Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммунохимические методы определения вирусов растений 11
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) 11
Метод иммунохроматографии (ИХА) 22
Глава 2. Молекулярные методы определения вирусов растений 26
Молекулярно-гибридизационный анализ (МГА) 27
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 31
ПЦР в реальном времени 40
ДНК-чипы 43
Экспериментальная часть 51
Глава 3. Разработка и усовершенствование методов препаративного выделения вирусов растений и получение моноспецифических антисывороток
Препаративное выделение вируса кольцевой пятнистости малины 57
Препаративное выделение неповирусов черной кольцевой пятнистости томатов и вируса мозаики арабиса
Препаративное выделение латентного вируса кольцевой пятнистости земляники
Препаративное выделение вируса некроза табака 62
Препаративное выделение вируса А картофеля 65
Препаративное выделение вируса шарки (оспы) сливы 68
Препаративное выделение вирусов X картофеля, табачной мозаики, 72
Y картофеля и крапчатости гвоздики
Препаративное выделение вируса мягкой мозаики фасоли 75
Определение таксономического положения ВММФ 76
Глава 4. Разработка тест-систем для иммуноферментного определения вирусов растений
Аналитические характеристики тест-системы для диагностики вируса шарки сливы
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики вирусов картофеля
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики неповирусов
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики 98
вирусов некроза табака, мягкой мозаики фасоли, табачной мозаики и крапчатости гвоздики
Разработка и характеристика наборов для диагностики вирусов картофеля и вируса шарки сливы
Глава 5. Определение вирусов растений методом виробактериальной агглютинации (АБВ-тест)
Глава 6. Разработка имунохроматографических тест-систем для диагностики вирусов растений Конструирование и оптимизация тест-полосок 116
Определение аналитических характеристик тест-полосок 118
Апробация тест-полосок для анализа зараженности растений картофеля 126
Разработка набора для внелабораторного применения тест-полосок 127
Глава 7. Определение вирусов растений с помощью МГА-ИФА-технологии 129
Разработка нового метода экстракции нуклеиновых кислот из 136
вирусных частиц и растений с помощью трихлорацетата аммония Аналитические характеристики МГА-ИФА-технологии и ее применение для определения вирусов растений
Разработка ОТ-ПЦР-МГА-ИФА-технологии для диагностики вирусов 148
Глава 8. Диагностика вируса шарки сливы с помощью полимеразной цепной реакции
Глава 9. Диагностика вирусов и вироида картофеля с помощью ДНК-микроплаты
Глава 10. Применение разработанных методов диагностики для решения практических задач безвирусного растениеводства
Диагностика вирусных инфекций в элитном семеноводстве картофеля 165
Диагностика вирусных инфекций плодовых и ягодных культур для получения безвирусного посадочного материала
Применение тест-системы для диагностики вируса шарки сливы в карантинных исследованиях Диагностика вирусных инфекций цветочно-декоративных культур для 173
получения безвирусного посадочного материала
Глава 11. Индукция у растений устойчивости к заражению вирусами 174
Характеристика противовирусной устойчивости, индуцированной хитозаном
Роль структуры в противовирусной активности хитозана 183
Изучение механизма противовирусной активности хитозана 190
Заключение 199
Выводы 200
Список литературы
- Метод иммунохроматографии (ИХА)
- ПЦР в реальном времени
- Препаративное выделение латентного вируса кольцевой пятнистости земляники
- Аналитические характеристики тест-систем для диагностики неповирусов
Введение к работе
Вирусные инфекции культурных растений вызывают ощутимые потери урожая, заметно ухудшают качество сельскохозяйственной продукции и все чаще рассматриваются как серьезная угроза продовольственной безопасности. Эта проблема касается всех продовольственных, кормовых и технических культур, возделываемых в любом регионе мира, и особенно актуальна для вегетативно размножаемых растений, поскольку прогрессирующее накопление вирусов в ряду поколений приводит к полному заражению и вырождению сорта. Ежегодные убытки (когда их удается оценить), причиняемые вирусами одной культуре в определенном регионе, нередко выражаются сотнями миллионов и миллиардами долларов (Кеглер и др., 1986; Hull & Davies, 1992; Waterworth & Hadidi, 1998; Strange & Scott, 2005).
Прогнозируется, что в обозримом будущем роль вирусных заболеваний растений будет возрастать. Глобализация сельского хозяйства, развитие международной торговли продуктами растениеводства и расширение международного обмена семенным и посадочным материалом способствуют интродукции вирусов в новые регионы. Особую опасность в этом отношении могут представлять цветочно-декоративные культуры, часто зараженные комплексом вирусов, в связи с огромными объемами торговли и динамично меняющимся разнообразием видов, вовлеченных в обмен. При этом возникают резервуары новых для данного региона вирусных инфекций, имеющих экономическое значение также для продовольственных и садоводческих культур. Среди обнаруженных за последнее десятилетие новых (emerging) инфекционных болезней растений почти половина имеет вирусную природу. Непрерывно увеличивается число известных вирусов, а глобальное потепление расширяет ареалы насекомых — переносчиков и способствует увеличению их численности (Thresh, 1982; Rodoni, 2007; Boonham et al., 2007).
С другой стороны, мировая практика показывает, что использование свободного от вирусов («безвирусного») семенного и посадочного материала позволяет на десятки процентов повысить продуктивность сельскохозяйственных культур (Foster & Hadidi, 1998; Waterworth & Hadidi, 1998). Такая возможность интенсификации растениеводства особенно актуальна в связи с прогнозируемым ростом потребности в продовольственных, кормовых и топливных ресурсах (Edgerton, 2008). Для радикального снижения вредоносности вирусных инфекций необходим перевод растениеводства на безвирусную основу.
В настоящее время производство безвирусного семенного и посадочного материала основано главным образом на выбраковке зараженных и отборе здоровых растений с целью их последующего размножения. Очевидно, что для осуществления такого отбора необходимо располагать чувствительными методами массовой диагностики вирусов.
При тотальном заражении сорта, когда отбор неэффективен, растения оздоравливают от вирусов с помощью термотерапии и культуры меристем. Однако, существующие методы оздоровления не гарантируют полного избавления от патогена. Поэтому все этапы получения безвирусных растений должны сопровождаться анализами на присутствие вирусов с помощью высокочувствительных методов лабораторной диагностики вирусных инфекций.
Полученные здоровые растения поддерживаются в условиях защиты от повторного заражения и перед дальнейшим размножением подлежат сертификации, т.е. определению соответствия степени их зараженности требованиям государственных и отраслевых стандартов. Процедура сертификации предполагает тестирование большого количества образцов за короткое время, т.е. требует наличия быстрых и чувствительных методов массовой диагностики вирусных инфекций.
Поскольку безвирусное растениеводство обычно сосуществует с традиционными технологиями, при размножении, безвирусных растений не исключено их повторное заражение ввиду высокого инфекционного фона. Для постоянного мониторинга вирусных инфекций в насаждениях культурных растений (и в окружающей дикорастущей флоре) с целью своевременного выявления и ликвидации очагов инфекции, ограничения распространения вирусов и предупреждения эпифитотий нужны чувствительные методы точной идентификации вирусов.
Хорошо известно, что возделывание устойчивых сортов существенно снижает урон
от вирусных заболеваний. Для обеспечения селекционной и генноинженерной работы по
выведению новых сортов, устойчивых к вирусам, и изучения механизмов
. противовирусной устойчивости необходимы высокочувствительные методы лабораторной
диагностики вирусных инфекций.
Важнейшую роль в предупреждении распространения вирусных инфекций играет карантинный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого семенного и посадочного материала. Для предотвращения интродукции вирусов карантинная служба должна располагать быстрыми и чувствительными методами их диагностики.
Таким образом, массовая диагностика вирусных инфекций является ключевой задачей безвирусного растениеводства, успешное решение которой зависит от доступности быстрых, чувствительных, специфичных, легко-выполнимых и недорогих
методов детекции и идентификации вирусов. Следует подчеркнуть, что, как показывает весь мировой опыт, затраты на диагностику несоизмеримы с потерями от заражения вирусами и с расходами на искоренение инфекции (Martin et ah, 2000).
В России большинство вегетативно размножаемых культур хронически заражено вирусами (Атабеков, 1984). Повсеместное использование зараженного семенного материала является главной причиной того, что Россия занимает одно из последних мест в мире по урожайности картофеля. Отмечается распространение и возрастание вредоносности тяжелых форм вирусного заражения на многих сортах картофеля, находящихся в хозяйственном и торговом обороте. В ряде случаев вызываемые ими потери достигают 90% (Малько и др., 2003; Симаков, 2004; Анисимов и др., 2005). Вирусные заболевания существенно снижают продуктивность плодовых, ягодных и овощных культур, возделываемых в РФ (Кашин, 2001; Белошапкина, 2005; Ахатов и др., 2006). Серьезной фитосанитарной проблемой для нашей страны является интродукция из-за рубежа зараженного семенного и посадочного материала (Санин и Филиппов, 2003).
Осознание значимости и масштабов проблемы вирусных инфекций сельскохозяйственных культур и начало работ по, оздоровлению, развернувшихся в бывшем СССР в начале 80-х годов, показало, что важнейшее звено этой работы — массовая диагностика вирусных инфекций — в нашей стране практически не было обеспечено.
Единственным методом массовой лабораторной диагностики фитопатогенных вирусов был в то время серологический метод, основанный на преципитации вирусных частиц антителами иммунной сыворотки в жидкой среде (т.н. «drop precipitation test», известный в России как «капельный метод диагностики»), который использовали для выявления четырех вирусов картофеля в листьях сильно зараженных растений. Однако, чувствительность капельного метода оказалась недостаточна для выявления вирусов в пробирочных растениях, получаемых при оздоровлении сорта методом культуры меристем. Поэтому его применение на ранних стадиях оздоровления и вегетативного размножения оздоровленного материала было неэффективным. Кроме того, ассортимент имеющихся антисывороток совершенно не отвечал реальным потребностям безвирусного растениеводства.
В то же время, в связи с ростом экономического значения вирусных инфекций, увеличением объема анализов и количества подлежащих определению вирусов существенно возрастали требования к чувствительности и специфичности методов массовой диагностики, обеспечивающих однозначность получаемых результатов. Первостепенное значение приобретала производительность метода, т.е. возможность
выполнять большое количество анализов за короткое время, которая определяется не только скоростью выполнения анализа и подготовительных процедур, но и удобством в работе при массовом применении. Все большее внимание уделялось созданию таких методов анализа, которые позволяют одновременно выявлять все известные или, по крайней мере, наиболее вредоносные вирусы данной культуры в одном образце, что существенно ускоряет и удешевляет процедуру лабораторной диагностики. Отчетливо обозначилась потребность в быстрых и простых методах внелабораторного анализа, которые дают возможность проводить анализ самостоятельно, непосредственно в месте нахождения образца, и для применения которых не требуется высокой профессиональной подготовки.
Таким образом, было совершенно очевидно, что для устойчивого развития безвирусного растениеводства в РФ необходима разработка новых высокочувствительных, производительных и надежных методов диагностики и средств для их применения с учетом реальных запросов сельскохозяйственной практики, нормативной базы отрасли и современных тенденций в развитии методов массовой диагностики вирусных инфекций растений.
Целью наших исследований' являлась разработка высокочувствительных методов массовой экспресс-диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных культур для развития безвирусного растениеводства в РФ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Усовершенствование известных и разработка новых эффективных методов
препаративного выделения вирусов важнейших сельскохозяйственных культур с целью
получения высокоочищенных вирусных препаратов и моноспецифических кроличьих
антисывороток с высоким титром; >
Разработка методов лабораторной диагностики вирусных инфекций картофеля, плодовых, ягодных, овощных и цветочно-декоративных культур на основе иммуноферментного анализа, полимеразной цепной реакции и дот-гибридизации;
Разработка методов внелабораторной диагностики вирусных инфекций на основе реакции агглютинации и иммунохроматографического анализа, а также наборов для иммуноферментного определения основных вирусов картофеля и вируса шарки сливы;
Практическое применение разработанных методов и средств диагностики вирусных инфекций для оздоровления, контроля качества и сертификации семенного и посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочных культур, а также для изучения распространенности ряда вирусных инфекций.
Изучение возможности индукции у растений устойчивости к вирусным инфекциям с помощью биогенного элиситора (хитозана).
Метод иммунохроматографии (ИХА)
В последние годы растет потребность в таких методах диагностики, которые дают возможность проводить анализ самостоятельно, непосредственно на месте нахождения образца, и для применения которых не требуется высокой профессиональной подготовки. Эта тенденция обусловлена тем, что инструментальные методы анализа должным образом могут быть использованы только в хорошо оснащенных центрах и лабораториях. В результате, диагностика вирусных инфекций основной массы возделываемых культур проводится путем визуальной оценки симптомов заболевания. Эффективность маршрутных обследований насаждений с целью отбора проб для лабораторного анализа, фитосанитарного надзора или сертификации может быть значительно повышена при возможности быстрого и достоверного определения вируса непосредственно в полевых условиях. Кроме того, лабораторный анализ занимает несколько суток. Это обстоятельство существенно осложняет работу, например, карантинных служб в тех случаях, когда требуется получить быстрый и однозначный результат анализа.
Таким образом, для эффективного мониторинга вирусных инфекций необходимы быстрые и чувствительные неинструментальные методы анализа, которые могут быть использованы в массовых масштабах в лабораторных и, особенно, во внелабораторных условиях как специалистами, так и лицами без профессиональной подготовки (Adams et al, 2001).
Одним из решений этой задачи является метод иммунохроматографии (ИХА) в пористых мембранах (тест-полосках), на которые нанесены антитела и их конъюгаты с окрашенными коллоидными частицами, способные взаимодействовать с вирусом. Этот метод, обычно называемый в англоязычной литературе «lateral flow device», «lateral flow test» или просто «strip test», был разработан в 1988 году фирмой «Unipath» для определения гормонов беременности в домашних условиях и с тех пор получил широкое распространение для диагностики различных инфекционных заболеваний, аллергенов, наркотических веществ, токсинов, пестицидов и т.д.
По-видимому, первым применением метода иммунохроматографии для диагностики вирусов растений была работа Tsuda et al. (1992). Анализ выполняли на полоске из стекловолокна, на которой в определенном месте фиксировали частицы белого полистиролового латекса, покрытые поликлональными антителами к ВТМ или к ВОМ. В анализируемый образец вносили суспензию частиц окрашенного (розового) латекса, также покрытых антителами к этим вирусам. При погружении тест-полоски в образец образовавшийся в экстракте иммунный комплекс вируса и окрашенных частиц продвигался вдоль полоски и достигал зоны с иммобилизованными антителами, где ими и улавливался. В результате постепенной концентрации окрашенных частиц образовывалась, полоса красного цвета, видимая невооруженным глазом. Чувствительность метода позволяла за 5 - 10 мин специфично выявлять ВТМ в концентрации до 5 нг/мл, а ВОМ - до 50 нг/мл в очищенном препарате и в экстракте из зараженных листьев. Несколько позже тот же подход был применен для одновременного определения двух вирусов орхидей на одной тест-полоске (Tanaka et al., 1997).
В дальнейшем при создании тест-полосок различного назначения был разработан целый ряд новых технических решений, в результате применения которых полоска из однородного материала превратилась в мультимембранный композит, в тест-систему был включен внутренний контроль, в качестве метки, наряду с частицами окрашенного латекса, стали использовать коллоидное золото, а меченые антитела (конъюгат) стали помещать непосредственно на тест-полоске. Была создана теория иммунохимических реакций, происходящих в потоке жидкости (Qian & Bau, 2003), и детально изучено влияние различных факторов на параметры иммунохроматографического процесса (Posthumarumpie et al, 2009; Warsinke, 2009).
Метод ИХА в его современном и наиболее распространенном формате, в том числе применительно к диагностике вирусов растений, выглядит следующим образом (Danks & Barker, 2000). Тест-полоска (рис.1 А) представляет собой мультимембранный композит, состоящий из нескольких частей: впитывающей мембраны, погружаемой в образец (1); мембраны для нанесения конъюгата антител с коллоидными частицами (2); рабочей мембраны (3), на которой в аналитической зоне (4) фиксированы антитела к определяемому вирусу, а в контрольной зоне (5) антитела к IgG кролика (при использовании кроличьих антител к вирусу) или к IgG мыши (при использовании мышиных моноклональных антител к вирусу); другой впитывающей мембраны (6), поддерживающей поток жидкости по полоске. Все компоненты монтируются на одной пластиковой подложке, обеспечивающей единство конструкции и механическую прочность тест-полоски, и покрыты сверху прозрачной пленкой или заключены в пластиковую кассету, которые исключают контакт рук и рабочих мембран при выполнении анализа.
При погружении тест-полоски в экстракт вирус, продвигаясь вдоль полоски с фронтом жидкости, связывается с конъюгатом, а затем с антителами, фиксированными в аналитической зоне. Концентрирование связанных с вирусом коллоидных частиц приводит к образованию в этом месте окрашенной полосы. Избыток конъюгата улавливается антивидовыми антителами, в результате чего в контрольной зоне тоже образуется окрашенная полоса (рис. 1Б). При отсутствии вируса в экстракте (здоровое растение) окрашенная полоса в аналитической зоне не образуется (рис. 1В). Если окрашенная полоса не образуется в контрольной зоне, тест признается недостоверным независимо от того, образовалась ли полоса в аналитической зоне (рис. 1 Г, Д).
ПЦР в реальном времени
Действительный скачок в развитии метода ПЦР произошел в результате разработки метода детекции ампликонов с помощью системы TaqMan (Holland et al., 1991), основанной на применении зондов, разрушаемых в процессе ПЦР. Согласно этой технологии, олигонуклеотид, комплементарный внутренней области продукта ПЦР, метят флуорофором и гасителем флуоресценции. В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается рядом расположенным гасителем (путем контактного гашения или по механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии). Во время отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5 -экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. Поскольку энергия, испускаемая флуорофором, больше не поглощается удаленным гасителем, уровень флуоресценции прямо зависит от степени разрушения зондов, т.е. от количества образовавшихся продуктов ПЦР. Уровень флуоресценции может быть измерен количественно, в закрытой пробирке и непосредственно в процессе реакции (т.е. в реальном времени), а не только после ее окончания, как в предыдущих вариантах ПЦР. Технически это осуществляется посредством использования детектирующего амплификатора, представляющего собой обычный амплификатор ДНК, совмещенный с измерителем флуоресценции (Ребриков, 2009).
Система TaqMan, основанная на применении линейных разрушаемых зондов, а также другие системы, основанные на применении праймеров-«скорпионов», вытесняющих зондов и уже упоминавшихся молекулярных маячков относятся к специфическим системам детекции, т.е. к таким, которые позволяют регистрировать накопление фрагмента ДНК строго определенной последовательности. Другой подход основан на применении неспецифической системы детекции, которая проявляет любую образующуюся в ходе реакции двунитевую ДНК с помощью интеркалирующих красителей. Наиболее распространенным красителем для ПЦР в реальном времени является SYBR Green І. В целом, система TaqMan считается более чувствительной и более специфичной.
Возможности TaqMan — ОТ — ПЦР в реальном времени для диагностики вирусов растений можно проиллюстрировать на примере определения вируса тристецы цитрусовых (Bertolini et al., 2008). Тотальную РНК из различных тканей зараженных деревьев или из тли выделяли с помощью технологии RNeasy. Кроме того, для приготовления образца использовали метод тканевых отпечатков на нитратцеллюлозной мембране, нейлоновой мембране и на фильтровальной бумаге ЗММ (Whatman), который не требует экстракции РНК. Образцы анализировали с помощью непрямого дот-варианта ИФА (используя отпечатки на нитроцеллюлозной мембране), иммуноспецифической гнездовой ОТ-ПЦР и с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, используя в качестве матрицы для обратной транскрипции выделенную тотальную РНК или РНК, экстрагированную из иммобилизованных образцов. При использовании в качестве матрицы очищенной РНК ПЦР в реальном времени позволяла выявлять 17 молекул вирусной РНК в образце за 40 циклов амплификации и по чувствительности превосходила в 100 — 500 раз иммуноспецифическую гнездовую ОТ-ПЦР и в миллион раз ИФА, при этом обеспечивая количественное определение вируса в широком интервале от 170 до 1,7 млрд молекул РНК. При использовании в качестве матрицы РНК, экстрагированной из тканевых отпечатков, чувствительность ПЦР в реальном времени оказалась ниже, однако также позволяла получать совершенно однозначные результаты. Одна из причин снижения чувствительности может заключаться в том, что в тотальной РНК присутствуют как геномная, так и многочисленные субгеномные вирусные РНК, в то время как в экстракте из тканевых отпечатков - только геномная РНК вируса, поскольку неинкапсидированные субгеномные РНК и репликативные формы деградируют под действием рибонуклеаз растительного экстракта. Отмечается, что мембраны с нанесенными тканевыми отпечатками допускают возможность длительного хранения при комнатной температуре. Это обстоятельство имеет большое практическое значение, поскольку позволяет наносить образцы непосредственно в полевых условиях, а анализировать их в лабораторных, причем спустя довольно продолжительное время.
Чувствительность TaqMan - ОТ — ПЦР в реальном времени позволяла выявлять 12 частиц вируса мозаики томатов, что давало возможность обнаруживать этот вирус в водах ирригационных систем без предварительного концентрирования образцов (Boben et al., 2007) и, например, до 100 копий РНК вируса желтой карликовости ячменя в экстракте из одного вектора во время осеннего лета тли, что значительно повышало точность прогноза эпидемиологической ситуации (Fabre et al., 2003).
Возможно, одним из наиболее красноречивых примеров новых возможностей, которые открываются в результате применения ПЦР в реальном времени, связан с семеноводством картофеля. Поскольку чувствительность ИФА недостаточно высока для достоверного выявления вирусов в покоящихся клубнях, особенно при поздней первичной инфекции, клубни приходится проращивать и диагностировать вирусы в листовой ткани (Hill & Jackson, 1984). Эта процедура, тщательно разработанная и принятая во всех странах с развитым семеноводством картофеля, занимает несколько месяцев и требует значительных тепличных площадей. Применение ПЦР в реальном времени, позволяющей достоверно выявлять вирусы в покоящихся клубнях и проделывать тот же объем анализов за несколько дней, дает возможность отказаться от этой процедуры (Mumford et al., 2006; Boonham et al., 2008). Следует подчеркнуть, что применение метода ГЩР в реальном времени возможно и в мультиплексном варианте, что было продемонстрировано, например, при высокочувствительной дигностике трех вирусов картофеля: вируса метельчатости верхушек, погремковости табака и YBKNTN(Boonham et al., 2000).
Таким образом, изобретение ГЩР в реальном времени устранило необходимость пост-ПЦР-ных манипуляций, существенно понизило риск контаминации, сделало возможным количественную оценку результатов анализа и повысило чувствительность определения вирусов. Не без оснований считается, что разработка метода ГЩР в реальном времени революционизировало ситуацию в области диагностики вирусных инфекций растений. Непрерывные усовершенствования технологии ведут к быстрому снижению стоимости анализа (в 10 раз за последние 10 лет) и упрощению его процедуры, так что в настоящее время ПЦР в реальном времени по сложности выполнения приближается к ИФА и становится все более доступной для массовой диагностики вирусных инфекций растений (Mumford et al., 2006).
До последнего времени методы, основанные на полимеразной цепной реакции, обоснованно считались лабораторными методами анализа. Разработка метода ПЦР в реальном времени имела еще и то важное последствие, что позволила применять этот метод во внелабораторных условиях. Созданные исходно для медицинских и ветеринарных целей и для обеспечения биобезопасности, переносные детектирующие амплификаторы могут быть использованы для диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных культур в полевых условиях. Предполагается, далее, что использование различных способов изотермической амплификации приведет к радикальному упрощению конструкции ДНК-амплификаторов и будет способствовать дальнейшему расширению применения метода ПЦР в реальном времени в диагностических целях в практическом растениеводстве (Boonham et al., 2008; Vicelli & Tisserat, 2008).
Препаративное выделение латентного вируса кольцевой пятнистости земляники
Вирионы потивируса А картофеля (АВК) {Potato virus А, сем. Potyviridae, род Potyvirus) представляют собой гибкие нитевидные частицы длиной 730 нм и диаметром 11 нм, которые состоят из одной молекулы однонитевои геномной РНК положительной полярности длиной 9585 нуклеотидов и белка оболочки с мол. массой около 32 кДа (Bartels, 1971). Вирус передается вегетативно через инфицированные клубни, механически при контактах больных и здоровых растений и векторным путем различными видами тлей неперсистентным способом (Beemster & de Bokx, 1987).
АВК распространен по всему миру в большинстве регионов возделывания картофеля, кроме Андийского региона Южной Америки (Salazar, 1996), и считается одним из наиболее вредоносных для этой культуры. В зависимости от сорта картофеля, штамма вируса, климатических и агротехнических условий, вызываемое им заболевание может снижать урожай клубней до 40 %. При смешанной инфекции с ХВК или YBK вредоносность АВК усиливается - снижение урожая достигает 60-80 % (Loebenstein et al., 2001).
На территории бывшего СССР этот вирус обнаруживали на Дальнем Востоке России (Gnutova & Krylov, 1975; Гнутова, 2005) и в Беларуси (Шутская и Бардышев, 1978). В России, за исключением Дальневосточного региона, распространенность и вредоносность АВК практически не изучены. Между тем, АВК, наряду с ВСЛК и YBK, относится к возбудителям тяжелых вирусных болезней картофеля, допустимые нормы зараженности которыми в оздоровленном семенном материале жестко лимитируются и в сумме не должны превышать 0,5 % как в вегетирующих растениях, так и в клубнях, выращенных в поле. В растениях, размноженных в культуре in vitro и выращенных в теплице, поражение этими вирусами не допускается. Основной причиной слабой изученности распространенности АВК являлось отсутствие надежных средств его лабораторной диагностики.
Наборы для ИФА АВК производятся в России во ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха РАСХН (ВНИИКХ) и в ЗАО «НВО Иммунотех» (Чирков и др., 2002). Однако аналитические характеристики этих наборов в силу объективных причин не соответствуют современным требованиям. Учитывая, что АВК накапливается в растениях картофеля в низкой концентрации (Beemster & de Bokx, 1987), это обстоятельство может являться причиной ложноотрицательных результатов анализа и, следовательно, искажения истинной оценки качества семенного картофеля.
Наша цель состояла в разработке усовершенствованного метода выделения АВК, позволяющего получить достаточное количество очищенного вирусного препарата, необходимого для производства кроличьей антисыворотки, создании на ее основе высокочувствительной тест-системы ИФА и ее испытании при диагностике АВК в семенном картофеле.
Изолят вируса PVA-B11 был предоставлен С. Мулетаровой (Центральная опытная станция по селекции и семеноводству картофеля, г. Пловдив, Болгария). Вирус размножали в растениях табака N clevelandii. Через 2 недели после механической инокуляции растений отбирали молодые листья с максимальным содержанием вируса. Такой предварительный отбор дает возможность получать достаточное количество вируса из небольшой навески листьев, что существенно упрощает работу по его очистке. 40 г листьев гомогенизировали (порциями по 10 г) вручную в охлажденной ступке со 160 мл экстрагирующего буфера (0,1 М калий-фосфатный буфер, 0,8 М мочевина, 0,2 М сахароза, 0,01 М ЭДТА, 1% ДИЕКА, 1% меркаптоэтанол), рН 7.2. Экстракт фильтровали через двойной слой марли и осветляли центрифугированием в роторе JA-20 14000 об/мин 20 мин при 4С. К осветленному экстракту постепенно, при перемешивании на магнитной мешалке добавляли 25% водный раствор Тритона Х-100 до конечной концентрации 5% и перемешивали на магнитной мешалке 30 мин при температуре 4С. Использование 5% Тритона Х-100 вместо обычно применяемых хлороформа или бутанола позволяет эффективно освободиться от компонентов клеточных мембран и не вызывает деградации частиц потивирусов (Oosten, van, 1972).
По 17 мл полученного экстракта наслаивали на 8 мл 20% сахарозной подушки, приготовленной на экстрагирующем буфере, и центрифугировали в роторе 50.2 Ті 28000 об/мин 210 мин при температуре 5С. Осадки суспендировали в калий-фосфатном буфере с мочевиной (КФБМ, 0,1 М калий-фосфатный буфер, 0,8 М мочевина, рН 7,2) и оставляли на ночь при температуре 4С.
Вирусную суспензию осветляли на центрифуге Эппендорф 5414 10000 об/мин 10 мин и наслаивали на преформированный сахарозный градиент (10 - 40% сахарозы), приготовленный на КФБМ, по 1,5 мл на пробирку с объемом градиента 32,5 мл. Центрифугировали в роторе SW27 25000 об/мин 150 мин при температуре 4С. Содержимое пробирок фракционировали с помощью Auto Densi-Flow ПС («Haakebuchler», США) и Uvicord S («LKB», Швеция) на 30 фракций одинакового объема, содержание вируса в которых определяли методом ИФА (см. ниже). Фракции, содержащие вирус, объединяли, разводили (в соотношении не менее чем 2:3) КФБМ, переносили в центрифужные пробирки для ротора 50.2 Ті, уравновешивали и оставляли на ночь при температуре 4С. Вирус осаждали в роторе 50.2 Ті при 30000 об/мин 150 мин. Осадки ресуспендировали в 0,1 М глицине, доведенным до рН 7,5 1 N КОН. Вирусный препарат осветляли на центрифуге Эппендорф 5414 10 мин. Концентрацию вируса определяли, используя коэффициент экстинкции Агбо = 2,8 (Baratova el а!., 2001).
Содержание вируса в листьях, в экстрактах на различных стадиях очистки и во фракциях сахарозного градиента определяли в сэндвич-варианте ИФА с помощью диагностического набора «Bio-Rad» Cat № 51585 («Bio-Rad Phyto-Diagnostics», Marnes-La-Coquette, Франция) согласно инструкции к набору. Для отбора листьев с максимальным содержанием вируса пробочным сверлом высекали из листа 2 диска диаметром 1 см и гомогенизировали их в 300 мкл КФБТ. Экстракт, осветленый на центрифуге Эппендорф 10000 об/мин в течение 3 мин, анализировали в ИФА. Для выделения отбирали листья, при анализе образцов которых оптическая плотность А405 превышала 2,0 через 20 мин инкубации при 37С с субстратом (1 мл диэтаноламина, 9 мл MilliQ, 240 мкл концентрированной НС1, 2 мкл 5 М MgCl2, 10 мг п-нитрофенилфосфата, рН 9,8).
Выход АВК составлял до 5 мг вируса на 100 г свежей листовой ткани зараженных растений N.clevelandii. При анализе очищенного вирусного препарата методом электрофореза не обнаружено видимых зон никаких других белков, кроме зоны белка оболочки АВК с молекулярной массой около 32 кДа (Рис. 7).
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики неповирусов
Необходимость создания неинструментальных методов диагностики вирусных инфекций растений преимущественно для их внелабораторного применения обусловлена, как отмечалось в обзоре литературы, целым рядом причин. Одна из первых попыток такого рода была предпринята в Великобритании, когда был разработан набор для внелабораторной диагностики ХВК, SBK и YBK, основанный на принципе латекс-агглютинации (Talley et al., 1980). Этот набор содержал все необходимое для выполнения анализа в полевых условиях и позволял получать результаты за 4 - 10 мин.
В это же время нами был разработан новый метод виробактериальной агглютинации (АБВ-тест), основанный на коагглютинации вирусных частиц и клеток Staphylococcus aureus, покрытых антителами к определяемому вирусу. Иммуноглобулины сорбируются на поверхности клеток бактерий вследствие сродства Fc-фрагмента молекулы IgG к протеину А (ПрА) — белку клеточной стенки некоторых штаммов стафилококка. Доказательства такого рода взаимодействия были впервые получены при изучении связывания нормальных и миеломных иммуноглобулинов человека с очищенным ПрА (Forsgren & Sjoquist, 1966); выяснилось, что такое взаимодействие характерно и для IgG многих видов животных (Kronvall et al., 1970). К настоящему времени взаимодействие ПрА с иммуноглобулинами различных классов, подклассов и различных видов животных изучено достаточно подробно. Молекула ПрА состоит из 5 структурно родственных доменов (Е, A, D, В и С), каждый из которых способен взаимодействовать с Fc-фрагментом молекулы IgG, и С-терминального домена X, который погружен в клеточную стенку и ковалентно соединен с муреином (Moks et al., 1986; Sjodahl, 1977). Вторичная структура Fc-связывающих доменов представлена 3 антипараллельными а-спиралями, собранными в пучок. Образование комплекса IgG с ПрА опосредовано взаимодействием этого пучка с СН2- и СНЗ-доменами молекулы иммуноглобулина (Braisted & Wells, 1996; Jendeberg et al, 1996). Несмотря на то, что молекула ПрА содержит 5 потенциальных IgG-связывающих сайтов, функционально она бивалентна (возможно, из-за пространственных ограничений) и способна взаимодействовать только с 2 молекулами IgG (Yang et al., 2003). Важнейшей особенностью образовавшегося комплекса является то, что антиген-связывающая активность антител остается неизменной.
Это свойство ПрА было использовано для создания иммунодиагностических препаратов. В одних препаратах применяли непосредственно клетки непатогенных штаммов стафилококка, нагружая их антителами. Следует отметить, что ПрА локализован на поверхности клеточной стенки бактерии и доступен для Fc-фрагментов молекул IgG (DeDent et al., 2007). Его количество довольно велико: на поверхности бактериальной клетки может находиться до 80 тысяч молекул ПрА (Kronvall et al., 1970). Поскольку из всех белков сыворотки крови ПрА сорбирует только молекулы иммуноглобулинов, отпадает необходимость предварительной очистки IgG. Возможно, самой важной особенностью таких препаратов является ориентированная сорбция молекул IgG на клеточной поверхности: антиген-связывающие центры молекул антител направлены наружу и способны беспрепятственно связываться с антигеном. Таким образом, при смешивании суспензии клеток золотистого стафилококка и антисыворотки получается готовый иммунодиагностикум, область применения которого зависит от специфичности антисыворотки. В присутствии антигена клетки бактерий, нагруженные соответствующими антителами, агглютинируют, образуя видимые невооруженным глазом агрегаты, размеры и время формирования которых зависит от концентрации антигена. Впервые этот подход был реализован Кронвеллом при серотипировании штаммов пневмококков в реакции агглютинации (Kronvall, 1973) и впоследствии широко использован для определения многих других патогенных микроорганизмов.
Для получения препаратов другого рода использовали частицы полистиролового латекса, покрытые ПрА и затем антителами. Такие препараты обладали всеми вышеперечисленными свойствами антительных диагностикумов, приготовленных на основе ПрА-содержащих клеток стафилококка. В то же время, ввиду биологической инертности полистироловых гранул, они могли быть приготовлены в более контролируемых условиях и, что немаловажно, заранее быть покрыты антителами. Этот подход был использован для диагностики вирусов растений в виде т.н. PALLAS (protein A-coated latex-linked antisera) - теста (Querfurth & Paul, 1979; Torrance, 1980).
В нашей работе мы использовали подход, предложенный Кронвеллом (Kronvall, 1973). Однако методика, разработанная для серотипирования пневмококков, для диагностики вирусов не могла быть использована из-за неспецифической агглютинации суспензии стафилококка кроличьей сывороткой, как нормальной, так и иммунной (Forsgren & Forsum, 1972). Применение этого подхода для диагностики вирусов растений потребовало изменения условий приготовления иммунодиагностикума и постановки реакции агглютинации.
Растения, вирусные препараты и антисыворотки к вирусам. В работе использовали выращенные в теплице растения табака Nicotiana tabacum L. с. Самсун, зараженные ВТМ или YBK; огурца Cucumus sativus L., зараженные вирусом зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО); ячменя Hordeum vulgare L., зараженные ВМК; пшеницы Triticum aestivum L., зараженные ВШМЯ; дурмана Datura stramonium L., зараженные ХВК, и гвоздики Dianthus caryophyllus L., зараженные ВКГ. В качестве отрицательных контролей использовали здоровые растения соответствующих видов. Клубни картофеля, искусственно зараженные ХВК, SBK или смесью ХВК + SBK и SBK + YBK, а также безвирусные клубни, были предоставлены д-ром М. Weintraub (Pacific Agriculture Research Centre, Ванкувер, Канада). Кроме того, использовали растения картофеля различных сортов, естественно зараженные ХВК, SBK, МВК и YBK и выращенные во ВНИИКХ, а также растения гвоздики, промышленно выращиваемые в теплицах сельскохозяйственного производственного кооператива «Агрофирма — колхоз им. С.М.Кирова» (Московская обл.). Очищенные препараты ВЗКМО, ВМК, ВШМЯ, МВК и YBK, а также антисыворотки к этим вирусам и к SBK были предоставлены В.К.Новиковым, С.И.Малышенко (каф. вирусологии биологического факультета МГУ) и В.К.Вишниченко (ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН).
Фракцию IgG из антисывороток к ВТМ и ВЗКМО получали ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе («Sigma», США) в 0,01 М натрий-фосфатном буфере рН 8,0 (Брок, 1979). Аффинно очищенные антитела к ВТМ и ОВ-3 получали аффинной хроматографией соответствующих антисывороток на иммуносорбенте, приготовленном на основе CNBr-Сефарозы («Pharmacia») по протоколу производителя.
Культура клеток стафилококка. Культуру клеток Staphylococcus aureus непатогенного штамма Cowan 1, полученную в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, поддерживали и размножали на агаризованной среде Хоттингера (производства того же института). Микроорганизмы культивировали 5 -7 ч на скошенной агаризованной среде Хоттингера, пересевали на ту же среду в чашки Петри и культивировали 15 - 17 ч при 37С. Выращенную клеточную массу смывали с поверхности агара, трижды промывали PBS при 5000 об/мин 5 мин и после последнего центрифугирования готовили 10% (объем/объем) суспензию клеток в PBS.
