Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 9
1. Общая характеристика поксвирусов 9
2. Репликативный цикл ортопоксвирусов 10
3. Морфофункциональные изменения в зараженных ортоиоксвирусами клетках 22
4. Особенности взаимодействия ортопоксвирусов с клетками in vitro 25
5. Репликация ортопоксвирусов на хорион-аллаитоисной оболочке и в печени куриных эмбрионов (in ovo) 27
6. Характеристика поксвирусной инфекции у животных и человека 31
7. Особенности инфекции, вызываемой вирусом оспы коров, у людей и животных 36
8. Особенности течения инфекции, вызываемой вирусом оспы коров, у мышей 41
III. Материалы и методы 47
1. Материалы 47
2. Заражение клеточных культур 48
3. Заражение куриных эмбрионов 48
4. Заражение мышей 49
5. Определение биологической концентрации вируса в органах и тканях инфицированных мышей 51
6. Светооптичсские исследования 52
7. Электронно-микроскопические исследования 56
IV. Результаты и обсуждение 59
1. Ультраструктурные параметры репликации штамма ЕР-2 ВОК 59
2 Особенности репликации штамма ЕР-2 ВОК в клеточных культурах 64
3 Особенности инфекции штамма ЕР-2 ВОК на ХАО КЭ 66
4 Особенности репликации штамма ЕР-2 ВОК в органах куриных эмбрионов 73
5 Исследование инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 ВОК и штаммом К-1 вируса эктромелии при интраперитонеалыюм заражении мышей 76
5.1. Светооптическое изучение органов мышей 78
5.2. Ультраструктурное изучение органов мышей 83
Заключение 94
Выводы 97
Приложение 99
Список использованной литературы 155
- Репликативный цикл ортопоксвирусов
- Особенности инфекции, вызываемой вирусом оспы коров, у людей и животных
- Заражение куриных эмбрионов
- Особенности инфекции штамма ЕР-2 ВОК на ХАО КЭ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из наиболее значимых проблем вирусологии является исследование биологических свойств возбудителей неизвестных и вновь возникающих инфекций, в том числе новых природных изолятов известных вирусов. К разряду таких инфекций относятся и ортопокс вирусные. Опасность заражения людей ортопокс вирусам и сохраняется по сей день, несмотря на то, что в 1980 году Всемирная Организация Здравоохранения подписала свидетельство о глобальной ликвидации натуральной оспы на земном шаре. Периодически публикуются сообщения о вспышках заболеваний у людей, вызванных вирусами осповакцины, оспы обезьян, оспы буйволов и оспы коров в различных странах (Онищенко и др., 2001; Damaso et ai., 2000; Маренникова и Щелкунов, 1998; Baxby et al., 1994). Вирус натуральной оспы, представитель рода Ортопоксвирусов, рассматривается зарубежными и отечественными экспертами в качестве одного из наиболее вероятных объектов применения в биотеррористических акциях (Онищенко и др., 2000; Henderson, 1999). Существование природного резервуара вируса оспы коров в популяциях диких грызунов и прекращение оспопрививания обуславливают рост количества заболеваний оспой коров, особенно среди не прошедшего вакцинацию населения. Опубликованные данные свидетельствуют, что чаще всего люди заражаются от кошек и диких грызунов (Stewart et al., 2000; Hawranek et al., 2003; Schupp et al., 2001; Lawn et al., 2003; Feuerstein et al., 2000).
Вирус оспы коров у человека обычно вызывает местное поражение покровных тканей с благоприятным прогнозом и выздоровлением (Stolz et al., 1996; Lawn et al., 2003; Schupp et al., 2001), однако возможны осложнения (Маренникова и Щелкунов, 1998; Baxby et al, 1994), особенно у невакцинированных и людей с подавленным иммунитетом. Потенциально наиболее опасными для человека являются природные малоизученные и неизученные изоляты вируса оспы коров (ВОК). Между тем, биологические свойства природных изолятов изучены недостаточно, публикации, посвященные их исследованию, единичны (Baxby and Ghaboosi, 1977; Колосова и др., 2003), а работы, посвященные изучению экспериментальной инфекции у животных, в реферируемой литературе отсутствуют.
Адекватные представления о размножении вируса и особенностях патологических изменений в инфицированном организме необходимы не только для понимания механизмов развития вирусной инфекции, но и для разработки экспериментальных моделей животных для испытаний противовирусных препаратов. Опубликованные экспериментальные исследования инфекции, вызванной ВОК, выполнены с использованием прототипного штамма Брайтон. На основе полученных результатов создана модель для испытания препаратов против ортопоксвирусов при аэрозольном и интраназальном заражении мышей (Bray et al., 2000; Bray et al., 2002; Martinez et al., 2000; Ferrier et al., 2002). Между тем, опубликованные результаты о характере патологических изменений внутренних органов и особенностях репродукции ВОК могут не соответствовать таковым при инфекции природными изолятами. Штамм Брайтон используется в вирусологической практике с 1937 г. (Downie, 1939), и его биологические свойства могли измениться в ходе пассажей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 ВОК в различных биологических системах микроскопическими и вирусологическими методами.
В процессе исследования решали следующие задачи: - исследование морфологических особенностей репликации штамма ЕР-2 ВОК в культурах клеток Vero, CV-1 и ФЭК; в клетках хорион аллантоисной оболочки и печени куриных эмбрионов; клетках органов мышей;
- изучение морфологии оспин, вызываемых штаммом ЕР-2 ВОК на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов (ХАО КЭ);
- идентификация клеток-мишеней, поддерживающих репродукцию штамма ЕР-2 ВОК у куриных эмбрионов и мышей;
- изучение динамики изменений внутренних органов мышей при интраперитонеальном и интраназальном заражении разными дозами штамма ЕР-2 ВОК.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые описаны ультраструктурные параметры репликации природного изолята ВОК в культурах клеток, клетках куриных эмбрионов и мышей. Определен спектр клеток-мишеней для штамма ЕР-2 ВОК у куриных эмбрионов и мышей при интраназальном и интраперитонеальном заражении. Впервые показано размножение ВОК в адипоцитах, поперечно-полосатых мышечных клетках, миосателлитах, ретикулярных и шванновских клетках мышей. Показана неспособность штамма ЕР-2 ВОК размножаться в клетках макрофагального ряда мышей, в отличие от вируса эктромелии.
Впервые для природного изолята ВОК приведена детальная морфологическая характеристика оспины на ХАО КЭ. Впервые изучено развитие инфекции у мышей, зараженных интраперитонеально и интраназально природным изолятом ЕР-2 ВОК, и выявлена зависимость исхода инфекции от возраста мышей. Впервые дана патогистологическая характеристика изменений внутренних органов мышей в динамике инфекции. Показан локальный характер размножения изолята ЕР-2 ВОК в органах мышей при интраперитонеальном и интраназальном заражении.
Полученные результаты могут быть использованы при разработке учебно-методических материалов по вирусологии и патоморфологии, а также служить основой для разработки экспериментальных моделей для изучения эффективности препаратов против ортопоксвирусов. Положения, выносимые на защиту.
1. Причиной гибели молодых мышей, зараженных высокими дозами штамма ЕР-2 вируса оспы коров, является перитонит, вызванный массивным размножением вируса в тканях, граничащих с перитонеальной полостью.
2. Генерализация инфекции отсутствует при интраназальном и интраперитонеальном заражении мышей штаммом ЕР-2 вируса оспы коров.
3. Неспособность штамма ЕР-2 инфицировать макрофаги и продуцировать необходимое количество внеклеточного «одетого» вируса может быть причиной, препятствующей генерализации инфекции.
Репликативный цикл ортопоксвирусов
ОПВ имеют сложное строение и крупные размеры, позволяющие визуализировать их в световом микроскопе (Мосс, 1989), однако их детальное строение может быть изучено только с помощью электронной микроскопии. Впервые увидеть и сфотографировать вирус удалось Вон Борриесу в 1938 году, и это был вирус осповакцины (BOB) (Biel and Gelderblom, 1999). Размер зрелых частиц ОПВ, полученных при разрушении зараженных клеток, составляет около 300x230x180 нм, но может варьировать (Muller and Williamson, 1987). По другим данным, ОПВ имеют размеры 250x200x200 нм (Virus Taxonomy, 2000) или 309x237x137 нм (Griffiths et al., 20016). Вирионы ОПВ имеют овальную или кирпичеобразную форму с осевым коэффициентом 1,2-1,7 (Buller and Palumbo, 1991; Мосс, 1989).
Изучение ВОВ методами негативного контраста и замораживания выявило признаки сложной несимметричной организации зрелого вириона, однако эти данные нуждаются в дополнительной проверке, так как использованная авторами методика зачастую приводит к артефактам (Griffiths et al., 20016). В ОПВ присутствуют три главных структурных компонента: нуклеоид (кор), ассоциированные с нуклеоидом латеральные тела и внешняя оболочка (рис. 1). Внешняя оболочка представляет собой двойную липопротеидную мембрану толщиной около 5 нм (Muller and Williamson, 1987; Мосс, 1989). На ее поверхности находятся тубулярные структуры, формирующие поверхностный рельеф, который лучше всего визуализируется при негативном окрашивании (рис. 1) (Muller and Williamson, 1987; Dales, 1973). При изучении методами замораживания-травления и замораживания-высушивания поверхностный рельеф имеет вид «парных складок», состоящих из двух малых субъединиц; профиль складки имеет скорее форму желоба, нежели трубки. Тубулярные структуры располагаются на вирусной оболочке хаотично и имеют длину 50-100 нм, диаметр - 8 нм, и чередуются через 4 нм. Внутренняя часть «впадины» имеет ширину 2,3 нм (Muller and Williamson, 1987). Показано, что тубулярные структуры ВОВ состоят из одинарных 58 кДа поли пептидов и прикрепляются к поверхности вириона дисульфидными и гидрофобными связями (Stern and Dales, 1976а). Ряд авторов полагает, что внешняя оболочка сформирована двойной липопротеидной мембраной, которая очень плотно смыкается и при применении большинства методов выглядит одинарной (Griffiths et al., 2001а; Sodeik and Krijnse-Locker, 2002).
Нуклеоид зрелых частиц ОПВ имеет двояковогнутую форму, в вогнутых изгибах располагаются латеральніые тельца - эллипсоидные структуры, похожие на мячи для регби. Эти структуры описаны у различных ОПВ, в том числе и у ВОК, но их функция на данный момент не определена (Мосс, 1989; Muller and Williamson, 1987; Virus Taxonomy, 2000). «Стенка» нуклеоида образована двумя слоями. Внутренний - гладкий, имеет толщину 5 нм. Наружный слой образован цилиндрическими субъединицами 10 нм длиной и диаметром 5 нм, основания этих субъединиц лежат на внутреннем слое. Изолированный нуклеоид имеет форму «пустого» кирпичика (Moss, 1996а; Muller and Williamson, 1987). При негативном контрастировании и на криосрезах в нуклеоиде различаются 3 кольца диаметром 50 нм и длиной окружности 250 нм (Griffiths et al., 20016; Muller and Williamson, 1987). Неясно, являются ли эти кольца тремя отдельными структурами или цельным образованием, сложенным по типу кабеля. На некоторых препаратах пространство внутри нуклеоида гомогенно, тогда как в других в этом пространстве просматривается запутанная нитчатая структура, которая, по-видимому, является ДНК (Muller and Williamson, 1987). Зрелые частицы ОПВ, в зависимости от наличия дополнительной мембранной оболочки, подразделяют на два основных типа: «одетый» и «неодетый». «Неодетый» вирус не имеет дополнительной оболочки и локализуется как внутри клеток (в большинстве публикаций его называют «внутриклеточный зрелый вирус», intracellular mature virus - IMV), так и вне клеток («внеклеточный зрелый вирус», extracellular mature virus - EMV). Частицы «одетого» вируса окружены дополнительной мембранной оболочкой и визуализируются внутри клеток («внутриклеточный оболочечный вирус», intracellular enveloped virus - IEV), и вне клеток {«внеклеточный оболочечный вирус», extracellular enveloped vims - EEV). Некоторые авторы выделяют «одетый» вирус, связанный с внешней стороной клеточной мембраны («ассоциированный с клеткой вирус», cell-associated enveloped virus - ,CEV) (Morgan, 1976; Ichihashi et al., 1971; Schmelz et al., 1994; Blasco and Moss, 1992). В клинических образцах, полученных от инфицированных ВОВ людей, идентифицируются две формы «неодетых» вирусных частиц: интактная М-форма (форма шелковицы), найденная в везикулярной жидкости, и С-форма (капсулярная), которая, вероятно, соответствует дегенеративной М-форме, обнаруженной в высохших струпьях (Westwood et al, 1964; Hazelton and Gelderblom, 2003). Размножение поксвирусов происходит в цитоплазме зараженных клеток, хотя встречаются и исключения. Так, было обнаружено, что вирус оспы пингвинов способен проникать в ядро, где происходит его незаконченная репликация (Stannard et al., 1998). Репликативный цикл поксвирусов варьирует по продолжительности в зависимости от вида вируса
Особенности инфекции, вызываемой вирусом оспы коров, у людей и животных
Природным хозяином ВОК являются грызуны. В Туркмении ВОК был выделен от диких песчанок и сусликов (Маренникова и Щелкунов, 1998; Fenner, 1996). Исследования показали наличие антигенов ВОК у европейских лесных грызунов: полевки Clethrionomys glareolus и лесной мыши Apodemus sylvaticus (Begon et al., 2003; Hazel et al., 2000; Chanlrey et al., 1999). Количество антигена варьировало в течение года, достигая максимума осенью (Hazel et al., 2000; Chantrey et al., 1999; Begon et al., 1999; Telfer et al., 2002). Эти виды животных чувствительны и к экспериментальному заражению ВОК (штамм L97) (Feore et al., 1997). Опубликованы данные об обнаружении вируса, похожего на ВОК в полевках-экономках {Microtus oeconomus) в лесотундре Кольского полуострова (за полярным кругом) (Львов и др., 1988). Очевидно, ВОК имеет широкий круг хозяев и вызывает энзоотичную инфекцию у различных грызунов, от которых заражаются люди и животные (Fenner, 1996; Маренникова и Щелкунов, 1998).
Источником инфекции для человека в прошлом обычно были больные коровы, наиболее часто ВОК поражал доярок (Fenner, 1996). В последнее десятилетие участились случаи инфицирования людей при контакте с грызунами и кошками (Stewart et al., 2000; Wienecke et aL, 2000; Stolz et al., 19%; Vestey et al., 1991; Hawranek et al., 2003; Wolfs et al., 2002; Schupp et al., 2001; Lawn et al., 2003; Feuerstein et al., 2000). Кожные проявления инфекции (оспины) у доярок регистрируются обычно на большом и указательном пальцах, а также на коже между ними. Наличие царапин и потертостей в отдельных местах может определять локализацию оспин на руках, предплечьях, лице и шее (Fenner, 1996; Baxby et al., 1994; Wienecke et al., 2000; Vestey et al., 1991; Hawranek et al., 2003; Feuerstein-Kadgien and Korn, 2003). Оспины, развивающиеся при заражении ВОК, похожи на проявления первичной вакцинации ВОВ: перед образованием струпьев они проходят стадии макул, папул, везикул и пустул. На месте отвалившихся струпьев остаются шрамы (Fenner, 1996; Wolfs et al., 2002; Hawranek et al., 2003; Schupp et al., 2001). При микроскопическом изучении основная часть эпидермиса в оспинах была изъязвлена; отмечали небольшой акантоз, в зоне которого эпидермис сохранялся. В эпидермальных клетках наблюдали вакуолизацию и ацидофильные включения, наиболее выраженные в шиповатом слое. Диффузная воспалительно-клеточная инфильтрация лимфоцитами, нейтрофилами и гистиоцитами выявлялась в дерме и в небольшой степени в подкожном жировом слое (Hawranek et al., 2003).
У людей, инфицированных ВОК, локальный отек более выражен чем при вакцинации ВОВ; лимфонгаиты, лимфодениты и лихорадка часто сохраняются в течение нескольких дней (Fenner, 1996; Stolz et al., 1996; Baxby et al., 1994; Wolfs et al., 2002; Lawn et al., 2003; Schupp et al., 2001). Несмотря на то, что первичных оспин может быть множество, генерализованная сыпь обычно не наблюдается (Fenner 1996). ВОК может вызывать более тяжелое заболевание у детей, описан случай развития энцефалита (Verlinde, 1951).
Генерализованная форма оспы коров развивается у людей редко, и характеризуется появлением папул величиной с рисовое зерно красного или красно-коричневого цвета. Сыпь локализуется на кистях, предплечьях, ногах, шее. Интервал между развитием первичного очага и проявлением сыпи колеблется от 4 до 20 дней. В местах высыпания характерен зуд (Маренникова и Щелкунов, 1998; Слепушкин, 1982; Baxby et al., 1994; Blackford et al., 1993). Отмечены случаи оспы коров с летальным исходом у людей, болеющих экземой или с подавленным иммунитетом (Маренникова и Щелкунов, 1998; Baxby et al, 1994). Случаи заболевания оспой коров у людей, зараженных вирусом иммунодефицита, не описаны.
Вирус оспы коров был первым вирусом, используемым для вакцинации против натуральной оспы. 14 мая 1776 г. английский врач Эдвард Дженнер привил восьмилетнего Джеймса Фшілипса ВОК от инфицированной доярки Сары Нелмес. Джепнер показал, что мальчик стал невосприимчив к натуральной оспе. Новая процедура получила название вакцинации, в отличие от вариоляции, более древней и рискованной процедуры прививания небольших количеств В НО (вариола). Хотя вакцинация была встречена вначале со скептицизмом, позднее она стала широко распространена. В дальнейшем ВОК был заменен вирусом осповакцины (Moss, 1996 б).
Инфекция, вызываемая ВОК у крупного рогатого скота, характеризуется лихорадкой и развитием кожных высыпаний, чаще всего на вымени и сосках. Кожные элементы претерпевают типичные стадии эволюции (папулы - везикулы - пустулы), с последующим образованием корок и язв. Болезнь протекает обычно в течение трех-четырех недель. У телят, сосущих больных коров, поражения возникают на морде (Маренникова и Щелкунов, 1998).
Кошки восприимчивы к ВОК, болезнь, как и у многих других животных, сопровождается кожными высыпаниями. При природной инфекции первичные оспины локализуются преимущественно на краниальной части тела, шее и передних конечностях, что связанно с охотой на грызунов (Martland et al., 1985; Gaskell et al., 1983; Hoare and Bennett,
Заражение куриных эмбрионов
Культуры клеток Vera и CV-1 заражали штаммом ЕР-2 ВОК из расчета 10 БОЕ на клетку. Инкубировали при 37С в течение 2, 4, 6 (CV-1) и 9 (Vera) ч после заражения. Культуру клеток ФЭК заражали штаммом ЕР-2 ВОК из расчета 0,1 и 0,01 БОЕ на клетку. Инкубировали при 37С в течение 8, 10, 24, 46 ч, и 8, 10, 24, 46 и 70 ч после заражения соответственно. По истечении срока инкубации монослой механически снимали, осаждали на центрифуге J221 (Beckman, США) при скорости 4000 оборотов/мин в течение 5 мин, удаляли супернатант, осадок фиксировали для микроскопического исследования. Заражение ХАО КЭ. Куриных эмбрионов 11-дневною срока инкубации заражали на ХАО штаммом ЕР-2 ВОК из расчета 10 ООЕ на эмбрион. Всем эмбрионам вводили по 0,1 мл вирусной суспензии. Через 48 ч и 72 ч после заражения кусочки ХАО с одиночными оспинами иссекали и фиксировали для микроскопического исследования. Заражение куриных эмбрионов. Эксперимент. I. 13 куриных эмбрионов заражали на ХАО штаммом ЕР-2 ВОК дозами: 37, 3,7x10 и 3,7x10 БОЕ (инкубировали 24 ч); 37, 3,7x102, 3,7x103, 3,7x104, 3,7x105 и 3,7x106 БОЕ т 7 4 (инкубировали 48 ч); 3,7x10 БОЕ (инкубировали 70 ч); 37, 3,7x10 и 3,7x10 БОЕ (инкубировали 72 ч). Всем эмбрионам вводили по 0,1 мл вирусной суспензии. От зараженных эмбрионов брали образцы печени и фиксировали для микроскопического исследования. Эксперимент II. 12 куриных эмбрионов заражали на ХАО штаммом ЕР-2 ВОК дозами 104 и 105 БОЕ штамма ЕР-2 ВОК (инкубировали 24 ч); 104 и 103 БОЕ, (инкубировали 48 ч); 105 БОЕ (инкубировали 72 ч). Всем эмбрионам вводили по 0,1 мл вирусной суспензии. Двум эмбрионам вводили физиологический раствор (0,1 мл) и инкубировали 72 ч. У всех эмбрионов иссекали фрагменты печени, сердца, желудочно-кишечного тракта, скелетной мускулатуры, головного мозга, селезенки, почки, кожи и фиксировали для электронно-микроскопического исследования. Эксперимент I.
Беспородных белых мышей массой 10-14 г заражали и/п штаммом ЕР-2 ВОК в дозах ю\ 105, 106 БОЕ/0,1 мл (но 10 особей) и наблюдали в течение 14 суток. В данном опыте материал для морфологического исследования не отбирали. Эксперимент II. Беспородных белых мышей массой 7-9 г (90 особей) заражали и/п штаммом ЕР-2 ВОК в дозах 10 , 10 и 10 БОЕ/0,1 мл (по 30 особей) и наблюдали в течение 14 суток. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации на 3, 4, 5, 6, 8, 11 и 14-е сутки после заражения. При забое оценивали общий вид животных, состояние шерсти и безволосых наружных покровов (кожа хвоста, ушей, лап), состояние внутренних органов на вскрытии (печень, селезенка, легкие, почки). Еотовили мазки крови у всех мышей. Фрагменты печени, селезенки и брыжейки иссекали и фиксировали для микроскопического исследования. Эксперимент Ш. Беспородных белых мышей массой 7-9 г (8 особей) и массой 10-14 г (8 особей) заражали и/п штаммом ЕР-2 ВОК в дозе 10 БОЕ/0,1мл и наблюдали в течение 48 часов.
Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 24 и 48 ч после заражения. Брали фрагменты печени, селезенки, почки, брыжейки и брюшной стенки, а также смывы со стенок перитонеальной полости. Образцы фиксировали для электронно-микроскопического исследования. Фрагменты брюшной стенки и смывы с перитонеальной полости от 8 животных (по 4 особи от каждой группы) подвергали вирусологическому исследованию для определения количества вируса. Эксперимент IV. Беспородных белых мышей массой 7-9 г (25 особей) и массой 10-14 г (24 особи) заражали и/п штаммом ЕР-2 ВОК в дозах 104 БОЕ/0,1мл (по 12 особей в каждой группе) и 10і БОЕ/0,1мл (13 особей весом 7-9 г и 12 особей весом 10-14 г). Животных наблюдали в течение 8 суток. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации на 4, 6 и 8-е сутки после заражения. Брали фрагменты печени, селезенки, почки, брыжейки и мышечной стенки, а также смывы со стенок псритонеалыюй полости. Образцы фиксировали для электронно-микроскопического исследования. Фрагменты брюшной стенки и смывы с перитонеальной полости от 24 животных (по 12 особей от каждой группы) подвергали вирусологическому исследованию для определения количества вируса. Эксперимент V. Мышей линии BALB/C массой 8-9 г (15 особей) заражали и/н штаммом ЕР-2 ВОК в дозе 2x10 БОЕ/20мкл и наблюдали в течение 11 дней. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации на 3, 5, 7, 9 и I 1 -с сутки после заражения.
При забое оценивали общий вид животных, состояние шерсти и безволосых наружных покровов (кожа хвоста, ушей, лап), состояние внутренних органов на вскрытии (печень, селезенка, легкие, почки). Фрагменты печени, селезенки, трахеи, легкого, тканей носовой полости, сердца, тимуса, обонятельных луковиц, переднего мозга иссекали и фиксировали для микроскопического исследования. Заражение мышей вирусом эктромелии. Беспородных белых мышей массой 10-14 г (12 особей) заражали и/п штаммом К-1 ВЭ в дозе 50 БОЕ/0,1мл и наблюдали в течение 6 суток. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации на 4, 5 и 6-е сутки после заражения. При забое оценивали общий вид животных, состояние шерсти и безволосых наружных покровов (кожа хвоста, ушей), состояние внутренних органов на вскрытии (печень, селезенка, легкие, почки). Образцы органов иссекали и фиксировали для микроскопического исследования.
Особенности инфекции штамма ЕР-2 ВОК на ХАО КЭ
Формирование оспин на ХЛО КЗ является характерным свойством ОПВ и служит диагностическим признаком (Маренникова и Щелкунов, 1998). Штамм ЕР-2 ВОК вызывал через 48 ч после заражения формирование на ХАО КЭ видимых невооруженным глазом мелких выпуклых оспин. Оспины приобретали геморрагичный характер, свойственный оспинам, индуцируемым ВОК (Quia et aL, 1990), через 72 ч. Особенностью оспин, вызванных штаммом ЕР-2 ВОК, являлось наличие геморрагического шлейфа («хвоста»), часто наблюдаемого визуально через 72 ч инкубации, который был крупной веной, переполненной эритроцитами.
Формообразующими факторами для оспин, индуцированных ВОВ, являлись размножение вируса, пролиферация эпителия и воспалительно-клеточная реакция (Рябчикова и др., 1990). Эти же факторы в той или иной степени реализовывались и в оспинах, развивающихся на ХАО КЭ при заражении штаммом ЕР-2 ВОК. Оспина была образована эпителием хориона и мезенхимой. Эпителий аллантоиса практически не принимал участия в формировании оспины. При светооптическом изучении наиболее выраженные патологические изменения наблюдались в центре оспины, по направлению к периферии их интенсивность снижалась. Оспина имела цилиндрическую симметрию относительно центра, который соответствовал начальной точке инфицирования. Основные морфометрические параметры оспин через 48 и 72 ч поле заражения приведены в таблице (табл. 1). Следует отметить, что по сравнению с другими штаммами ВОК (Маренникова и Щелкунов, 1998) диаметр оспин, вызванных заражением ХАО КЭ штаммом ЕР-2 ВОК, был несколько меньше.
Интактный эпителий хориона (рис. 23), расположенный вне зоны оспин, представлял собой один слой уплощенных клеток, лежащих на базальной мембране, плотно прилегающих друг к другу. На ультраструктурном уровне цитоплазма клеток хориона однородная темная и зернисіая. Ядро крупное, округлой или продолговатой формы, часто имеет неправильные очертания. Иногда в ядре наблюдается одно небольшое ядрышко. Электронная плотность ядра немного меньше, чем у цитоплазмы. Эпителиоцит хориона на срезе содержит несколько небольших округлых митохондрий низкой электронной плотности с редкими кристами, цистерны ЭПС и небольшой аппарат Гольджи около ядра. Клетки эпителия хориона содержат электронно плотные мелкие лизосомы и более светлые и крупные липидные включения. Апикальная поверхность клеток покрыта микроворсинками, латеральные поверхности соединены десмосомами и замыкающими комплексами.
В оспине количество слоев эпителия хориона возрастало до 6-14 слоев через 48 ч (рис. 24.А), и до 8-16 слоев - через 72 ч после заражения (рис. 24.Б). Увеличение толщины эпителиального пласта обусловлено пролиферацией эпителиальных клеток, индуцируемой вирусным ростовым фактором (VGF), кодируемым ОПВ (Buller et al., 1988, Fonseca et al., 1999). Утолщение эпителия хориона наблюдалось и при заражении ХАО КЭ штаммами Брайтон и GRI-90 ВОК (Chua et al., 1990; Колосова и др., 2003).
В центре оспины шли некротические процессы, следствием которых являлись разрушенные клетки. Размеры зоны некроза увеличивались в течение инфекции (табл. L). Во всех образцах оспин через 72 ч после заражения, и в некоторых препаратах через 48 ч, наблюдалась отслойка погибших клеток центральной зоны и формирование впадины. Иногда в оспине над зараженными клетками располагались 1-2 слоя интактных клеток, отделенных от зараженных полостью.На светооптическом уровне в клетках эпителия хориона через 48 ч инкубации выявлялись редкие мелкие округлые включения А-типа. Позднее число включений существенно возрастало, их размеры увеличивались (рис. 26.А). При электронно-микроскопическом изучении на границе между интактным эпителием хориона и оспиной наблюдали эпителиоциты с интактной структурой и эпителиоциты без морфологических признаков инфекции, но имеющие заметные патологические изменения. Первые располагались в верхних слоях эпителия, тогда как измененные клетки лежали под ними. Патологические изменения в эпителиоцитах выражались в округлении и увеличении в размерах клетки за счет отека цитоплазмы и ядра. Микроворсинки укорачивались, их количество уменьшалось. Клеточные контакты сохранялись, в их строении не прослеживалось выраженных изменений. Электронная плотность цитоплазмы резко уменьшалась, плотность ядра снижалась в меньшей степени. Происходила вакуолизация цистерн ЭПР и аппарата Гольджи. Митохондрии увеличивались в размерах за счет отека матрикса, некоторые из них разрушались. Липидные включения и лизосомы сохранялись.
Морфологические характеристики размножения штамма ЕР-2 ВОК в клетках эпителия хориона соответствовали описанным в разделе 1. Зараженные клетки содержали вироплазму, скопления незрелых и зрелых вирионов (рис. 25), три варианта включений А-типа (рис. 7, 8, 26.Б) (через 48 ч - только вариант А"), а также вирус-специфические структуры (необычные темные включения, трубчатые структуры, скопления свободных нуклеоидов).Основная часть зараженных эиителиоцитов находилась в центре оспины, где слой зараженных клеток был наиболее толстым и образовывал верхнюю границу оспины. На периферии оспины слой зараженных клеток мог располагаться под слоем незараженных клеток (рис. 27). Патологические изменения большинства зараженных клеток были аналогичны изменениям незараженных клеток переходной зоны. Базальная мембрана эпителия хориона в зоне оспины через 48 ч после заражения сохранялась на
