Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы 12
2.1. Реовирусные заболевания кур 12
2.1.1. Распространенность реовирусных заболеваний среди коммерческой птицы 12
2.1.2. Вирусный теносиновит 12
2.1.3. Малабсорбционный синдром 16
2.1.4. Патотипы реовируса кур 18
2.1.5. Возрастная и породная резистентность 20
2.1.6. Иммунный ответ при теносиновите и малабсорбционном синдроме 20
2.2. Эффективность вакцинопрофилактики против реовирусных инфекций 22
2.3. Методы диагностики реовирусных заболеваний и характеристика выделенных изолятов
23
2.4. Молекулярно-биологическая характеристика реовирусов рода Orthoreovirus 25
2.4.1. Краткая характеристика семейства Reoviridae 25
2.4.2. Структура вириона представителей рода Orthoreovirus 26
2.4.3. Сруктура генома ортореовирусов 29
2.4.4. Белки ортореовируса 33
2.4.5. Репликация ортореовирусов 42
2.4.6. Генетическая изменчивость реовируса 44
2.5. Выявление генома и дифференциация штаммов реовирусакур молекулярно-биологическими методами 49
2.6. Заключение по обзору литературы 52
3. Материалы и методы 56
3.1. Материалы 56
3.2. Методы 63
4. Результаты собственных исследований и их обсуждение 72
4.1. Выбор праймеров 72
4.2. Оптимизация условий проведения ОТ-ПЦР-анализа 79
4.3. Исследование патологического материала 82
4.3.1 Сравнительная диагностическая чувствительность и специфичность при исследовании патологического материала предложенными системами ОТ-ПЦР 82
4.3.2. Выявление геномов реовируса кур и М. synoviae в пробахпатологического материала 84
4.3.3. Патолого-анатомические изменения при реовирусной инфекции 87
4.3.4. Патологические агенты, ассоциированные с реовирусной инфекцией 88
4.3.5. Случаи теносиновита при отсутствии реовирусной инфекции 90
4.4. Исследование биологических свойств некоторых выявленных изолятов 90
4.5. Анализ амплифицированных последовательностей генома выявленных изолятов 97
4.5.1. Вариабельность последовательностей участков генов S3 и S1 97
4.5.2. Сравнительный анализ полных последовательностей гена S1 трех выявленных изолятов реовируса кур 101
4.5.3. Дифференциация выявленных изолятов и вакцинного штамма S1133 с помощью секвенирования последовательностей фрагментов S3A и S35 гена S3 103
4.5.4. Анализ генетических групп известных штаммов реовируса кур 105
4.5.5. Анализ генетических групп, установленных по последовательностям участков S3A и S3B гена S3 выявленных изолятов 107
4.5.6. Анализ генетических групп, установленных по последовательностям 5'-концевого фрагмента гена S1 выявленных изолятов 110
4.5.7. Сравнительный генетический анализ выявленных изолятов по последовательностям участков генов S1 и S3 112
4.5.8. Генетический анализ изолятов, выявленных на одном птицеводческом хозяйстве 115
4.5.9. Генетический анализ изолятов с определенными биологическими свойствами 116
4.6. Дифференциация изолятов реовируса кур с помощью анализа подвижности гетеродуплексов кДНК 120
5. Заключение 126
Выводы 133
- Эффективность вакцинопрофилактики против реовирусных инфекций
- Выявление генома и дифференциация штаммов реовирусакур молекулярно-биологическими методами
- Исследование патологического материала
- Анализ амплифицированных последовательностей генома выявленных изолятов
Введение к работе
Реовирусная инфекция широко распространена среди коммерческой птицы в птицеводческих хозяйств разных стран мира. Патогенные штаммы реовируса кур (РК) (род Orthoreovirus, сем. Reoviridae), как правило, ассоциированы с множеством заболеваний, экономическое значение среди которых имеют теносиновит и малабсорбционный синдром [173]. Реовирус также ассоциирован с респираторными заболеваниями, гепатитом, поражениями миокарда и перикардитом у молодых бройлеров, синдромом внезапной гибели [49,73].
Реовирусные заболевания протекают, как правило, в хронической форме. Экономический ущерб от реовирусных заболеваний обусловлен снижением прироста массы тела и отбраковкой тушек [41]. В некоторых птицеводческих хозяйствах европейских стран уменьшение прибыли по сравению с ожидаемой достигало 20% [176].
Диагностика заболеваний осложняется тем, что патолого-анатомические и клинические признаки не патогномоничны и могут вызываться другими патолого-анатомическими агентами (Mycoplasma synoviae, Staphylococcus aureus, E.coli, некоторые виды Eimeria), а также сопровождаться ассоциированной инфекцией вирусами инфекционной бурсальной болезни, анемии птиц, аденовирусами [12,73]. Как правило, ассоциированные патологические агенты усиливают проявление заболевания. Для постановки правильного диагноза необходимо выявление всего комплекса этиологических агентов при этих заболеваниях, что делает лабораторную ИФА- и ПЦР-диагностику достаточно актуальной [73].
Применение комплекса молекулярно-биологических методов обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции, секвенирования амплифицированной кДНК и анализа подвижности рестрикционных фрагментов дает возможность провести быстрое выявление генома возбудителя, дифференциацию и генотипирование выявленных изолятов реовируса кур. Комплексный ПЦР-анализ проб позволяет выявить не только геном РК, но и ассоциированные вирусные и бактериальные инфектанты. Так, предложена мультиплекс-ПЦР для одновременной детекции реовируса кур, аденовируса, вирусов инфекционной бурсальной болезни и инфекционной анемии кур [26], что облегчает постановку окончательного диагноза при подозрении на малабсорбционный синдром. Однако, несмотря на разработанные в 1990-х годах ПЦР-методы индикации генома M.synoviae [90, 179], отсутствуют сообщения о комплексном ПЦР-исследовании патолого-анатомического материала от кур с признаками теносиновита на наличие микоплазмы и реовируса.
Среди реовирусов кур существуют штаммы и изоляты, занимающие промежуточное положение между серотипами. В настоящее время некоторые авторы предполагают отсутствие устойчивых серотипов при наличии многочисленных субтипов реовирса кур [1, 2, 13, 73, 185]. Четкие серотипические отличия выявлены лишь при сравнении реовирусов разных видов птиц - реовирусов кур, индеек, водоплавающих птиц (уток и гусей) [13,73]. Этот факт значительно осложняет серологическую классификацию вирусов определенного хозяина. Сложность серотипирования связана с положением эпитопов нейтрализации вируса на разных белках внешнего капсида - они располагаются на поверхности белков сигма-С, сигма-В и лямбда-С, которые кодируются разными сегментами генома [183]. Реассортация геномных сегментов при смешанной инфекции несколькими изолятами приводит к возникновению новых субтипов [125, 126]. Задача классификации реовирусов кур может быть решена с помощью генотипирования по разным сегментам генома и установления фактов реассортации.
В отличие от зарубежных стран, в России молекулярно-биологические исследования изолятов реовируса кур не проводились, что не позволяет сделать вывод о филогенетичеких отношениях и генетическом разнообразии штаммов этого вируса персистирующих на птицефабриках РФ.
Тем не менее, результаты серологического мониторинга, проведенного в 2000 - 2002г.г. Куприяновым А.И. и Шкирей В.И. [7, 11] свидетельствуют, что реовирус распространен повсеместно на территории РФ. В каждом птицеводческом хозяйстве, где не применялась вакцина против реовируса кур, у птицы регистрируются достаточно высокие титры специфических антител, что говорит о персистенции полевого изолята в птичьем стаде.
Таким образом, совершенствование методов выявления генома и дифференциации выявленных изолятов на основе ОТ-ПЦР и секвенирования, а так же генетический анализ выявленных изолятов по разным сегментам генома являются достаточно актуальными задачами.
Цель и задачи исследования
Главная цель исследований состояла в разработке методов выявления и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР, нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов, а так же генетической характеристике выявленных на территории Российской Федерации изолятов реовируса кур.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: разработать ПЦР-методы выявления реовируса кур в различных вируссодержащих образцах; определить распространение реовируса кур в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации; оптимизировать молекулярно-биологические методы для дифференциации выявленных изолятов реовируса кур; провести анализ нуклеотидной последовательности участков высоковариабельных генов выявленных изолятов; создать банк нуклеотидных последовательностей участков генома выявленных изолятов реовируса кур.
Научная новизна исследования
Разработаны методы индикации генома реовируса кур на основе ОТ-ПЦР фрагментов генов S1 и S3.
Разработаны методы дифференциации выявленных изолятов реовируса кур на основе секвенирования амплифицированных в ОТ-ПЦР кДНК фрагментов генома.
Проведено генотипирование и определен спектр генотипических групп выявленных изолятов, циркулирующих на территории Европейской части РФ.
Создан банк нуклеотидных последовательностей участков генов S1 и S3 выявленных изолятов.
Практическая значимость исследования
Разработаны следующие методы индикации и дифференциации изолятов реовируса кур: «Методика индикации генома птичьего ортореовируса с использованием полимеразной цепной реакции» (2000г.), «Методика индикации генома и дифференциации штаммов и изолятов птичьего ортореовируса с испрользованием полимеразной цепной реакции» (2002г.), «Методические указания по выделению, титрованию и идентификации авиреовирусов птиц» (2002г.). Данные методики и методические указания одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ.
Разработанный метод выявления и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования участка гена S3 (634-878 н.) в настоящее время применяется в диагностических целях.
Предложенные методы позволили выявить геном реовируса кур в различных вируссодержащих образцах.
С помощью разработанных методов проведен анализ участков генов S1 и S3 у 61-го изолята, выявленного на территории РФ в 1999-2004г.г., 5-й изолятов, выделенных на территории Италии в 1998г., референтного штамма Fachey-Crowley и вакцинного штамма ВНИВИП-РЕО. Созданный банк полученных нуклеотидных последовательностей участков генома реовируса кур используется для генотипирования и дифференциации выявляемых изолятов.
Публикация научных работ
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.
Апробация работы
По основным результатам диссертации представлены доклады на Всероссийской научно - практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Владимир, 2000г.), Международной научно - практической конференции «Современные проблемы селекции, ветеринарной генетики и защиты животных от болезней» (Витебск, 2001г.), V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004г.).
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 177 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение выводы, практические предложения. Список литературы включает 188 источников. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 28 таблицами.
Положения, выносимые на защиту
1. Метод выявления реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР.
2. Результаты выявления реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР в пробах патолого-анатомического материала, полученного из птицеводческих хозяйств центрального федерального округа РФ.
3. Методы генетической дифференциации изолятов реовируса кур.
4. Банк данных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов S3 и S1 изолятов реовируса кур, выявленных в 1999-2004г.г. на территории РФ.
5. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов S3 и S1 изолятов реовируса кур, выявленных в 1999-2004г.г. на территории РФ. Исследования по диссертационной работе выполнены в 1999-2004г.г. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир).
Эффективность вакцинопрофилактики против реовирусных инфекций
Неэффективность вакцинации связывается в первую очередь с большим серотипическим разнообразием вируса. Так, на территории США персистируют штаммы РК как минимум трех серотипов [73]. Wood и его коллеги в 1980 году [185] среди штаммов реовируса птиц, выделенных на территории США, Великобритании, Германии и Японии, обнаружили, по крайней мере, 11 серотипов. Новые серотипы продолжают выявляться и в настоящее время. Van Loon К. в 2000 г. выделил ERS-штаммы, вызывающие исключительно MAC и принадлежащие к отдельному серотипу [174]. В настоящее время наибольшее распространение получили вакцины на основе штаммов S1133, 1733, СО-8, 2408, выделенных на территории США и принадлежащих к одному серотипу - первому американскому серотипу [73, 173]. Однако, вакцинация живыми и инактивированными вакцинами не всегда создает протективного иммунитета у птицы [78, 110]. Имеются так же сообщения о неэффективности применения вакцин на основе штаммов первого американского серотипа на территории Австралии, Израиля и европейских стран [73, 177] в связи с циркулирующими там изолятами других серотипов. Описаны случаи персистенции полевого изолята у бройлеров, несмотря на высокие титры антител к вакцинному штамму [78]. В то же время возможна значительная перекрестная нейтрализация среди гетерологичных типов. Так Robertson и Wilcox [146] сгруппировали 10 австралийских изолятов в три серогруппы со значительной перекрестной нейтрализацией. Несмотря на большое серотипическое разнообразие, вероятно, имеется много промежуточных форм, демонстрирующих перекрестную реакцию с разными серотипами и представляющих антигенные подтипы.
Методы диагностики реовирусных заболеваний и характеристика выделенных изолятов Поскольку патолого-анатомические изменения как при ТС, так и при МАС не патогномоничны, лабораторные методы, позволяющие дифференцировать реовирус от наиболее частых ассоциированный патологический агентов, являются достаточно эффективными в диагностике реовирусных заболеваний. В настоящее время для идентификации реовируса в пробах используют вирусологические методы (вирусовыделение в эмбрионах и культурах клеток, вирусную нейтрализацию), серологические методы (РДП, ИФА, метод флуоресцирующих антител) и молекулярно-биологические методы (ПЦР, секвенирование). Выделение изолятов реовируса в куриных SPF-эмбрионах при инокуляции в желточный мешок (ЖМ) или на хориоаллантоисную оболочку (ХАО) является наиболее простым и надежным способом вирусовыделения. Для первоначального выделения вируса предпочтительно заражение в желточный мешок [36, 73, 148]. Специфическая гибель эмбриона наступает через 3-6 дней после инокуляции в ЖМ или через 4-8 дней после заражения на ХАО. Из-за многочисленных кровоизлияний пораженные эмбрионы приобретают пурпурный цвет. Иногда кровоизлияния могут быть немногочисленными, на поверхности кожного покрова в области головного мозга и спины. При этом пораженные эмбрионы обычно меньше по размеру, иногда у них увеличены печень и селезенка. При невысокой эмбриональной смертности на печени и селезенке через 7 дней после инокуляции могут наблюдаться очаги некроза. На хориоаллантоисной оболочке можно обнаружить небольшие некротические бляшки. Мезодерма, находящаяся рядом с поражением, отечна и содержит большое лимфоцитов. Вирулентность изолятов для эмбрионов коррелирует с вирулентностью для суточных SPF-цыплят [54]. При заражении на ХАО или в ЖМ высоковирулентными для суточных цыплят изолятами, наблюдается ранняя гибель эмбрионов, в течение 3-5 дней, и сильные патолого-анатомические изменения эмбриона - некроз печени, многочисленные кровоизлияния по всему телу, в области головного мозга. Низковирулентные изоляты могут не вызывать гибели эмбрионов. Иногда наблюдаются мелкие петехиальные кровоизлияния в кожном покрове. В этом случае установить наличие вируса в эмбрионе можно с помощью реакции диффузионной преципитации (РДП) [1,2,3]. Выделение изолятов реовируса проводят также в первичных клеточных культурах почек, печени и фибробластов куриного SPF-эмбриона [73]. При выделении вируса на фибробластах часто необходимо многократное пассирование для вирусной адаптации. В инфицированных клеточных культурах, как правило, через 20-48 часов наблюдается образование синцитиев и дальнейшая дегенерация клеток, которая приводит к разрушению монослоя. Для идентификации реовируса при вирусовыделении, ХАО зараженных эмбрионов или зараженный монослой клеточной культуры гомогенизируют и используют в качестве антигена для постановки РДП с антиреовирусной сывороткой [148]. Куриные эмбрионы и клеточные культуры используют также в качестве тест-объектов в реакции нейтрализации при определении серотипа вируса [9,73, 123,166,185]. Экспресс-диагностика реовирусных заболеваний
Методы экспресс-диагностики можно разделить на 2 группы -выявляющие антиген и выявляющие антитела в сыворотках зараженных животных (серологические методы). Для обнаружения антигена РК достаточно часто используется ИФА (ELISA) и метод флуоресцирующих антител (флуоресцентная микроскопия) [30,53,66,67,94,107, 167]. Флуоресцентная микроскопия с применением моноклональных антител позволила выявить вирусспецифические белки в тканях зараженной птицы. Моноклональные антитела к белкам сигма-В и сигма-С реовируса кур использовались в ИФА для выявления вирусспецифических белков в суспензиях тканей в непрямом варианте. Непрямой вариант ИФА позволяет достаточно быстро оценить титры вирусспецифических антител у больной птицы. Так, в птицеводческих хозяйствах России контролируется состояние по реовирусным инфекциям с помощью ИФА [7, 11]. Несмотря на широкое распространение, иммунологические методы не позволяют изучить геном вируса, определить генетическое родство выделенных штаммов и зачастую выявить вирус в пробах с низким его содержанием, зачастую характерным для хронических инфекций. В конце прошлого века стали разрабатываться молекулярно-биологические методы индикации и генетической дифференциации реовируса [73], что стало возможным после накопления достаточного количества данных по молекулярной биологии ортореовирусов млекопитающих и птиц, а также по структуре генома реовируса птиц и изменчивости его генов. 2.4. Молекулярно-биологическая характеристика реовирусов рода Orthoreovirus 2.4.1. Краткая характеристика семейства Reoviridae Сем. Reoviridae включает 9 родов: Orthoreovirus, Rotavirus, Orbivirus, Coltivirus, Aquareovirus, Cypovirus, Fijivirus, Phytoreovirus, Oryzavirus [144]. Инфекционными для птиц являются представители двух родов -Orthoreovirus и Rotavirus. Представители рода Rotavirus вызывают энтериты и преимущественно у индеек, в то время как (орто)реовирусы птиц проявляют мультитканевую тропность и вызывают артрит, теносиновит, нефрозо-нефрит, энтерит, гепатит, миокардит, хронические респираторные заболевания у кур, индеек, уток и гусей [145]. Характерными особенностями вирусов данного семейства является двухслойная структура капсида и сегментированный двухцепочечный (дц) РНК- геном, представленный 6-12 сегментами [72].
Выявление генома и дифференциация штаммов реовирусакур молекулярно-биологическими методами
Молекулярно-биологические методы, на основе реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), являются в настоящее время перспективными методами экспресс-диагностики. ОТ-ПЦР-методы позволяют за короткий срок (5-8 часов) выявить геном вируса в разных пробах. С помощью секвенирования и анализа последовательностей кДНК фрагментов генома возможна дифференциация выявленных изолятов, что повышает информативность анализа. Первые сообщения по разработке ПЦР-методов для амплификации фрагментов генома реовируса кур были в конце 90-х годов прошлого века и связаны с секвенированием и анализом полных последовательностей сегментов S-класса [73]. Тестирование методов на препаратах разных микроорганизмов и вирусов показывает высокую специфичность предложенных систем праймеров. Для большинства этих ОТ-ПЦР-систем определена аналитическая чувствительность, которая составляет от 0,02 до 10 пг вирусной нуклеиновой кислоты. Чувствительность одного ОТ-ПЦР-метода, определенная в минимальном выявляемом инфекционном титре вируса, составила 10-10"1 ТЦД5с/мл [97]. Первые предложенные системы праймеров были выбраны на гены S1 и S3 [93, 98]. Полученные последовательности кДНК позволяли дифференцировать близкородственные изоляты. Наибольшее внимание уделялось системам ОТ-ПЦР на ген S1. С 1997 по 2004 г.г. было предложено 5 ПЦР-систем индикации генома РК с праймерами на ген S1 [81, 97, 98, 101, 186 ]. Системы были как в непрерывном (continuous), так и в простом варианте, одностадийные и двустадийные в гнездовом варианте. Предложенные системы праймеров фланкировали область третьей ОРС сегмента S1, включающую одноименный ген. Длины ПЦР-ампликонов первой стадии были 1022-1088 п.н.. На второй Nested-стадии синтезировались более короткие кДНК длиной 239, 330, 342 или 738 п.н. в зависимости от выбранных праймеров.
Описан одностадийный Continuous-OT-ПЦР-метод индикации генома РК с праймерами на ген S3 (величина ПЦР-ампликона -672 п.н.) [93]. С помощью метода были амплифицированы кДНК РК как из культуральных проб, так и из образцов тканей зараженной реовирусом птицы. Были предложены так же системы праймеров, фланкирующих полную последовательность генов S2 и S4 [99, 100]. Чувствительность данных ОТ-ПЦР-систем не оценивалась и основная задача применения предложенных праймеров - получение последовательностей генов выделенных на культуре штаммов и изолятов С помощью предложенных диагностических ОТ-ПЦР-систем были проанализированы изоляты, выделенные на территории США, Тайваня, Японии Австралии, Нидерландов и Германии. Аналитическая чувствительность методов определялась по десятикратным разведениям препаратов с известным инфекционным титром вируса или с определенной концентрацией вирусспецифической нуклеиновой кислоты. Однако, чувствительность при исследовании патолого-анатомического материала может быть гораздо ниже, ввиду возможного присутствия тканевых ПЦР-ингибиторов [25], при этом возможны так же и ложноотрицательные результаты [18]. Сравнение чувствительности при исследовании культуральных проб и клоакальных смывов на присутствие генома РК было проведено в работе Caterina К.М. et al., 2004 [26]. Различия в чувствительности отмечено не было, однако это справедливо лишь для данной методики с определенной системой выделения РНК и пробоподготовки. Таким образом, высокая достоверность результатов предложенных ПЦР-систем может быть только при исследовании культуральных проб с низким содержанием ПЦР-ингибиторов. Отсутствие внутреннего контрольного образца, позволяющего учесть ингибирование амплификации в каждой пробе позволило бы избежать ложноотрицательных результатов ПЦР и повысить достоверность исследования проб патолого-анатомического материала [40]. Каждый из предложенных методов тестировался на небольшом количестве штаммов и изолятов. Несмотря на высокую специфичность систем праймеров, предложенные методы нельзя назвать универсальными. Полученные в ПЦР кДНК анализировались с помощью секвенирования или анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). По анализу последовательностей «ДНК генов S1, S2, S3 и S4 установлено филогенетическое родство выявленных в ОТ-ПЦР изолятов [100]. Показана так же возможность изучения генетических групп с помощью ПДРФ-анализа [93, 97]. Однако, в случае мутаций за пределами рестрикционных сайтов, есть вероятность ошибок при дифференциации изолятов. Таким образом, применение анализа ПДРФ в практике позволяет увеличить скорость анализа в целом, но допускает возможность ошибок в трактовке полученных результатов. Перспективно применение других методов дифференциации кДНК - например, анализа подвижности гетеродуплексов гомологичных кДНК [172]. Метод позволяет отличить разные кДНК и учитывают замены по всей длине анализируемой последовательности. В скорости постановки данный метод не уступают ПДРФ-анализу, а отсутствие ферментативных реакций в процессе постановки делает их более доступными. Несмотря на применение этого метода для дифференциации таких птичьих патогенов как вирус Ньюкасла и гриппа, отсутствуют сообщения о применении метода при диагностике реовирусных инфекций [20, 47]. В последнее время уделяется внимание комплексному ПЦР-анализу пробы на присутствие не только генома РК, но и других вирусных ассоциированный патологический агентов.
Предложена мультиплекс-ПЦР-система для одновременной детекции реовируса кур, аденовируса, вирусов инфекционной бурсальной болезни и инфекционной анемии кур [26], что облегчает постановку окончательного диагноза. Однако, несмотря на разработанные в 1990-х годах ПЦР-методы индикации генома M.synoviae [90, 179], отсутствуют сообщения о комплексном ПЦР-исследовании патолого-анатомического материала от кур с признаками теносиновита на наличие микоплазмы и реовируса. Молекулярно биологические исследования реовирусов кур, выделенных на территории Российской Федерации ранее не проводились. 2.6 Заключение по обзору литературы Реовирусы являются широко распространенным возбудителем теносиновита, малабсорбционного синдрома и респираторных заболеваний у кур. Заболевания носят в основном хронический характер. Патолого-анатомические изменения заболеваний выражены у 3-5% поголовья. Однако, синдром малабсорбции более распространен, и количество птицы с патолого-анатомическими изменениями может достигать 20%. Патолого-анатомические изменения при реовирусной инфекции достаточно разнообразны и зависят от штамма вируса. По свойству вызывать определенные патолого-анатомические изменения штаммы относятся к нескольким патотипам - малабсорбционного синдрома, теносиновита, смешанному (совместное проявление малабсорбционного синдрома и теносиновита), респираторному и авирулентному. Развитие заболеваний протекает в несколько стадий и зависит от дозы вируса, способа заражения, возраста и породы птицы. На патогенез существенно влияет наличие ассоциированный патологический агентов вирусной и бактериальной природы. При теносиновите наиболее частыми ассоциированный патологический агентами являются Mycoplasma synoviae и Staphylococcus aureus, при синдроме малабсорбции - парвовирус, энтеровирус, калицивирус, вирус анемии цыплят, вирус Гамборо, а также E.coli, Eimeria tenella и Е. maxima. Малабсорбционный синдром обладает мультифакторной этиологией в большинстве случаев.
Как реовирус так и ассоциированный патологический агенты самостоятельно могут вызывать сходные патолого-анатомические изменения, что затрудняет диагностику заболеваний по патолого-анатомическому вскрытию больной птицы. Для постановки диагноза в данном случае необходимо точно установить наличие реовируса в пробе и выявить спектр ассоциированный патологический агентов. Поэтому, применение лабораторных методов диагностики реовирусных заболеваний наиболее актуально. Традиционная лабораторная диагностика представлена методами выделения вируса заражением куриных эмбрионов или культуры эмбриональных клеток (фибробласты, клетки печени или почек) с последующим тестированием пассированных вируссодержащих проб в РДП. Наиболее распространенные экспресс-методы лабораторной диагностики включают прямой и непрямой варианты ИФА, РДП, метод флуоресцирующих антител (флуоресцентная микроскопия). Применение методов выделения реовируса ограничено длительностью анализа постановки, а большое разнообразие серотипов реовируса кур ограничивает универсальность серологических методов.
Исследование патологического материала
При исследовании проб патологического материала, в случае выявления реовируса кур, синтезировался только специфический для реовируса кур фрагмент кДНК, что подтверждено секвенированием ампликонов. Однако, относительная диагностическая чувствительность этих систем отличается. Максимальное количество изолятов было выявлено с использованием системы праймеров PK-S3B (табл.16). Системой праймеров PK-S3A не был выявлен реовирус в 3 пробах, положительных с системой PK-S3B. Наиболее низкая диагностическая чувствительность, при сравнении результатов тестирования материала, поступившего в 2001-2002 годах, показала система PK-S1. Количество положительных результатов, полученных с помощью этой системы, составило 40% от количества положительных результатов с системой РК-S3B. Низкая диагностическая чувствительность в этом случае может быть связана с низкой консервативностью подпраймерных областей. Таким образом, система PK-S3B обладает наибольшей диагностической чувствительностью и может быть предложена для выявления генома полевых изолятов РК в патологическом материале. Система PK-S1 может быть использована как вспомогательный метод, позволяющий установить факты реассортации сегментов генома и уточненить генетическую принадлежность изолята. Однако, низкая диагностическая чувствительность существенно ограничивает ее применение. Более корректно оценить диагностическую чувствительность предложенных систем ОТ-ПЦР мы смогли после выделения 12 изолятов реовируса кур (см. гл. 4.4). С помощью каждой системы праймеров мы исследовали выделенные изоляты, а также 5 изолятов, выделенных на территории Италии. С помощью системы PK-S3B получены положительные результаты с пробами всех данных изолятов. С помощью систем PK-S3A и PK-S1 выявлялось 16 и 10 изолятов соответственно. Поэтому, для диагностических целей с 2002 года использовалась только система PK-S3B, обладающая наиболее высокой диагностической чувствительностью.
При исследовании проб патологического материала в течение 2003 года с помощью системы S3B с внутренним контрольным образцом, были получены 2 ложноотрицательных результата (9% исследованных в 2003 году проб), что не выходит за пределы ожидаемой частоты ложноотрицательных результатов и подтверждает возможность ингибирования ОТ-ПЦР при исследовании тканевых проб. Частота ложноотрицательных результатов, по литературным данным [150], как правило, находится в пределах от 1-2% до 18 % от общего количества проб. Несмотря на разнообразие причин, приводящих к ложноотрицательным результатам, мы применили общий подход для удаления ПЦР-ингибиторов из пробы и ликвидации ложноотрицательных результатов: десятикратное разбавление буфером и последующая однократная экстракция хлороформом исходной пробы перед выделением РНК и повторной постановкой ОТ-ПЦР. Среди повторно исследованных проб ложноотрицательных результатов отмечено не было. 4.3.2. Выявление генома реовируса кур и М. synoviae в пробах патологического материала Были исследованы пробы от кур-несушек и бройлеров с признаками теносиновита, кишечных заболеваний и малабсорбционного синдрома. Показано широкое распространение реовируса кур среди птицеводческих хозяйств европейской части Российской Федерации. При исследовании 151 пробы патологического материала, поступившего из 105 птицеводческих хозяйств 43 регионов РФ, геном выявлялся в 56% (84 пробы) из 58 прицеводческих хозяйств 31 региона РФ (табл.17). Анализ результатов показал, что общее количество положительных проб на реовирус и микоплазму примерно одинаково - 84 и 74 пробы. Ассоциированная инфекция реовирусом и микоплазмой встречалась достаточно часто - в 44 случаях (29% от общего количества проб). Наличие у больной птицы реовируса без ассоциированной инфекции микоплазмой установлено в 40 случаях. Инфекция микоплазмой без ассоциированной инфекции реовирусом зарегистрирована в меньшем числе случаев (32 случая), что подтверждает важную роль реовируса как этиологического агента теносиновита кур в птицеводческих хозяйствах РФ. Наибольшее число случаев при реовирусной инфекции было связано с развитием теносиновита (45 случаев). Теносиновит без сопутствующих патолого-анатомических изменений в органах брюшной полости и респираторном тракте наблюдался достаточно редко (7 случаев) и только у кур-несушек. Гораздо чаще теносиновит сопровождался патолого-анатомическими изменениями в пищеварительном и респираторном трактах, печени, почках, перикарде и бурсе (38 случаев). Значительное число случаев (39 случаев), при которых выявлялся реовирус, не было связано с развитием теносиновита. При этом наиболее часто наблюдались энтериты, нефриты, гепатиты и респираторные заболевания. Такое соотношение сопутствующих патолого-анатомических изменений соблюдается и в случае теносиновита. 4.3.4. Патологические агенты, ассоциированные с реовирусной инфекцией ПЦР-исследования патологического материала, содержащего геном реовируса кур, на присутствие дополнительных ассоциированных патологических агентов были проведены Бочковым Ю.А., Лобановым В.А., Щербаковой Л.О., Пчелкиной И.П., Ерошиной Т.В., Чернышовой Е.Н. (неопубликованный материал, ФГУ ВНИИЗЖ, Россия, г. Владимир). При исследовании птицы, реовирус кур выявлялся в 78% случаев с ассоциированный патологический агентами (табл. 18). Большинство случаев реовирусной инфекции с легкой формой теносиновита (37%) протекает без ассоциированный патологический агентов (Табл.19). При этой форме заболевания выявляют также в качестве патологического агента М. synoviae (25% случаев). Более тяжелые формы теносиновита сопровождаются, как правило, ассоциированной инфекцией М. synoviae (44% случаев), тогда как отсутствие ассоциированных патологических агентов зарегистрировано всего в 13% случаев. Возможно, заражение птицы реовирусом происходит в более раннем возрасте, для которого характерна легкая форма синовита.
Тяжелые формы заболевания развиваются в основном при наличии ассоциированной инфекции М. synoviae в более позднем возрасте. Рядом авторов также отмечалась частая ассоциированная инфекция микоплазмой и реовирусом в случае тяжелых форм теносиновита [8, 148]. 4.3.5. Случаи теносиновита при отсутствии реовирусной инфекции Для 44% от всей поступившей на исследование птицы не установлено наличие реовирусной инфекции. M.synoviae выявлена у 48% реовирус-негативной птицы. При этом в 60% данных случаев микоплазмоз сопровождался синовитом разной степени тяжести. Таким образом 13% случаев теносиновита от общего числа исследованных проб было связано с инфекцией M.synoviae без ассоциированных патологических агентов. У 23% поступившей на исследование птицы не выявлено ни M.synoviae, ни реовируса. В 96% этих случаев наблюдали остеопороз и теносиновит разной степени. В 42% этих случаев зарегистрирован колибактериоз. Зарубежными авторами было показано, что теносиновит также можно воспроизвести при заражении кур Staphylococcus aureus или Е. coli [20, 109, 139]. Нарушение пищевого и витаминного рациона может приводить к остеопорозу, деформации сустава и разрыву сухожилий, что может стать причиной артрита (теносиновита) не инфекционной природы [34, 35, 32, 33, 34]. Возможно, теносиновит у птицы, отрицательной на M.synoviae и реовирус, в данном случае имеет бактериальную этиологию. 4.4. Исследование биологических свойств некоторых выявленных изолятов Выделение изолятов на куриных SPF-эмбрионах Для исследования диагностической чувствительности всех предложенных ПЦР-методов из патологического материала было выделено 12 изолятов реовируса кур. При дальнейшем проведении генетического анализа было установлено, что выделенные изоляты принадлежали к разным генетическим группам и отличались от применяемого на территории России вакцинного штамма S1133 (см. гл. 4.5.5., 4.5.6.). При оценке патолого-анатомических изменений в эмбрионе и на ХАО все изоляты вызывали мелкие кровоизлияния на поверхности тела эмбриона. В случае специфической гибели, кроме мелких кровоизлияний, наблюдали некроз печени, кровоизлияния в тканях головного мозга или крупные кровоизлияния в мышцах и кожных покровах эмбриона. Три изолята (04/01, 16/01 и 13/02) не вызывали гибели эмбриона (табл.20).
Анализ амплифицированных последовательностей генома выявленных изолятов
Анализировались последовательности кДНК фрагментов генов S1 и S3 реовируса кур, полученные в системах ОТ-ПЦР PK-S3A, PK-S3B, PK-S3B-ВКО, PK-S1. Для анализа генетической вариабельности сегмента S1 некоторых выявленных изолятов, секвенировали 5 -концевой фрагмент кДНК гена S1 (300 н.) (см. прил. 5). Установлено, что вариабельность фрагментов кДНК гена S1 выявленных изолятов гораздо выше, чем кДНК фрагментов гена S3. Этот факт согласуется с литературными данными по изучению генов известных штаммов реовируса кур, выделенных на территории США, Тайваня, Японии, Австралии и Европы. Максимальный уровень нуклеотидных отличий составлял 59,4%. Количество отличий аминокислотных последовательностей при этом достигало 75%. Ввиду высокой вариабельности вируса, достаточно сложно выделить отдельные генетические группы изолятов (рис.22). Количество синонимических замен в последовательностях 5 -фрагментов кДНК (300 н.) гена S1 было примерно одинаковым с количеством значимых замен. Дендрограммы, построенные по нуклеотидным последовательностям 5 -концевого фрагмента (150 н.) (рис.22) и соответствующим им аминокислотным последовательностям не имели существенных отличий. При анализе аминокислотных последовательностей (100 а.к.) (см.прил. 6, 8), высокая консервативность сохранялась только у 4 5 -концевых аминокислот (I..GDL), соответствующих участку якорной (пьедестальной) области белка сигма-С. В консервативных гидрофобных позициях 1 и 4 гептадных повторов остальной части последовательности, необходимых для образования альфа-спиральной структуры хвостового домена белка, наблюдались гидрофобные замены. Остальные позиции аминокислотной последовательности были высоковариабельны. Высокая вариабельность аминокислотных позиций на данном участке связана, как отмечено ранее, с отсутствием существенных ограничений изменчивости в структуре хвостового домена сигма-С, участок которого кодируют секвенированные 5 -фрагменты.
Для анализа генетической вариабельности нуклеотидных последовательностей сегмента S3 выявленных изолятов, были секвенированы кДНК фрагментов S3A и S3B. Ввиду более высокой консервативности белка сигма-В большинство замен (70-80%) в последовательностях кДНК этих фрагментов являлись синонимическими и не приводили к аминокислотным заменам (см. прил.1,3). Дендрограммы, построенные по аминокислотным и нуклеотидным последовательностям ПЦР-ампликонов гена S3 имеют существенные отличия. Максимальные отличия последовательностей «ДНК ампликонов S3A и S3B имеют близкие значения и составляют 21,4 и 24,3% соответственно. Вариабельность нуклеотидных позиций в последовательностях данных ампликонов большинства выявленных изолятов так же близка. Сравнительный анализ профилей вариабельности демонстрирует гораздо большую вариабельность аминокислотных последовательностей, соответствующих фрагменту S3B (рис.15). При анализе вариабельности позиций аминокислотных последовательностей соответствующих фрагментам S3A и S3B (см. прил. 2, 4) не было установлено замен, изменяющих профиль гидрофобности (рис.16). Однако, на вторичную и третичную структуру белка в данных регионах могут оказывать влияние пролиновые замены, так как включение пролина существенно изменяет ориентацию соседних аминокислот. Аминокислотная последовательность, соответствующая ампликону S3A, аналогична N-концевому участку белка сигма-3 реовирусов млекопитающих (рис.17). Этот участок формирует часть малой структурной доли данного белка (рис.3), тесно взаимодействующей с белками внешнего капсида мю-1 и сигма-3. Таким образом, данный регион испытывает существенные структурные ограничения, что определяет его консервативность. С помощью праймеров ARVS1-F302 и ARVS1-R1608 методом прямого секвенирования амплифицированных кДНК были полностью отсеквенированы ампликоны изолятов 04/02, 07/02, 10/02, выявленных в 2002 году. Таким образом, была получена полная последовательность гена S1 данных изолятов (см. прил. 7). Размер гена у всех трех изолятов оказался одинаковый - 975 н., что на один триплет короче гена S1 штаммов, выделенных на территории США, Тайваня, Японии, Германии и Нидерландов (978 н.). При анализе аминокислотной последовательности белка сигма-С (см. прил. 8) данных изолятов была установлено относительно высокое сходство данного белка со штаммами, представленными в GenBank, на участке 1 пьедестального гидрофобного N-концевого региона (1-30 а.к., 80-87% сходства со штаммом S1133) и С-концевого апикального домена прикрепления (200-329 а.к., 50-64% сходства со штаммом S1133). Относительная консервативность N-концевого региона у штаммов реовируса была показана ранее и связана со структурными ограничениями, необходимыми для интеграции с апикальным регионом белка лямбда-2 на поверхности внешнего капсида.
Структурные ограничения, поддерживающие консервативность апикального домена, связаны с наличием на латеральной поверхности апикальной глобулы сайтов связывания со структурами клеточной мембраны. За счет этих сайтов осуществляется прикрепление вируса к клеточной мембране. Наиболее вариабельный регион белка сигма-С (30-199 а.к., 17-20% сходства выявленных изолятов со штаммом S1133) захватывает хвостовые альфа- и бета-структурные домены, которые обладают наибольшей вариабельностью первичной структуры. В этом регионе отмечены делеции у изолята 07/02 в позициях 44 и 96-98 а.к., у изолятов 04/02 и 10/02 в позициях 36 и 53-55 а.к. Кроме того, выявлены вставки двух аминокислот в позициях 112-113 и одной в позиции 151 в последовательностях всех трех изолятов. Таким образом, описанные аминокислотные последовательности длиннее на одно звено по сравнению с ранее описанными последовательностями в базе данных GenBank. В целом данные изоляты отличались на 45-48% от штамма S1133 по гену S1 и на 59-69% по белку сигма-С. Наиболее близкие изоляты 04/02 и 10/02 обладали 16% отличий по гену S1 и 30% по белку сигма-С. Изолят 07/02 отличался от остальных двух изолятов на 39-40% по гену S1 и 68-69% по белку сигма-С. Установлено высокое сходство профиля гидрофобности Н домена (220-329 а.к.), и Т1 домена (1-40 а.к.) (рис. 18), в то время как вариабельность гидрофобных позиций хвостового домена (40-180 а.к.) была значительно выше. Однако, соблюдается консервативность 1 и 4 позиций гептадных повторов, 3, 5, 7 позиции N-концевого тяжа бета-повтора и 3, 5 1 позиции бета-повтора, достаточных для сохранения функциональной спиральной структуры на данном регионе. При сравнении последовательностей вЗБ-ампликонов все выявленные изоляты генетически отличались от применяемого в птицеводческих хозяйствах РФ вакцинного штамма S1133. Уровень отличий изолятов от данного штамма составлял 8,5-19% (рис.21). Однако, в системе S3A РФ-изоляты формируют две группы - близкую к вакцинному штамму (0-1,5% отличий) и отличающуюся от вакцинного штамма (11-15% отличий) (рис.20, табл.25). Для проведения генетического сравнения изолятов 11/01, 01/00, 05/00, идентичных штамму S1133 в системе S3A, проведена двухстадийная амплификация кДНК участка гена S3 с гибридной системой праймеров ARVS3-F8, ARVS3-R928 (внешняя пара) и ARVS3-F40, ARVS3-R878 (внутренняя пара). При анализе последовательности ампликонов ARVS3- F40-R878 (838 п.н.) указанных изолятов были выявлены существенные отличия от полученных ранее ЭЗА-последовательностей в соответствующем участке. Последовательности подпраймерных областей обратных (R) праймеров системы S3A содержали от 1 до 5 замен, что делает сродство праймеров S3A к кДНК полевого изолята более низким, чем к кДНК S1133 (табл.26).
