Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
ГЛАВА I. ИСТОРИЯ ВОПРОСА И ПРЕДМЕТ ОБСУЖДЕНИЯ
ГЛАВА II. СТРУКТУРА И МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСОВ КАК ОСНОВА ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ 18
ГЛАВА III. ИДИНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ МЕТОДОМ НЕГАТИВНОГО КОНТРАСТИРОВАНИЯ 26
3.1.0. Технические основы негативного контрастирования. Способы подготовки материала. 26
3.2.0. Выявление и идентификация вирусов методом негативного контрастирования зі
ГЛАВА ІV. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ 35
4.1.0. Иммуноэлектронная-микроскопия вирусных суспензий 35
4.1.1. Антигены и антисыворотки 36
4.1.2. Прямой метод иммуноэлектронной микроскопии 37
4.1.3. Методы иммуноэлектронной микроскопии с использованием техники фильтрации в агар 39
4.1.4. Методы иммуносорбентной электронной микроскопии 41
4.1.5. Техника декорирования 42
4.1.6. Применение ИЭМ в вирусологии 44
4.2.0. Иммуноэлектронномикроскопическое выявление внутриклеточных антигенов 46
ГЛАВА V. ВЫЯВЛЕНИЕ И ВДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ МЕТОДОМ УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗОВ 51
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 57
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 61
ГЛАВА VІ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 62
6.1.0. Метод негативного контрастирования 62
6.1.1. Контрастирующие вещества 62
6.1.2. Способы негативного контрастирования препаратов 62
6.1.3. Подготовка материала для анализа методом негативного контрастирования 64
6.2.0. методы иммуноэлектронной микроскопии 66
6.2.1. Прямой метод иммуноэлектронной микроскоп ПИИ 66
6.2.2. Методы иммуноэлектронной микроскопии с использованием техники фильтрации в агар 67
6.2.3. Метод иммуносорбентной микроскопии . 68
6.2.4. Техника декодирования 68
6.2.5. Способ иммуноэлектронномикроскопической индикации внутриклеточного вируса .69
6.2.6. Оценка результатов иммуноэлектронномикро-скопических исследований 72
6.3.0. Фиксация, обезвоживание, заливочные материалы, приготовление и контрастирование ультратонких срезов 74
6.4.0. Способ ускоренной заливки 75
6.5.0. Методы плоскопараллельных заливок 76
6.6.0. Иммунопероксидазный метод выявления внутри клеточных антигенов 77
6.7.0. Метод электронной микроскопии с применением флуоресцирующих антител 78
6.8.0. Микроскопирование, фотоматериалы и техника фоторабот. Статистическая обработка мате риалов 79
ГЛАВА VII. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ЦДЕНТИФИКАІЩ ГЕРПЕСВЙРУСОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ 80
7.1.0. Морфогенез вируса простого герпеса (тип I и 2) в клетках VERO 82
7.2.0. Электронномикроскопическая идентификация вируса герпеса при острых менингоэнцефалитах 88
7.3.0. Электронно-микроскопическое изучение материалов при экспериментальной герпетической инфекции гениталий мышей и рака шейки матки человека 92
7.4.0. Заключение 93
ГЛАВА VIII. ВЫЯВЛЕНИЕ, ВДЕНТИФИКАЦИЯ, МОРФОЛОГИЯ И МОРФО
ГЕНЕЗ РОТАВИРУСОВ 95
8.1.0. Вирусологическое и серологическое изучение случаев ротавирусных гастроэнтеритов 97
8.2.0. Иммуноэлектронномикроскопические исследования наличия и количества антител 100
8.3.0. Сравнительное изучение различных электронно-микроскопических методов выявления ротави-русов 104
8.3.1. Сравнение двух методов прямого электронно -микроскопического выявления ротавирусов в негативноконтрастированных препаратах 105
8.3.2. Сравнение эффективности выявления ротавирусов методами прямой и иммуноэлектронной микроскопии 108
8.3.3. Сравнение чувствительности различных вариантов метода иммуноэлектронной микроскопии с использованием техники фильтрации в агар.. Иммуносорбентная электронная микроскопия НО
8.4.0. Морфология и антигенная специфичность рота вирусов. Их дифференциация от других вирусов и структур, присутствующих в фекальном материале 115
8.5.0. Электронномикроскопический анализ материалов от больных при вспышках и спорадических случаях небактериального гастроэнтерита 124
8.6.0. Выделение и пассирование ротавируса человека в культуре клеток. Электронномикроскопический контроль размножения ротавируса в клеточной культуре 131
8.7.0. Морфогенез ротавируса человека в культуре клеток . 136
8.8.0. Морфологическая дифференциация ротавирусов от рео- и орбивирусов 148
8.9.0. Заключение 152
ГЛАВА IX. МОРФОЛОГИЯ, МОРФОГЕНЕЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ СЕМЕЙСТВА ТСКШГПШАЕ 154
9.1.0. Строение и основные морфологические проявления репродукции вируса клещевого энцефалита в культуре клеток млекопитающих и ЩС экспериментальных животных , 156
9.2.0. Иммуноэлектронномикроскопический анализ штаммов вируса клещевого энцефалита 169
9.3.0. Изучение антигенных взаимосвязей вирусов японского энцефалита, Западного Нила и
клона 41/ЗН+ЯЭ+ методом иммуноэлектронноймикроскопии 174
9.4.0. Электронномикроскопическое изучение первичной культуры мышиных фибробластов при заражении вирусом Синдбис в условиях моно- и смешанной инфекции 177
9.5.0. Морфологические проявления репродукции то-гавирусов в культуре клеток комаров 181
9.5.1. Изучение альфавирусной инфекции в культуре комариных клеток 183
9.5.2. Изучение флавивирусной инфекции (вирус Западного Нила) в культуре комариных клеток. 188
9.5.3. Электронномикроскопическое изучение культуры клеток комара при смешанной инфекции вирусами Гета и Западного Нила 192
9.6.0. Морфология и морфогенез вируса краснухи в клетках тканевых культур 195
9.6.1. Ультраструктура клеток вк-15 , инфицированных вирусом краснухи 196
9.6.2. Ультраструктура клеток BHK-2I, инфициро -ванных вирусом краснухи 203
9.6.3. Ультраструктура клеток VERO , инфицированных вирусом краснухи 209
9.7.0. Заключение 215
ГЛАВА X. ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПЙЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МОРФОГЕНЕ ЗА ВИРУСА КОРИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ЦИТОПАТО-ГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ 217
Заключение 228
ГЛАВА XI. МОРФОЛОГИЯ, МОРФОГЕНЕЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУ СА БЕШЕНСТВА 230
11.1.. Морфологические проявления рабической инфекции в клеточной культуре 232
11.1.1. Морфология и морфогенез фиксированного вируса бешенства в культуре клеток почки сирийского хомяка 232
11.1.2. Влияние длительных серийных пассажей в культуре клеток на структуру и морфогенез фиксированного вируса бешенства 239
11.2.0. Морфологические проявления рабической инфекции в клетках центральной нервной системы экспериментальных животных 244
11.2.1. Ультраструктурные изменения в ЦНС животных при острой рабической инфекции 244
11.2.2. Морфологические особенности репродукции уличного вируса бешенства в ЦНС белых мышей при хронической форме рабической инфекции 252
II.3.0. Морфологическая идентификация штаммов вируса бешенства, выделенных в природных
очагах бешенства 261
II.4.0. Заключение 265
ГЛАВА ХII. ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ВДЕНТИФИКАЦИЯ, СТРУКТУРА И МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСОВ СЕМЕЙСТВА BUNYAVIMDAE 269
12.1. Морфология и морфогенез вируса крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) 270
12.2. Электронномикроскопическое изучение морфологии и морфогенеза вируса Дхори 279
12.3. Заключение 282
ГЛАВА ХIII. ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛО ГИИ И РАЗМНОЖЕНИЯ АРЕНАВИРУСОВ В КЛЕТОЧНЫХКУЛЬТУРАХ 1
1З.1, Электронномикроскопическое изучение размножения аренавирусов в культуре клеток 6619 286
13.2. Структура и морфогенез вируса Амапари в клетках VER0 291
13.3. Сравнительное электронномикроскопическое изучение штаммов вируса хориоэнцефалита и лимфоцитарного хориоменингита 300
13.4. Электронномикроскопическое изучение вируса ЛХМ, выделенного из крови больного 303
13.5. Иммуноэлектронномикроскопическое изучение антигенных взаимосвязей аренавирусов 308
13.6. Заключение 311
ГЛАВА ХІV. ВЫЯВЛЕНИЕ И ВДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А 313
14.1. Характеристика вирусоподобных частиц из фекалий больных гепатитом типа А 315
14.2. Количественное определение антител с помощью метода иммуноэлектронной микроскопии 319
14.3. Использование техники иммуноэлектронной микроскопии при изучении экспериментальной гепатитной А инфекции у шимпанзе 323
14.4. Сравнительная эффективность различных вариантов метода иммуноэлектронной микроскопии при выявлении вируса гепатита А . 326
14.5. Обследование больных инфекционным гепатитом с применением иммуноэлектронномикроскопического метода обнаружения вируса 329
14.6. Заключение 332
ГЛАВА ХV. ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ВДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ 333
ОБСЩЕНИЕ 349
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 369
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 378
- ИСТОРИЯ ВОПРОСА И ПРЕДМЕТ ОБСУЖДЕНИЯ
- СТРУКТУРА И МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСОВ КАК ОСНОВА ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ
- Метод негативного контрастирования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Прогресс вирусологии последних трех десятилетий в значительной мере связан с усовершенствованием методов исследований и внедрением новой техники. Среди них одно из первых мест принадлежит электронной микроскопии, с по -мощью которой исследуется макромолекулярное строение вирусов и их компонентов, морфогенез вирусов и ультраструктура пора -женных ими клеток. Электронномикроскопические данные являются основой современной системы таксономии и классификации вирусов.
Важнейшее значение приобрела в последние годы электронная микроскопия как метод идентификации вирусов и диагностики вирусных инфекций. Интенсивное развитие этого направления стало возможным благодаря накоплению знаний о морфологии вирусов, совершенствованию препаративной техники, доступности высокоразрешающих электронных микроскопов для более широкого круга лабо -раторий.
Преимущества морфологической идентификации вирусов заключаются, прежде всего, в быстроте и относительной простоте проведения диагностической работы. Идентификация вирусов с ис -пользованием электронной микроскопии может быть осуществлена в ряде случаев в течение 30-40 мин., в то время как примене -ние других методов ускоренной диагностики, не говоря уже о стандартных процедурах выделения вируса в биологических системах, требует, как минимум, в несколько раз большего времени.
Активное использование элентронномикроскопических методов идентификации вирусов обусловило новый качественный скачок теоретической и практической вирусологии, способствовало обогащению и расширению ее диагностических возможностей, открытию ряда новых групп вирусов. Особо впечатляющие успехи были достигнуты при выявлении этиологических агентов вирусных гепатитов, небактериальных гастроэнтеритов, некоторых других вирусных заболеваний /147, 187, 191/.
Основанная на практическом использовании электронной микроскопии серия блестящих достижений вирусологии последнего десятилетия вызвала широкий интерес к различным прикладным аспектам электронномикроскопического анализа. К настоящему времени стало совершенно очевидно, что электронномикроскопи-ческая диагностика вирусных инфекций - это не плод кратко -временного увлечения отдельных специалистов, а большая и серьезная проблема, и что возможности электронной микроскопии далеко не исчерпываются ее первоначальными областями применения. Об этом убедительно свидетельствуют многочисленные доклады на международных симпозиумах и конгрессах, нарастающее число публикаций и обзоров по этому вопросу / 65, 66, 102, 114, 144, 160-162, 188, 199, 221, 239, 248, 261, 295, 382, 404 /, внимание к нему со стороны Всемирной организации здравоохранения /279, 350/.
Все вышеизложенное говорит об актуальности темы данной работы и о том, что она связана с одной из основных проблем вирусологии - проблемой выявления и идентификации вирусов.
Цель работы состояла в том, чтобы всесторонне рассмотреть и проанализировать возможности применения электронной микро -скопии в целях идентификации вирусов и диагностики вирусных инфекций, изучить необходимые для этого структурно-морфогене-тические особенности различных групп вирусов, исследовать воз- можные пути повышения эффективности электронномикроскопичес-ких методов их выявления.
В задачи работы входило:
Изучение структуры и морфогенеза отдельных вирусов позвоночных, относящихся к семействам Herpesviridae, Reo-viridae, Togaviridae, Faramyxoviridae, Bhabdoviridae, Bu~ nyaviridae И Arenaviridae.
Проведение сравнительных исследований по эффективное -ти различных электронномикроскопических методов выявления вирусов в экспериментальных и клинических материалах.
Электронномикроскопическое изучение материалов от больных на содержание вирусов при вспышках и спорадических случаях острого небактериального гастроэнтерита, инфекционного гепатита и некоторых других вирусных заболеваний.
Морфологическая идентификация ряда вновь выделенных или неклассифицированных вирусов, а также вирусов-контаминантов клеточных культур.
Изучение возможностей электронной микроскопии в целях титрования антител в сыворотках больных и реконвалесцентов.
Изучение возможностей электронной микроскопии при анализе антигенных взаимосвязей близкородственных вирусов.
Разработка новых методов электронномикроскопического изучения вирусов, расширяющих возможности их морфологической идентификации.
Научная новизна работы и положения, которые выносятся на защиту
В работе на основе обширных экспериментальных данных на -учно обоснованы возможности и доказана эффективность применения электронномикроскопических методов исследования в целях - II - ускоренного выявления вирусов и быстрой диагностики вирусных инфекций, определены основные структурно-морфогенетические критерии, способствующие надежности и морфологической идеи -тификации различных вирусов человека и животных, выработаны рекомендации по электронномикроскопическому обследованию материалов в целях обнаружения вирусов.
В процессе исследований выявлена роль ротавирусов в этиологии небактериальных гастроэнтеритов, регистрируемых спорадически или в виде вспышек в различных районах СССР. Впервые получены визуальные доказательства эффективной репродукции ротавируса человека в клеточной культуре и определены наиболее важные факторы, влияющие на первичное инфицирование культуры и серийное пассирование вируса.
Показана высокая эффективность, чувствительность и вое -производимость метода иммуноэлектронной микроскопии при индикации вируса гепатита А в экспериментальных и клинических материалах, в том числе при массовом обследовании материалов от больных инфекционным гепатитом.
Впервые осуществлена морфологическая идентификация и оп -ределено таксономическое положение вирусов крымской геморрагической лихорадки, Дхори, геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
С помощью электронномикроскопических методов идентифицированы вирусы, присутствующие в различных экспериментальных, клинических или патологоанатомических материалах; в ряде случаев установлена их этиологическая роль при тех или иных заболеваниях.
Получены новые данные об особенностях структуры и морфоге- неза вирусов, зависящих от типа клетки-хозяина, штаммовых вариаций или степени адаптации вируса к клеточной системе.
Впервые показана возможность использования техники иммуно-электронной микроскопии для титрования антител в сыворотках больных и переболевших ротавирусным гастроэнтеритом и гепатитом А, а также при дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита, изучения антигенных взаимосвязей близкородствен -ных флави- и аренавирусов, антигенной структуры ротавирусов.
Разработан ряд новых методов и технических приемов, расширяющих возможности морфологической идентификации вирусов.
Научно-практическая ценность работы
Полученные в работе данные экспериментально обосновывают и конкретно развивают представления о роли и значении электронной микроскопии в вирусологической диагностике.
Полученные данные расширяют наши знания о структуре и морфогенезе вирусов, что способствует дальнейшей разработке во -просов их таксономии и систематики, а также идентификации новых изолятов и диагностики вирусных инфекций.
На основании проведенных исследований сделаны следующие практические рекомендации (внедрения), направленные на расширение, ускорение и обеспечение надежности вирусологической диагностики или совершенствование методов изучения вирусов.
Предложены методы морфологической идентификации ротавируса в материалах от больных и в клеточных культурах (Методические рекомендации, М., МЗ СССР, 1981; Вопросы вирусологии, 1981; Демонстрация на ВДХ СССР, 1982),
Разработан и предложен метод иммуноэлектронномикроскопи -ческой индикации внутриклеточного вируса (Авторское свиде - - ІЗ - тельство № 840102; Методические рекомендации, М., Щ СССР, 1981; Акты использования изобретения, 1981, 1982).
Разработан метод иммуноэлектронномикроскопического титрования антител в сыворотках больных и реконвалесцентов (Вопросы вирусологии, 1979).
Рекомендовано широкое применение методов электронной микроскопии при обследовании клинических и экспериментальных материалов на содержание вирусов (Итоги науки и техники, М., 1980; Вопросы вирусологии, 1982).
В процессе исследований использованы также разработанные нами способ электронной микроскопии с применением флуоресцирующих антител (Авторское свидетельство № 198543) и способ очистки и концентрации вирусов путем фильтрации через ядерные фильтры (Авторское свидетельство № 520778).
Материалы исследований включены в программу лекций на кафедре вирусологии Центрального института усовершенствования врачей (Акт о внедрении, 1984).
Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных эн -цефалитов АМН СССР в 1969-1983 гг.
Выражаю глубокую благодарность дирекции и сотрудникам института за постоянную поддержку, заинтересованность и дея -тельное содействие в проведении исследований.
ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
История вопроса и предмет обсуждения
В сущности вся история электронномикроскопического изучения вирусов в той или иной степени была связана с проблемой их выявления и идентификации. Уже ранние исследования сороковых и начала пятидесятых годов, выполненные с использованием метода напыления металлами, показали исключительное постоян -ство размеров тех или иных вирусов. Было показано также, что вирусы обладают характерной формой частиц - сферической, палочковидной или кирпичеобразной. Несмотря на то, что метод напыления металлами обеспечивал получение лишь приближенного трехмерного изображения объекта в электронном микроскопе, установленные с его помощью данные создали основу для морфоло -гической дифференциации отдельных групп вирусов. К этому периоду относятся и первые попытки практического использования электронной микроскопии в целях определения этиологии кожных высыпаний при оспе, вакцине или ветрянке /315, 362/.
Разработка техники ультратонких срезов позволила использовать для идентификации вирусов не только данные о форме и размерах частиц, но и сведения об их внутренней организации и, что наиболее важно, морфологических особенностях внутриклеточного развития вирусов. Этот подход был впоследствии значительно расширен за счет использования антител, меченых ферри-тином /299, 359/, усовершенствованных методов цитохимического изучения вирусов в ультратонких срезах /ЮЗ/, техники элек -тронной авто радиографии.
С помощью техники ультратонких срезов за последние 20 лет проведена успешная идентификация самых разнообразных вирусов. Кроме определения их таксономического положения такая идеи - 16 тификация имела в ряде случаев принципиально важное значение для выбора методологии лабораторных исследований, разработки методов контроля или поиска резервуаров инфекции. Достаточно отметить работы по электронномикроскопическому изучению вирусов sv-4-O /198/, лимфоцитарного хориоменингита /301/, Марбург и Эбола /71, 166, 246, 340/, лихорадки Лаоса /257/, ряда арбо- и рабдовирусов /14, 308/, вирусов-контаминантов клеточных культур /72/, случаев смешанных инфекций /31/.
Огромную роль в электронной микроскопии вирусов сыграло применение методики негативного контрастирования /108/, благодаря которой стало возможным судить не только о внешней форме вирусных частиц, но и непосредственно наблюдать их организацию. В результате интенсивных исследований первой по -ловины шестидесятых годов удалось получить сведения о структуре большинства известных к тому времени вирусов. Было показано упорядоченное строение отдельных компонентов вирионов, для многих из них установлено наличие в капсиде строго определенного числа субъединиц, организованных согласно принципам спиральной или кубической симметрии. Все это позволило использовать данные о структуре вирионов в качестве одного из основных критериев для таксономического подразделения вирусов. Разработанные на этой основе классификации вирусов в значительной мере облегчили проблему их идентификации, что, в свою очередь, стимулировало проведение серий работ по использованию электронной микроскопии в диагностической вирусологии /83, 99, 137, 147, 153, 191, 192, 314, 341, 349/.
Структура и морфогенез вирусов как основа их выявления и идентификации
В качестве критериев для таксономического подразделения вирусов в современной классификации /286/ приняты физико-химические и морфологические свойства вирионов и их компонентов: тип нуклеиновой кислоты, форма и размеры вирусных частиц, симметрия и параметры капсида, наличие или отсутствие липопроте - 19 идной (суперкапсидной) оболочки. Поскольку структура вириона является специфическим признаком каждой группы вирусов их предварительная идентификация, т.е. определение групповой принадлежности, возможно на основании изучения морфологии ви-рионов, выявляемых при электронномикроскопическом анализе негативно- контрастированных препаратов, либо ультратонких срезов инфицированных клеток. В последнем случае идентификации вируса способствует также исследование особенностей его морфогенеза.
В табл. I приведены данные о свойствах вирионов основных групп вирусов позвоночных. Из этой таблицы видно, что, несмотря на разнообразие размеров и формы вирионов, все они могут быть разделены с морфологической точки зрения на три основные группы: вирусы со спиральной или кубической (икосаэдральной) симметрией и сложноорганизованные вирусы с комбинированным типом симметрии. Симметрия отражает характер строения нуклеокап-сида, точнее его белковой части - капсида. В свою очередь нук-леокапсид ряда вирусов может быть заключен в дополнительную су-перкапсидную оболочку, наличие и характер строения которой служат определенным морфологическим критерием при идентификации.
Как видно из табл.1 группу так называемых суперкапсидных вирусов составляют некоторые ДНК-содержашие вирусы (вирусы группы оспы и герпеса), а также практически все крупные РНК--содержащие вирусы, за исключением реовирусов. Суперкапсидная оболочка, окружающая нуклеокапсид, представляет собой много -слойное образование и ее строение в принципе сходно у всех вирусов. Структурным каркасом оболочки служит двойной липидный слой, являющийся дериватом мембраны клетки-хозяина. Ее внешний белковый слой составляют гликопротеиды, организованные в характерные пепломеры. При изучении в ультратонких срезах этот слой обычно выглядит в виде диффузного образования, покрывающего трехслойную мембрану, но часто имеет и отчетливую границу, отражая, по-видимому, форму и плотность расположения отдельных пепломеров. Их общая морфология достаточно хорошо выявляется при негативном контрастировании. Пепломеры имеют булавовидную или палочковидную форму, а их длина у большинства суперкапсидных вирусов варьирует в пределах 8-12 нм. йс -ключение составляют лишь коронавирусы, длина пепломеров которых достигает величины порядка 20-25 нм /134/, что является характерной морфологической особенностью вирионов этого се -мейства. Ряд наблюдений указывает на вероятность регулярного расположения пепломеров на поверхности вирусной частицы /81, 180, 436/. Как правило пепломеры группируются на поверхности вириона в гексонно- пентонных кластерах, образуя икосаэдраль-ную решетку с Т=4 у альфавирусов /180/ или, например, Т=І2 у некоторых буньявирусов /436/, Тем не менее, картины регуляр -ной организации пепломеров встречаются большей частью спора -дически и, обычно, лишь на отдельных фрагментах поверхности вириона. Отмечалось, что более четкое выявление симметричной укладки пепломеров имеет место после предварительной фиксации вируса глютаральдегидом /436/. Однако, этот вывод вряд ли применим по отношению ко всем суперкапсидным вирусам.
Метод негативного контрастирования
Фосфорновольфрамовую кислоту использовали в виде 2-4% водного раствора, доведенного до рН 6,7-6,8 с помощью ш КОН /204/. Уксуснокислый уранил (уранил ацетат) применялся в виде 0,5-2% водного раствора с рН около 4,5 /426/. В некоторых случаях для контрастирования использовали 1% вод -ный раствор муравьинокислого уранила (уранил формиата) /259/, а также 1% растворы уранил ацетата или уранил формиата на 70 метаноле /23/.
Капельный способ использовался в двух основных модификациях. Выбор той или иной из них зависел от концентрации и объема вируссодержащей суспензии. При относительно низкой концентрации и наличии небольших объемов контрастирование проводилось следующим образом: на сетку, покрытую формваруг-леродной пленкой-подложкой, наносилась капля вируссодержащей суспензии (капля объемом 2-5 мкл обычно достаточна для по -крытия стандартной сетки диаметром 3 мм). После адсорбции в течение 1-Ю мин. избыток жидкости удаляли увлажненной дистиллированной водой фильтровальной бумагой, с тем чтобы предотвратить быстрое подсушивание препарата и обеспечить последующее оптимальное контрастирование объекта. В случае необходимости отмывки препарата от нелетучих соединений (солей или сахарозы) сетка помещалась затем на каплю дистиллированной воды. Избыток жидкости удаляли, как описано выше, фильтровальной бумагой. После этого на сетку наносилась капля раствора контрастирующего вещества, спустя 30-40 сек. избыток влаги удаляли фильтровальной бумагой и сетки высушивали.
Согласно другой модификации капельного способа на пред -метном стекле смешивались равные объемы вируссодержащей суспензии и раствора контрастирующего вещества. Каплю полученной смеси наносили на сетку, спустя I мин. удаляли избыток влаги фильтровальной бумагой и высушивали.
Способ флотации был более удобен в тех случаях, когда была желательна промежуточная промывка препарата. Каплю исследуемой жидкости наносили на парафинированную бумагу. На каплю пленкой-подложкой вниз накладывали сетку. После соответствую - 64 щего периода адсорбции (обычно 3-15 мин.) сетку переносили на каплю контрастирующего раствора. При этом различные нелетучие соединения диффундировали в относительно большой объем капли раствора. В случае большой концентрации солей или сахарозы сетку помещали сначала на каплю дистиллированной воды. Избыток влаги удаляли как обычно фильтровальной бумагой и высушивали.
В целях уменьшения гидрофобности пленок-подложек использовали их предварительное смачивание 0,5% раствором бычьего сывороточного альбумина или раствором бацитрацина /202, 424/.
