Введение к работе
Актуальность темы
Гепатит В (ГВ) представляет собой важнейшую медико-социальную проблему мирового здравоохранения. Считается, что ВГВ-инфекцию перенесли более 2 млрд. человек, при этом около 350 млн. имеют хронический гепатит В (ХГВ). До половины хронически инфицированных лиц погибают от таких осложнений заболевания, как печеночная недостаточность, цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) [Шахгильдян И.В, Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Проблема ГВ актуальна и для Российской Федерации, имеющей регионы, эндемичные по ВГВ-инфекции. Высокий уровень заболеваемости, возможность хронизации инфекции, а также утрата больными трудоспособности и возможность летальных исходов влекут за собой огромный демографический и экономический ущерб для государства.
До недавнего времени считалось, что клинически ВГВ-инфекция может протекать в форме острого или хронического ГВ, или же как длительное персистирование поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) в сыворотке крови пациентов при отсутствии клинически выраженного гепатита. Однако было показано, что ДНК вируса может определяться в сыворотке крови и ткани печени пациентов, у которых доступными методами не выявлялся HВsAg. Это явление получило название «скрытая (латентная) ВГВ-инфекция».
Несмотря на возросший интерес к проблеме скрытой ВГВ-инфекции, наблю-дающийся в последние годы, до настоящего момента не существует единого мнения о распространенности данного явления в различных группах населения, а также его клинической значимости.
Существенные расхождения в получаемых данных о распространенности скрытой ВГВ-инфекции связаны с использованием при определении HBsAg и ДНК ВГВ методов с различной чувствительностью, а также с тем, применялись ли в ходе исследования методы выявления ВГВ в ткани печени. Наиболее современные из применяемых тест-систем для иммуноферментного определения HBsAg позволяют детектировать его в сыворотке крови в концентрации 0,01 нг/мл. Оценка распространенности скрытой ВГВ-инфекции при использовании таких тест-систем ранее не проводилось. Кроме того, на настоящий момент практически отсутствуют данные о патоморфологических изменениях в ткани печени при скрытой ВГВ-инфекции.
Цель работы
Определить эпидемиологические, молекулярно-вирусологические и клинико-морфологические особенности скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ВГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неуточненной этиологии.
Задачи
-
1. Определить встречаемость скрытой ВГВ-инфекции среди условно здорового населе-ния Республик Тыва — региона РФ, эндемичного по гепатиту В.
-
2. Выявить скрытую ВГВ-инфекцию у HBsAg-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени, распространенными на территории РФ.
-
3. Дать молекулярную и клинико-морфологическую характеристику скрытой ВГВ-ин-фекции.
-
4. На основании результатов исследования оптимизировать алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неустановленной этиологии.
Положения, выносимые на защиту
-
1. С использованием высокочувствительных методов детекции маркеров ВГВ (HBsAg определялся тест-системой с чувствительностью 0,01 нг/мл; ДНК ВГВ — <125 ко-пий/мл) установлена частота встречаемости скрытой ВГВ-инфекции среди условно здорового населения региона РФ, гиперэндемичного по ГВ (Республика Тыва) — 0,42%.
-
2. Выявленные случаи скрытой ВГВ-инфекции характеризуются минимальными клинико-биохимическими и морфологическими изменениями, а также низким уров-нем виремии и отсутствием в структуре HBsAg аминокислотных замен, способных повлиять на эффективность его детекции в иммуноферментном анализе.
-
3. Определение ДНК ВГВ в гепатобиоптатах методом ПЦР с последующим электрон-номикроскопическим исследованием и иммуноцитохимической детекцией вирусных белков в рамках алгоритма обследования HBsAg-негативных пациентов с хрониче-скими заболеваниями печени позволяет выявлять скрытую ВГВ-инфекцию в ранее не диагностированных случаях.
Научная новизна
-
1. Впервые скрытая ВГВ-инфекция в регионах с различной эндемичностью по ГВ (г. Москва и Республика Тыва) выявлена с использованием иммуноферментных тест-систем с высокой чувствительностью (HBsAg — 0,01 нг/мл).
-
2. С применением электронной микроскопии и иммунохимических методов исследова-ния биоптатов печени пациента со скрытой ВГВ-инфекцией проведено описание кле-точных структур гепатоцитов.
-
3. По результатам анализа фрагментов последовательностей S-гена ВГВ, выделенных из образцов сыворотки крови и ткани печени пациентов со скрытой ВГВ-инфекцией, показана их генетическая разнородность.
-
4. Представленные данные свидетельствуют о нецелесообразности дальнейшего расширения спектра антител, используемых в тест-системах для иммуноферментно-го выявления HBsAg при диагностике скрытой ВГВ-инфекции.
-
5. Предложено расширение алгоритма диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с вы-соким риском инфицирования ГВ и пациентов с хроническими заболеваниями пече-ни неустановленной этиологии путем определения ДНК ВГВ в гепатобиоптате с по-следующим применением электронной микроскопии и иммунохимических методов детекции вирусных антигенов.
Личныи вклад автора в полученные результаты
Основные результаты получены лично автором. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах проведения работы: определении маркеров ВГВ-инфекции серо-логическими и молекулярно-биологическими методами, описании клинической характе-ристики пациентов, филогенетическом анализе последовательностей ДНК ВГВ. Обра-ботка собранного материала и экспериментальная часть работы выполнена на базе Учре-ждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных эн-цефалитов им. М.П. Чумакова РАМН в лабораториях эпидемиологии гепатитов и пато-морфологии вирусных заболеваний.
Практическая значимость
-
1. В ходе проведенного исследования установлено, что возможность диагностики скры-той ВГВ-инфекции зависит от чувствительности применяемых серологических и мо-лекулярно-вирусологических методов, а также от использования морфологических методов.
-
2. Применение предложенного алгоритма диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфицирования ВГВ позволяет уточнить этиологию заболевания у лиц с гепатитом неустановленного генеза.
-
3. Дальнейшее совершенствование серологической диагностики скрытой ВГВ-инфек-ции путем внесения антител к новым антигенным эпитопам при разработке иммуно-ферментных тест-систем является нецелесообразным.
Внедрение результатов и апробация работы
Алгоритм диагностики скрытой ВГВ-инфекции у лиц с высоким риском инфициро-вания ВГВ и пациентов с хроническими заболеваниями печени неустановленной этио-логии внедрен и применяется в научно-исследовательской работе клинического отдела и отдела вирусных гепатитов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. Материалы диссертацион-ной работы представлены в виде постерного доклада P-39 на международном конгрессе по вирусным гепатитам 13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (2009 г., Вашингтон), на VIII Российской конференции с международным участием «Ви-русные гепатиты» (2009 г., пос. Московский, Россия), на XI Славяно-Балтийском науч-ном форуме (2009 г., г. Санкт-Петербург), на XV Российской гастроэнтерологической не-деле (2009 г., г. Москва), VIII Международном симпозиуме гепатологов Республики Бе-ларусь «Актуальные вопросы гепатологии» (2009 г., Могилев, Республика Беларусь), XVII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2010 г., г. Москва).
Апробация диссертации состоялась 13 октября 2010 г. на заседании Ученого совета ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (протокол №212 от 08.10.2010 г.).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи — в рефе-рируемых журналах ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 115 страницах текста, состоит из введения, обзора литера-туры, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 6 отечественных и 103 зарубежных источника. Дис-сертационная работа иллюстрирована 25 таблицами, 15 рисунками и имеет 2 иллюстри-рованных приложения.
Обследование пациентов и забор материала проводились на базе 12 ГКБ г. Москвы, в Поликлинике при Управлении делами Президента РФ и Гепатологическом центре г. Кы-зыла, Республика Тыва. Забор сывороток крови и биоптатов печени проводилось квали-фицированным медицинским персоналом с наличием подписанного пациентами инфор-мированного согласия.
Все лабораторные исследования были проведены в лабораториях эпидемиологии гепатитов и патоморфологии вирусных заболеваний ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.
