная амплификация с разработанными праимерами MV-R1 и MV-F2 отмечалась только при наличии в пробе РНК вируса кори (дорожки 1 и 2). РНК других вирусов не реагировали с коревыми праимерами и давали отрицательный результат в предложенном тесте (дорожки 3-6 Рис.6. Проверка специфичности разработанных праймеров 1- реакция с вирусом кори, штамм «Эдмонстон»; 2- реакция с вирусом кори, выделенным из живой коревой вакцины (ЖКВ); 3- реакция с вирусом чумы собак. штамм "ВНИИВВиМ-88"; 4- реакция с вирусом чумы мелких жвачных, штамм 45g35"; 5- реакция с вирусом краснухи, штамм "Rubella"; 6- реакция с вирусом полиомиелита, штамм і» Sabin". При анализе литературы было установлено, что для повышения специфичности метода, а так же для увеличения концентрации продукта можно проводить полимеразную цепную реакцию с внутренними праймерами (6). В связи с этим, в рамках данной работы были разработаны внутренние праймеры Me-N-Rl и Me-N F1, в реакции с которыми получали фрагмент длиной 545 нуклеотидов. Использование праймеров Me-N-Rl и Me-N-Fl позволило так же несколько сократить длину фрагмента, получаемого в реакции с основными праймерами, что связано с особенностями технического оснащения, используемого для секвенирования.
Анализ нуклеотидной последовательности СООН-концевого участка N-гена штаммов вируса кори, изолированных на территории России
Метод ПЦР зарекомендовал себя как высоко чувствительный и специфичный. Его применение позволяет проводить широкие скрининговые исследования в кратчайшие сроки. С помощью метода ПЦР вирус кори обнаруживается не только в мазках из зева, в сыворотке крови, но и в мозговой ткани, почечных, селезеночных и легочных тканях (61,71, 119). В рамках программы ВОЗ по глобальной ликвидации кори необходимо проведение генотипирования коревых изолятов на основании анализа определенных участков вирусной РНК, а именно С - концевой области гена нуклеопротеина (N-гена) размером 450 нуклеотидов, используемого для паспортизации штаммов (изолятов) (150, 151, 152). Предложенная нами схема проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, обладает высокой чувствительностью и специфичностью, а получаемые продукты реакции могут быть использованы для изучения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей вирусных изолятов. Для анализа нуклеотидной последовательности использовали 1-3-е пассажи штаммов вируса кори, культивируемых на клетках В-95а. Выделение вирусной РНК проводили по методу P. Chomczynski (67), описанному в главе «Материалы и методы», и с помощью, разработанного на основе метода P. Chomczynski, набора препаратов для выделения РНК из плазмы и сыворотки крови «RNA-ExtraPhen». Полученную РНК использовали в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для амплификации необходимого фрагмента.
При использовании обеих методик для выделения РНК непосредственно из клеточной культуры, инфицированной вирусом кори и имеющей выраженный цитопатогенный эффект, выход продукта был очень высоким. При этом оценка количества полученного материала проводилась визуально при электрофоретическом разделении в агарозном геле, при использовании 5 мкл продукта. Если полученная полоска была четкая и легко видимая, то для реакции обратной транскрипции использовали 3 мкл водного раствора РНК, так как использование большего количества сильно концентрированного раствора РНК приводило к ингибированию реакции. При использовании для выделения РНК вируссодержащей жидкости, которая хранилась в течение длительного времени при температуре не ниже -20С, выход продукта был значительно ниже, что также определяли с помощью электрофореза. В этом случае для реакции амплификации использовали большее количество выделенной РНК - 5 мкл матрицы. Важно отметить, что при транспортировке при комнатной температуре в течение суток вируссодержащеи жидкости для выделения РНК, а также уже выделенной и очищенной (на базе лаборатории ВНИИ биотехнологии растений) РНК, количество РНК значительно уменьшилось, а в некоторых случаях РНК разрушилась полностью. Эти данные еще раз подтвердили, что вирусная РНК очень лабильна и требует строго соблюдения температуры при ее хранении и транспортировке.
Вируссодержащую жидкость необходимо хранить при температуре не ниже -20С, тогда как выделенную и очищенную РНК необходимо хранить только при температуре -70С, а транспортировать в сухом льду. Для работы и хранения кДНК, полученной в процессе амплификации, низкие температуры не требуются, кДНК хранится при температуре +4С, что значительно упрощает работу. Известно, что очистка кДНК из реакционной смеси с помощью фенола и хлороформа является очень эффективной методикой. Количество кДНК при применении этой методики практически не уменьшается, а количество примесных белков сокращается настолько, что кДНК можно использовать для реакции секвенирования, для которой необходима высокая степень чистоты продукта. Неудобство при работе с фенолом и хлороформом заключается в необходимости соблюдения определенных правил работы в вытяжных шкафах. В связи с этим, применение специальных наборов реактивов для очистки кДНК, как, например комплекта Promega Wizard PCR (Promega, США), который был использован в данной работе, значительно облегчает работу и не требует никакого специального оборудование. Хотя следует отметить, что в этом случае, при применении готовых наборов, стоимость данного этапа значительно возрастает.
Анализ нуклеотидной последовательности полноразмерного Н-гена штаммов вируса кори, изолированных на территории России
Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей Н гена выборки штаммов вируса кори, изолированных на территории России подтвердили принадлежность этих штаммов к генотипам, определенным при анализе нуклеотидных последовательностей СООН-концевой части N-гена. Так, из 11 штаммов, отнесенных к генотипу D4, анализ нуклеотидной последовательности Н-гена был проведен для трех штаммов: MVi/Astrakhan.RUS/12.03/1, MVi/Astrakhan.RUS/12.03/2 и MVi/Moscow.RUS/13.03/1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей Н-гена данных штаммов и справочно-эталонного штамма генотипа D4 показал, что штаммы вируса кори, изолированные на территории России отличаются от справочно-эталонного штамма в среднем на 1,77%, что полностью подтверждает их принадлежность к данному генотипу (приложение 6). При этом российские штаммы имеют 32 общие нуклеотидные замены, что, так же как и при анализе СООН-конца N-гена, объединяет их в одну группу. Отличие штамма, изолированного на территории Москвы от штаммов, изолированных на территории Астрахани составили всего 0,1% , в то время как анализ нуклеотидной последовательности Н-гена штаммов, изолированных на территории Астрахани, так же, как и анализ нуклеотидной последовательности СООН-концевой части N-гена, показал, что данные штаммы полностью идентичны между собой. Трансляция полученной нуклеотидной последовательности с помощью программы DNAsis и сравнение аминокислотной последовательности Н-белка штаммов, изолированных на территории России с аминокислотной последовательностью справочно-эталонного штамма генотипа D4, показало, что на аминокислотном уровне российские штаммы отличаются от штамма Montreal.CAN89 [D4] в среднем на 0,97%. Между собой, московский и астраханские штаммы различаются на аминокислотном уровне на 0,32%. Из 32 общих нуклеотидных замен, характерных для штаммов генотипа D4, изолированных на территории России, только 5 приводят к заменам на аминокислотном уровне (приложение 7). Так, нуклеотидная замена в триплете в позиции 839 (GTC-GCC) привела к аминокислотной замене в позиции 280 (V-A).
Обе аминокислоты, валин и аланин, являются алифатическими неполярными аминокислотами, т.е. данная замена произошла между аминокислотами одной химической группы с одинаковыми химическими свойствами. Нуклеотидная замена в позиции 913 (TCT-GCT) привела к аминокислотной замене в позиции 304 (S-A). Серии относится к гидроксилсодержащей группе аминокислот, и является полярной незаряженной аминокислотой. Таким образом, данная замена произошла между аминокислотами разных групп, и с разными химическими свойствами, что может отразиться на функциональных особенностях белка. Замена нуклеотидов в позиции 1044 (AGG-AAG) привела к замене в позиции 348 полярной гидрофильной аминокислоты аргинин, относящейся к группе основных кислот, на аминокислоту лизин, которая также является основной аминокислотой, и обладает теми же химическими свойствами. Изменение триплета в позиции 1267 (СТТ-ТТТ) привело к замещению алифатической аминокислоты лейцина, на ароматическую аминокислоту фенилаланин в позиции 423. Несмотря на то, что данные аминокислоты относятся к разным группам, они обе являются неполярными гидрофобными аминокислотами. Нуклеотидная мутация в триплете (GGC-AGC) в позиции 1636 вызвала замену аминокислоты глицина в позиции 545 на аминокислоту серии.
Глицин относится к группе алифатических аминокислот, но, так же как. и серии, является полярной незаряженной аминокислотой. Таким образом, практически все изменения аминокислотной последовательности Н-белка штаммов MVi/Astrakhan.RUS/12.03/1, MVi/Astrakhan.RUS/12.03/2 и MVi/Moscow.RUS/13.03/1, происходят между аминокислотами либо одной группы, либо с одинаковыми химическими свойствами и, скорее всего, не влияют на функциональные и биологические свойства белка. Из двух штаммов генотипа D6, изолированных на территории России, анализ нуклеотидной последовательности Н-гена был проведен для штамма MVi/Dagestan.RUS/20.03 [D6]. Отличия данного штамма от справочно-эталонного штамма генотипа D6 на нуклеотидном уровне составило 1,18%, на аминокислотном - 1,29%, что полностью подтверждает принадлежность штамма MVi/Dagestan.RUS/20.03[D6], изолированного на территории Дагестана, к генотипу D6 (приложение 6).
