Введение к работе
Актуальность проблемы
Арбовирусы - это экологическая группа вирусов, передающихся восприимчивым позвоночным через укусы кровососущих членистоногих: комаров, клещей, москитов, мошек и мокрецов. К этой группе тесно примыкают зооиозные вирусы, циркулирующие среди позвоночных животных, без участия кровососущих членистоногих. К ним относятся, в частности, возбудители ряда геморрагических лихорадок (Ласса, Марбург, Эбола, аргентинская, боливийская, венесуэльская, бразильская, ККГЛ, с почечным и легочным синдромом). Общее число вирусов, относящихся к этим категориям, составляет примерно 550. По крайней мере для 100 из них выявлена способность вызывать заболевания людей [Д.К. Львов , 2008].
Такие арбовпрусные инфекции, как лихорадка денге, геморрагическая лихорадка денге, жёлтая лихорадка, восточный, западный, венесуэльский энцефаломиелита лошадей, энцефалиты - японский, клещевой, Сент-Луис, долины Муррея, Росію, Западного Нила, калифорнийский, лихорадки долины Рифт, москитные лихорадки, карельская лихорадка и другие - далеко не полный перечень опасных для человека арбовирусных инфекций, представляющих огромное значение для здравоохранения в эндемичных регионах мира.
Борьба, а часто и этиологическая расшифровка вспышек арбовирусных инфекций затрудняются огромным антигенным разнообразием возбудителей, массивностью эпидемических вспышек с охватом в короткий срок значительных групп населения, необходимостью лабораторного подтверждения диагноза, отсутствием специфических средств лечения, а нередко и профилактики.
На территории бывшего СССР выявлено 58 арбовирусов, относящихся к семействам Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Iridaviridae, Picornaviridae, Orthomyxoviridae. Многие из них известны как возбудители заболевания человека. Для других - патогенность для человека пока не выявлена, что отнюдь не означает отсутствия их потенциальной опасности.
Значительная часть из известных арбовирусных инфекций (включая лихорадку Батаи) относится к категории малоизученных.
Вирус Батаи принадлежит к семейству Bunyaviridae, роду Orthobunyavinis (который насчитывает более 140 вирусов) и антигенному комплексу Буньямвера, включающего не менее 20 представителей. Ареал вируса Батаи охватывает южные, юго-восточные и восточные регионы Азии, Западную, Центральную и Восточную Европу, Африку (Судан, Уганда) [Д.К. Львов , СМ. Клименко , С.Я. Гайдамович , 1989; N.W. Nashed , 1993]. Установлена циркуляция этого вируса в разных ландшафтных зонах Европейской и Азиатской территорий России [Д.К. Львов, 2008].
Актуальность настоящих исследований определяется: широким географическим распространением и высокой активностью циркуляции вируса Батаи на эндемичных территориях; выраженной патогенностью для человека; ограниченностью данных о его роли в патологии человека и животных; отсутствием диагностических тест-систем, доступных для использования в практических лабораториях и этиотропных средств лечения лихорадки Батаи; отсутствием достаточной информации по молекулярно-генетической и антигенной идентификации штаммов вируса Батаи и близкородственных вирусов, которая имеет прямое отношение к пониманию процессов эволюции рода Orthobunyavinis.
Цели и задачи исследования
Цели настоящего исследования:
молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика и генотипирование малоизученных штаммов вируса Батаи, создание комплексной системы специфической диагностики лихорадки Батаи, определение активности ряда коммерческих и экспериментальных химических соединений в отношении этого патогенного агента.
Для достижения поставленных целей были поставлены следующие задачи:
определение частичных нуклеотидных последовательностей генов Gn (М-сегмент) и РНК-полимеразы (L-сегмент) штаммов вируса Батаи, циркулирующих в Юго-Восточной Азии (Малайзия), Чешской Республике, на Украине и в России;
проведение филогенетического анализа штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов Orthobunyavirus;
определение аминокислотных замен в антигенных эпитопах гликопротеина Gn и РНК-полимеразы у штаммов вируса Батаи различного происхождения;
создание и характеристика оригинальных ОТ-ПЦР и ИФА тест-систем для диагностики лихорадки Батаи;
определение чувствительности и специфичности ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-систем при обследовании сывороток крови больных людей, доноров и домашних животных; использование этих тест-систем для серодиагностики лихорадки Батаи и проведения сероэпидемиологических исследований;
изучение действия рибавирина, его производных (dRsata, Rsata) и ряда экспериментальных химических соединений (467, 452, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ага-А) на репродукцию вируса Батаи в опытах in vitro.
Научная новизна работы
-
Впервые определена нуклеотидная последовательность фрагментов сегмента М (513 н.о.) и сегмента L (501 н.о.) малоизученных штаммов вируса Батаи, выделенных в разные годы в России (Волгоградская область), на Западной Украине, в Чехословакии и Малайзии. На основании данных филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка сегмента М установлено, что исследованные штаммы группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры.
-
Установлены различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn и протеина L у изученных штаммов.
-
Проведён сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей сегментов М и L РНК штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов антигенного комплекса Буньямвера.
-
Впервые в России создана и охарактеризована специфическая тест-система ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи.
-
Разработаны и охарактеризованы экспериментальные ИФА тест-системы для выявления специфических антител классов IgM и IgG в сыворотках крови людей, IgG в сыворотках крови овец, а также антигенов вируса Батаи.
-
В опытах in vitro на модели вируса Батаи впервые проведено изучение противовирусной активности рибавирина, его производных и других экспериментальных химических соединений, синтезированных в Институте биоорганической химии РАН. Установлено, что рибавирин обладает высокой противовирусной активностью.
Практическая значимость работы
-
Созданная и охарактеризованная в процессе исследования специфическая тест-система ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи обладает достаточно высокой чувствительностью, позволяющей выявлять 12 БОЕ/мл. Она может быть рекомендована для использования в практических диагностических лабораториях.
-
Разработаны и охарактеризованы экспериментальные ИФА тест-систем для выявления специфических антител класса IgM и IgG в сыворотках крови людей, IgG в сыворотках крови овец, а также антигенов вируса Батаи. Техническая документация на данные тест-системы утверждена Учёным Советом НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН 11 мая 2009 г.
-
ИФА-IgM и ИФА-IgG системы были успешно использованы для специфической диагностики лихорадки Батан при совместной работе с вирусологической лабораторией Центра гигиены и эпидемиологии в Астраханской области, где в 2007 г. серологически было верифицировано 5 случаев этой малоизученной инфекции.
-
Установлена выраженная противовирусная активность рибавирипа в отношении вируса Батаи в опытах in vitro.
Основные положения, выносимые иа защиту
-
На основании изучения нуклеотидной последовательности участка гена Gn (сегмента М РНК) штаммов вируса Батан, выделенных в России, на Западной Украине, в Чехии и Малайзии и сравнения полученных результатов с информацией GenBank, установлено, что штаммы вируса Батан группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры. Сходная картина наблюдается при филогенетическом анализе данных по сегменту L. Однако в этом случае в пределах гомогенной европейской генетической группы у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) выявлялось определённое отличие от другого украинского штамма (499), российского штамма 42 (из Волгоградской области) и чешского штамма Чалово.
-
Филогенетический анализ участка гена Gn различных штаммов вируса Батаи и других представителей рода Orthobitnyavirus (серокомплекс Буньямвера) выявляет наиболее близкими к вирусу Батаи североамериканские штаммы Northway и Tensaw (гомология 77% и 79% соответственно). Другие представители рода Ortobunyavirus (серокомплекс Буньямвера) филогенетически достаточно удалены от вируса Батаи (гомологичность нуклеотидной последовательности составляет 25-56%).
-
Установлены различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn и протеина L у изученных штаммов. Гомогенная европейская генетическая группа имеет существенные замены в аминокислотных последовательностях эпитопов I и IV в участке гена гликопротеина Gn.
-
Разработка чувствительной и специфической тест-системы ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи. Чувствительность днагностикума составила 12 БОЕ/мл.
-
Разработка и характеристика тест-систем ИФА для выявления антигена вируса Батаи и специфических антител классов М и G к вирусу Батан в сыворотках крови люден и класса G у овец. Чувствительность тест-системы для определения антигена вируса Батаи составила 100 БОЕ/мл.
-
В результате использования разработанных ИФА-IgM и ИФА-IgG систем проведено обследование сывороток крови больных лихорадочными заболеваниями и здоровых жителей Южного региона России и сывороток овец на антитела к вирусу Батаи. Серологически верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи в Астраханской области. Специфические антитела у овец обнаружены в Астраханской области (12,5%) и Ставропольском крае (5,2%).
-
Исследование противовирусной активности швейцарского препарата «рибавирин». Данный препарат эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса Батаи в культуре клеток Vero Eg. Индекс противовирусной активности рибавирипа составил 2,8-3,0 lg ЦПД50 при концентрации 500 мкг/мл. Производные рибавирина (dRsata, Rsata) и ряд экспериментальных химических соединений (467, 452, С1-Ага-А, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A) не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Батаи.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены и рассмотрены на совместном заседании Отдела арбовирусов и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 30 сентября 2009г., и представлены на Международной конференции молодых учёных и
специалистов «Биотехнология: разработка и контроль препаратов - 2009», Киев, 23-26 сентября 2009 г., на IX международной конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке, Москва, 27-30 ноября, 2008 г. и на Международной конференции EUROMEDLAB, Innsbruck (Austria), 7-11 июня 2009 г.
Публикации
По результатам диссертации опубликовано 2 статьи в реферируемых научных журналах и 3 тезисов в сборниках конференции.
Объем и структура диссертации
