Введение к работе
Актуальность темы. Около 170 миллионов человек в мире больны вирусным гепатитом С, который может быть причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Возбудитель этого широко распространенного заболевания - вирус гепатита С (ВГС) - передается парентерально и на сегодняшний день является основной причиной посттрансфузионных гепатитов [Alter М., 2007].
ВГС является имеющим оболочку РНК-содержащим вирусом, принадлежащим к семейству Flaviviridae [Choo Q., 1989]. На всех стадиях заболевания существует как гетерогенная популяция различных, но близкородственных вирусных частиц, относящихся к так называемым квазивидам [Afonso A.M., 1999]. Гетерогенность популяции способствует быстрой селекции мутантов, более приспособленных к иммунному ответу организма хозяина, и формированию хронической инфекции [Penin F., 2001]. РНК вируса гепатита С остается на детектируемом уровне в крови и печени на протяжении более чем 20 лет у 85% инфицированных пациентов [Alberti А., 1999]. Острая инфекция у большинства пациентов протекает бессимптомно, только около 25-30% пациентов с острым гепатитом С спонтанно элиминирует вирус [Maheshawari А., 2008]. Если вирус персистирует в организме более чем 6 месяцев, то заболевание считается перешедшим в хроническую форму.
Квазивиды формируются благодаря высокой вариабельности отдельных участков генома вируса, в частности генов, кодирующих поверхностные белки Е1 и Е2. Наиболее высокая вариабельность характерна для региона, называемого HVR1 и локализованного на N-конце белка Е2 [Afonso A.M., 1999]. Данный регион содержит 27 аминокислот и формирует главный поверхностный антиген вируса, являющийся также доминантным эпитопом для нейтрализующих антител [Farci Р., 1994, 1996, Shimizu Y.K., 1994, 1997, Zibert А., 1997].
Высокая вариабельность HVR1 последовательностей коррелирует с появлением мутантов, позволяющих вирусу избегать иммунного ответа, и играет важную роль в поддержании персистенции вируса во время хронической инфекции [Erickson A.L., 2001, Shimizu Y.K., 1997, Kurosaki М., 1994, McAllister J., 1998, Van Doom L., 1995, Weiner A., 1995]. Кроме того, уровень и природа замен в HVR1 в период ранней стадии инфекции коррелирует с исходом заболевания [Farci Р., 2000]. Считается, что вариабельность нейтрализующих эпитопов является одной из причин, затрудняющих создание вакцины против вирусного гепатита С, однако, несмотря на высокую вариабельность этого участка, показано присутствие сильной негативной селекции против некоторых аминокислотных замен,
обеспечивающей консервативность аминокислот в отдельных положениях, что указывает на важную биологическую роль HVR1 в жизненном цикле вируса. Таким образом, характеристика популяции квазивидов ВГС и их свойств на разных этапах заболевания важна для понимания их биологического значения при остром и хроническом гепатитах С, что может помочь в создании вакцины [Chen S., 2007].
Дифференциальная диагностика стадий острого гепатита С от хронического важна для успешной терапии больных. Терапия а-ИНФ-2Ь и рибавирином, начатая на начальной стадии инфекции, ведет к излечению инфекции в 98% случаев. Успешный исход терапии, начатой в хронической стадии заболевания, наблюдается только в 42-82% случаев [Pawlotsky J., 2006]. Ни один из таких маркеров как РНК вируса гепатита С, антитела к ВГС класса IgG, увеличение активности аланиноаминотрансферазы в сыворотке или плазме крови [Daniels D.S., 2007] не может быть использован для детекции острой инфекции, т.к. все эти маркеры могут быть обнаружены также при хронической форме заболевания. Кроме того, дифференциальная диагностика острой и хронической инфекции, основанная на клинической симптоматике, оценке эпидеомиологических факторов риска, не всегда эффективна, поскольку у большинства больных острым гепатитом С заболевание протекает бессимптомно [Pawlotsky J., 2006, Chung R.T., 2005]. Такие методы, как определение анти-ВГС IgM [Coppola N., 2009, Chen R.J., 1992], измерение анти-ВГС IgG авидности [Klimashevskaya S., 2007] и последовательное определение титра вируса в крови [McGovern В.Н., 2009] были предложены как маркеры острой ВГС-инфекции. Польза анти-ВГС IgM, как маркера острой инфекции остается противоречивой [Coppola N., 2009, Chen R.J., 1992]. Другие методы, предполагают использование изменений в концентрации вируса для определения острой инфекции, но требует отбора нескольких образцов крови в определенные промежутки времени [McGovern В.Н., 2009, Николаева Н.И., 2006]. Исходя из приведенных выше данных существует необходимость в создании новых тестов и алгоритмов, позволяющих с достаточной точностью дифференцировать острое бессимптомное течение вирусного гепатита С от хронического.
Цель работы: Провести сравнительный анализ аминокислотных последовательностей гипервариабельного участка HVR1 белка Е2 изолятов вируса гепатита С и на основе полученных данных разработать новые подходы к дифференциальной диагностике острого и хронического гепатита С.
Задачи исследования:
-
Осуществить сравнительную характеристику вариаций аминокислотных последовательностей HVR1 белка Е2 при остром и хроническом вирусном гепатите С.
-
Оценить свойства HVR1 белка Е2 квазивидов вируса при острой и хронической формах вирусного гепатита С.
-
Изучить влияние сероконверсии на изменения в популяции квазивидов вируса гепатита С.
-
Разработать мультиплексные тесты на базе технологии Luminex (анти-ВГС IgG и анти-ВГС IgM) для детекции гуморального ответа на структурные и неструктурные белки вируса гепатита С.
-
Создать модели для дифференциальной диагностики острой и хронической стадий вирусного гепатита С.
Научная новизна. Впервые были оценены свойства гипервариабельного участка 1 белка Е2 вируса гепатита С на разных стадиях инфекции для выявления направления эволюции вирусных квазивидов на острой и хронической стадиях заболевания. При сравнении 10 показателей, отражающих биохимические и физико-химические свойства указанного участка аминокислотной последовательности белка Е2, обнаружены статистические значимые различия между изолятами вируса, полученными от больных острым и хроническим гепатитом С. Кроме того, впервые выявлены статистически значимые различия по каждому из следующих свойств: количество основных аминокислот в сегменте, изоэлектрическая точка, объем, заряд сети, доступная площадь поверхности, полярность, и гидрофобность. Впервые на основе информации о свойствах аминокислотных последовательностей HVR1 была построена модель, применимая для разделения изолятов вируса гепатита С на две группы, соответствующие острой и хронической стадии гепатита С. По указанным свойствам участков HVR1 модель позволяет проводить дифференциальную диагностику острой и хронической стадий инфекции с точностью, равной 88%.
Впервые были обнаружены значимые различия между популяциями квазивидов у пациентов с острой и хронической инфекцией. Кроме этого обнаружено пять аминокислотных позиций HVR1, которые вносят значительный вклад в дифференциацию стадий.
Впервые на основе технологии Luminex разработан мультиплексный тест для определения анти-ВГС IgG и IgM против структурных и неструктурных белков ВГС. Данный тест позволяет при минимальных затратах образца (1цл плазмы или сыворотки крови) определять антитела против восьми антигенов в одной лунке.
Результаты данных тестов использованы для разработки алгоритма на основе модели логистической регрессии для дифференциальной диагностики
стадий острого и хронического гепатита С. Точность модели составила 90,8% для образцов плазмы крови больных острым гепатитом С и 97,2% для образцов плазмы крови больных с хронической стадией инфекции.
Научно-практическая ценность. Обнаружены существенно значимые отличия физико-химических и биохимических свойств участка HVR1 белка Е2 изолятов вируса гепатита С, характерные для больных острой и хронической формами вирусного гепатита С, которые позволили построить модель для дифференцировки стадий заболевания. Данная модель может быть использована в исследованиях процессов эволюции вируса в организме хозяина, при разработке вакцин против вирусного гепатита С. Разработан иммунологический тест для дифференциальной диагностики острой и хронической стадий вирусного гепатита С, который применим, как дополнительный критерий оценки целесообразности терапии, поскольку лечение а-ИНФ-2Ь и рибавирином, начатое на начальной стадии инфекции, намного эффективнее в сравнении с терапией, проводимой в хронической стадии заболевания. Данный тест также может быть применим для проведения эпидемиологических исследований. Тест позволяет проводить диагностику при минимальных затратах плазмы или сыворотки крови. Положения, выносимые на защиту:
-
При прогрессировании вирусного гепатита С от острой к хронической стадии изменяются биохимические свойства гипервариабельного участка 1.
-
При прогрессировании инфекции вирусного гепатита С от острой к хронической стадий изменяются молекулярные свойства гипервариабельного участка 1.
-
Специфическая реактивность IgG против структурных и неструктурных белков вируса позволяет дифференцировать острую и хроническую стадии вирусного гепатита С.
Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на конференции Emerging Technologies of Medical Importance for the Diagnosis of Infectious Diseases and the Detection of Pathogenic Microbes (Пекин, Китай 2008), на 15-том Международном Симпозиуме Гепатита С и родственных вирусов (International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses) (Сан Антонио, Техас, США, 2008), на 10-ой международной конференции молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетике инфекционный заболеваний (International Conference on Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics of Infectious Diseases) (Амстердам, Нидерланды, 2010), на международной конференции по биоинформатике и биомедицине (BIBM) (Атланта, Джорджия, США, 2011), на 20-том Международном Симпозиуме Гепатита С и родственных вирусов (International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses) (Мельбурн,
Австралия, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МинОбрНауки России для публикаций основных результатов исследования.
Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 130 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 8 таблицами, включая 3 таблицы приложения. Список цитируемой литературы состоит из 196 источников.
Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и интерпретирован лично автором.
