Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1 1. Открытие и эпидемиология ККГЛ (исторический аспект) 9
1.2. Эпидемиологическая ситуация по ККГЛ в России в настоящее время 11
1.3. Таксономия найровирусов 16
1.4. Молекулярно-биологическое исследование вируса ККГЛ 18
1.5. S-сегмент геномной РНК и нуклеокапсидный белок 23
1.6, М-сегмент геномной РНК и оболояечные гликопротеины 35
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Материал для исследований 42
2.2. Обратная транскрипция полимеразная цепная реакция 45
2.3. Секвенирование и филогенетический анализ , 49
Глава 3. Состояние природного очага ккгл на юге России 52
3.1. Вирусофорность клещей 52
3.2. Результаты ИФА клинических образцов 56
Глава 4. Структура генома вируса 61
4.1.CrpyicrypaS-PHK вируса ККГЛ 61
4.1.1. Структура участка 310-529 S-сегмента генома вируса ККГЛ 63
4.1.2. Структура 825-1290 участка S-сегмента генома вируса ККГЛ 68
4.1.3. Полная структура S-сегмента генома вируса ККГЛ 75
4.2- Структура М-сегмента генома вируса ККГЛ 82
4.2.1-Структура среднего участка М-сегмента генома вируса ККГЛ - 85
4.2.2. Структура 5 концевого участка М-сегмента генома вируса ККҐЛ 90
4.2.3. Структура З -концевого участка М-сегмента генома вируса ККГЛ 95
Глава 5. Дизайн праимеров для диагностической ПЦР-тест-системы на РНК вируса ККГЛ в образцах .108
Выводы 111
Список литературы 112
- Эпидемиологическая ситуация по ККГЛ в России в настоящее время
- М-сегмент геномной РНК и оболояечные гликопротеины
- Секвенирование и филогенетический анализ
- Структура З -концевого участка М-сегмента генома вируса ККГЛ
Введение к работе
Крымская-Конго геморрагическая лихорадка - острое вирусное природно-очаговое заболевание человека с высокой степенью летальности. Вирусная этнология ККГЛ была установлена М.П.Чумаковым при изучении в 1944-45 гг. в Крыму вспышки неизвестного заболевания с геморрагическим синдромом. Этиологический агент был охарактеризован антигенно, физико-химически и морфологически лишь в 1967 году, когда для выделения вируса отечественными исследователями была использована общепринятая методика выделения вируса на белых мышах-сосунках. (Чумаков МП, и др., 1968), Совместными исследованиями советских (Чумаков МЛ, и др., 1969) и американских (Casals J. et aL, 1969) экспертов, проведенных в конце 60-х годов, было продемонстрировано, что штаммы вируса Крымской геморрагической лихорадки в антигенном и биологическом отношении очень близки к вирусу лихорадки Конго, впервые выделенного в 1956 году в Заире из крови больного ребенка (Simpson D.L.H. et al., 1967). Этиологический агент, вызывающий то и другое заболевание, получил общее название - вируса конго-крымской гемморагической лихорадки (ККГЛ), В настоящее время он называется вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки.
Географическое распространение вируса довольно широкое. Число стран в Европе, Азии и Африке, где выявлена циркуляция возбудителя ККГЛ, достигло четырех десятков (Hoogstraal Н. 1979, Swanepoel R. 1987).
В молекулярно-биологическом плане вирус ККГЛ ещё недостаточно исследован. Нуклеотидная последовательность всего генома вируса ККГЛ пока не определена, однако, для ряда штаммов ККГЛ, изолированных в Китае, Греции, Нигерии, Пакистане, Уганде, Косово и Сенегале известны полные или частичные последовательности М- и S-сегментов генома.
Филогенетический анализ, проведенный на основе имеющихся частичных нуклеотидпых последовательностей (220 нуклеотидов) S-ссгмента генома 26 вариантой вируса ККГЛ из различных регионов мира, показал, что все вирусы
делятся на 3 большие группы (Rodriguez LX, et al.,1997). Немногим ранее аналогичная картина была получена при сравнении фрагментов S-сегментов длиной 499 нуклеотидов В вирусов ККГЛ (Marriott А.С. et al-, 1996). Полученные в этих работах филогенетические деревья не выявляли корреляцию между генетическими группами, местом и источником выделения вируса (человек, клещ, животное). Что касается Российской Федерации и бывшего СССР, то, несмотря на приоритет в открытии данного вируса какие либо данные по молекулярно-эпидемиологическому мониторингу этого вируса отсутствуют. Следовательно, какой-либо возможности оценить преобладающие генетические варианты вируса и генетическое разнообразие его на территории до сих пор не было.
Активизация очагов ККГЛ, начавшаяся в 1999 г, на территории юга России, требует с одной стороны выяснения причин данной ситуации, с другой стороны - выявления ведущих генотипов вируса, циркулирующего на указанных территориях.
Данные по строению части генома вируса ККГЛ (S-сегмент РНК), циркулирующего в России, были получены только для одного штамма Drozdov, выделенного в 1967 году в Астраханской области ( Butenko А, М. et аГ, 1968). Структура среднего (М) сегмента этого и других российских вирусов не были
известны.
Широкое геоірафическое распространение и высокая опасность заболевания ККГЛ для человека делают изучение природных популяций вируса актуальным в плане получения новых данных по генетической вариабельности циркулирующего на юге России вируса, изучения путей эволюции вируса и в плане усовершенствования методов лабораторной диагностики.
Целями настоящего исследования являлись генетическая характеризация полевых и лабораторных образцов вируса ККГЛ, выделенных от клещей Hyalomma marginatum, выживших и умерших больных из Ставропольского края, Ростовской, Волгоградской и Астраханской областей России и разработка
метода индикации РНК вируса для ранней диагностики ККГЛ на основе обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).
Для выполнения намеченной программы требовалось решить следующие задачи:
сбор и иммунохимическая характеризация образцов, потенциально содержащих вирус ККГЛ, от больных и различных видов клещей;
выявление наличия в образцах вируса с помощью ИФА",
дизайн нраймеров и индикация РНК вируса ККГЛ с помощью обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР);
определение нуклеотидных последовательностей фрагментов S- и М-сегментов генома полевых образцов и коллекционных штаммов вируса ККГЛ;
сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с опубликованными и установление филогенетических взаимоотношений между штаммами вируса ККГЛ, циркулирующего в различных регионах мира.
Научная новизна работы
Впервые исследована генетическая вариабельность вируса ККГЛ» циркулирующего на территории южных регионов России на основании изучения частичных нуклеотидных последовательности S- и М- сегментов генома.
Определена полная нуклеотидная последовательность S-сегмента трех коллекционных штаммов вируса ККГЛ: LEIV 29223 Ст. от больного из Ставропольского края, LETV 28044 Рос. от клеща H.marginatum из Ростовской области и LETV 1.0145 Уз. от клеща Н, asiaticum из Узбекистана.
Впервые показано, что на территории России циркулируют генетически близкие варианты вируса ККГЛ, существенно отличающиеся по нуклеотидной последовательности S- и М- сегментов генома от штаммов из других регионов мира.
На основаним данных по генетической вариабельности вируса ККГЛ, циркулирующего в южных регионах России, создан набор праймеров для
диагностической ПЦР-системы для индикации вируса ККГЛ в клинических образцах.
Практическая ценность
На основе созданного нами набора праймеров и отработанных условий индикации РНК вируса с помощью ОТ-ПЦР выпущена экспериментальная серия диагностических наборов для выявления РНК вируса ККГЛ в клинических образцах.
Получена заявка на изобретение № 2001123408/13, тгНабор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса ККГЛ" приоритет от 20.08,01, решение о выдаче патента от 11.02.2003. Авторы заявки: 1) Петров B.C., 2) Петрова И.Д., 3) Тюнников Г.И., 4) Серегин СВ., 5) Яшина Л.Н., 6) Кузина И.И.
По результатам работы в базе данных GenBank зарегистрированы 52 нуклеотидные последовательности.
Основные положения, выносимые на защиту
ф - Популяция вируса ККГЛ, циркулирующего на территории юга Росси в
2000-2001 представлена доминирующим генотипом вируса, имеющим значительные отличия в нуклеотидной структуре от зарубежных аналогов.
Популяция вируса ККГЛ, циркулирующего на территории России, стабильна.
Вирусы ККГЛ, циркулирующие на территории России разделяются географически на Волгоградско-Ростовскую и Астраханско-Ставропольскую
0, подгруппы.
Выражаю глубокую признательность моему научному руководителю кандидату биологических наук Петрову Владимиру Семеновичу за постоянное внимание и заботу при выполнении данной работы.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта МНТЦ 1291.
&
Эпидемиологическая ситуация по ККГЛ в России в настоящее время
В России крупный природный очаг Крымской-Конго геморрагической лихорадки расположен в зоне степных, полупустынных и лесостепных ландшафтов Ставропольского и Краснодарского края, Ростовской, Волгоградской и Астраханской областей, Республик Дагестан, Калмыкии и Карачаево-Черкесии. Эпидемически значимые очаги поддерживаются за счет циркуляции вируса между иксодовыми клещами и их теплокровными прокормителями (Атлас распространения возбудителей природно-очаговых вирусных инфекций на территории Российской Федерации 1995; Куйма А.У., 1975). При этом клещи являются не только переносчиками, но и хозяевами вируса. Основными переносчиками вируса ККГЛ на юге России являются клещи H.marginatum (Онищенко Г\Г\и др., 2000; Аристова В.А. и др-, 2001). Половозрелые фазы клеща кормятся на крупном рогатом скоте, овцах, реже на лошадях, свиньях, зайцах и верблюдах. Личинки и нимфы кормятся главным образом на птицах: пустынной куропатке, фазанах, голубях, горлице, скворцах и воробьиных птицах.
Возбудитель передается человеку не только через укус клеща, но и при прямом контакте с больным. Нередки семейные или внутрибольничные вспышки заболевания, а также возможны случаи внутри лабораторного заражения (Каримов С.К. и др., 1975). Неоднократно отмечалось также заражение вирусом ККГЛ через инфицированную кровь животного при забое и разделке (Пак Т.П. и др., 1980).
Длительный период отсутствия заболеваемости ККГЛ в России сменился в 1999 году активизацией эндемичного очага, вызвавшего вспышки в Ростовской области и Ставропольском крае. В 2000 году произошло существенное расширение границ очага, как на территории Ставропольского края, так и на соседние Калмыкию и Волгоградскую область, В таблице 1 приведены данные rio заболеваемости ККГЛ в различных регионах России (по данным mcdnovosti.ru ; promedmail.org ; who.int/disease-outbreak-news). Официальных статистических данных в доступной литературе мало. Так в обзоре об эпидемиологической ситуации в России (Онищенко Г.Г. и дрм 2001) были приведены данные о том, что в 1999 году в результате вспышки ККГЛ пострадало 10 человек в Ставропольском крае и 27 человек в Ростовской области, За 8 месяцев 2000г, на территории республик Калмыкии и Дагестан, Ставропольского края, Волгоградской и Астраханской областей было зарегистрировано 83 случая ККГЛ, из которых 8 закончились летальным исходом. По данным группы авторов (Онищенко Г.Г. и др., 2001) из 10 случаев заболевания ККГЛ в Ставропольском крас в 1999 году 9 имели место в Нефтекумском районе и 1 - в Ипатьевском, с тремя летальными исходами, В 2000 году были зарегистрированы 48 больных ККГЛ в 13-ти районах края. Около половины всех заболевших проживали в упомянутых выше районах (по 22.9% от общего числа в каждом), а максимальный показатель заболеваемости был отмечен в Туркменском районе (20.2 на 100 тысяч населения). В среднем по краю этот показатель в 1999 году составил 1.5 и в 2000 - 0.4 на 100 тысяч населения. Для сравнения этот показатель в 50-60-ые годы, когда заболело 25 человек и из них умерло 11 {44% смертность), находился на уровне 0.04 на 100 тысяч населения (Кучин В.В. и др., 1973). С 1972 по 1998 год случаев заболевания ККГЛ в крае отмечено не было. В работе другой группы авторов указывается, что в 2000 году в Ставропольском крае было выявлено и лабораторно подтверждено 49 случаев ККГЛ (Колобухина Л.В. и др., 2001), В 2002 году в сыворотках крови от 31 больного в Ставропольском крае с помощью ОТ-ПЦР была выявлена РНК вируса ККГЛ (Платонов А.Е. и др., 2002). Во время вспышки заболевания в 2000 году в Ставропольском крае были проведены исследования сывороток крови крупного рогатого скота с использованием ИФА. У 20% исследованных коров (общее число выборки не указано) были выявлены ККГЛ вирусоспецифические антитела. Инфицированность клещей H.marginatum по результатам ИФА на антиген составила 16% от неуказанного общего числа исследованных (Онищенко Г.Г. и др., 2001). В другой работе приведены отличающиеся от этих результатов данные (Аристова В.А. и др., 2001) по вирусофорности клещей H.marginatum в это же время в крае, равные 0,03% при выборке 3034 экземпляра. Группа авторов (Евченко Ю.М и др., 2002) приводит результаты обследования клещей Н. marginatum в Ставропольском крае в эпидемический сезон 2000 года. По результатам ИФА 1.6% клещей, собранных в районах, расположенных в сухой степи, были положительными по пробе на антиген вируса ККГЛ. В первую очередь это касается таких районов как Нефтекумский, Левокумский, Андроновский, Ипатовский, Курский и Советский. В клещах, собранных в северной степи Ставропольского края (Труновский, Минералводский, Шпаковский, Грачевский, Степновский и Кочубеевский районы), антиген вируса ККГЛ не был обнаружен. Авторы заключают, что уровень зараженности клещей H.marginatum в Ставропольском крае следует расценивать как высокий, что свидетельствует о значительной напряженности природного очага. Что касается остальных регионов, то опубликованных данных пока крайне мало. При вспышке ККГЛ в станице Обливская в Ростовской области в 1999 году были исследованы сыворотки крови 56 больных на наличие специфических к вирусу ККГЛ антител (Онищенко Г.Г. и др., 1999). По динамике нарастания титров антител у 38% лихорадящих больных (21 человек) был поставлен диагноз - ККГЛ. При изучении активности Ростовского природного очага в 2000 году (Мазрухо ТЛЗ. и др., 2001) установлено, что вирусофорность клещей Н.marginatum достигала 1.5% по данным ИФА и 0.11% по данным изоляции вируса, что соответствовало результатам, полученным ранее по этому региону (Аристова В.А, и др., 2001). В работе другой группы авторов (Москвитина А.Э. и др., 2002) приводится более полная информация о ККГЛ в Ростовской области. В результате обследования клещей (более 7000 экземпляров), собранных с КРС и на флаг в открытых стациях в 2000 и 2001 годах, авторы обнаружили антиген вируса ККГЛ в пробах 3 видов клещей: marginatum, D.marginatus, R,rossicus. Вирусный антиген в клешах R.rossicus был обнаружен в 2001 году, и зараженность вирусом этого клеща в Цимлянском районе Ростовской области достигала 2.9%, а максимальный индекс встречаемости для него - 18.2% в Волгодонском районе. Приводится индекс встречаемости H.marginatum в 2000 году по районам области: Волгодонский - 20.1%, Обливский - 20%, Цимлянский - 4.7%. Процент зараженности клещей этого вида варьировал от 0.15-0.47 до 2.2-2.6. Максимальное видовое разнообразие зараженных клещей установлено в Цимлянском районе. Интересен факт, что авторы впервые обнаружили антиген вируса ККГЛ в мозге и сгустке крови ірачей, доставленных из Цимлянского и Обливского районов в июле и августе 2001 года.
М-сегмент геномной РНК и оболояечные гликопротеины
При исследовании антигенной структуры вируса ККГЛ с помощью панели МКА, полученных к структурным белкам вируса ККГЛ, было установлено, что оболочечные гликопротеины являются группоспецифическими и отличаются значительной гетерогенностью. Методом иммунопреципитации заражённых штаммами ККГЛ клеток были идентифицированы 3 неструктурных белка (120 кД, 82 кД, 72 кД) и 4 структурных (240 кД - L, 80 кД - G1, 50 кД - N и ЗбкД -G2). Олигосахариды неструктурных белков представлены в основном маннозой. Определено, что белок с молекулярной массой 82 кД является предшественником гликопротеина G1, функция других не установлена. Протективные эпитопы были обнаружены на гликопротеине Gl (Smith J.F. et al., 1988).
Первая работа по генетической характеризации М-сегмента вируса ККГЛ появилась в 2002году (Papa A. et al, 2002), Для исследования были взяты 2 вирусных штамма ВА66019 и ВА8402. Первый штамм был выделен от больного в 1965 году из провинции Xinjiang, а второй - в 1984 году от клеща Hyalomma asiaticum из того же района. Оба штамма культивировали на культуре клеток Vero-Еб. Для выделения РНК использовалась мозговая суспензия инфицированных этими штаммами (клеточным лизатом) мышей сосунков, С использованием метода случайной затравки и специфического праймирования были получены ДНК-копии 12 взаимоперекрывающихся фрагментов. Дизайн праймеров осуществляли на основании имеющейся в базе данных GenBank нуклеотидной последовательности (U39455) штамма 1ЬАг10200, изолированного в 1970 году от клеща в Нигерии. Для каждого штамма были определены полные нуклеотидные последоватльности М-сегмента генома. Установлено, что длина среднего сегмента РНК составляет 5368 нуклеотидов для штамма ВА66019 и 5367 - для штамма ВА8402. И в том, и в другом случае открытая рамка трансляции (ОРТ) начинается с первого метионинового кодона (AUG) в позиции 78-80 и заканчивается на стоп кодоне трансляции (UAA) в позиции 5145-5147. В случае штамма IbAr 10200 вышеназванный триплет AUG заменен на AUA, и рамка трансляции начинается с кодона AUG в позиции 93-95 и закакчивается терминирующим кодоном UAG в позиции 5142-5144, обнаруживая делецию кодона AGG в позиции 446-448- ОРТ двух вирусов из Китая кодирует полипептид длиной в 1689 аминокислот с предсказанным молекулярным весом в 187 кД. Аминокислотная последовательность содержит 12 потенциальных сайтов гликозилирования (Asp-X-Ser/Thr) для ВА66019 и 10 - для ВА8402. Кривая гидрофильное этих полипептидов выявила 6 гидрофобных регионов, которые, возможно, являются трансмембранными участками. Концевые последовательности М-РНК идентичны в обоих случаях и комплементарны. Сравнение 2 структур (штаммы ВА66019 и ВА8402) и штамма 1ЬАгЮ200 показало, что N-концевая область белка предшественника поверхностных глико протеи нов размером в 240 аминокислот является гипервариабельной, и процент максимального отличия (ВА66019 и IbAr 10200) нуклеотидных и аминокислотных последовательностей этой области равен 22.57 и 17-04, соответственно.
Филогенетический анализ, проведенный по нуклеотидным последовательностям М-сегмента 3 вирусов ККГЛ и вируса Dugbe (ArD44313), показал, что 2 вновь секвенированных вируса (ВА66019 и ВА8402) генетически близки. Они образуют общую ветвь на филогенетическом дереве, а штамм 1ЬАгЮ200 образует ветвь, отдельную от них и от вируса Dugbe. Позднее была опубликована работа группы авторов (Morikawa S. et.al., 2002), посвященная исследованию генетической вариабельности выделенных в Китае изолятов вируса ККГЛ на основе первичных структур М-сегментов вирусной РН К- Семь вирусных изолятов, взятых для исследования, были выделены в основном от больных (66019, 7001,, 75024, 7803, 88166), один - от клеща (8402) и один (79121) - от Long-eared Jerboa (длинноухого тушканчика) в западных пустынных районах Бачу и Аксу в провинции Xinjiang в период с 1966 по 1988 годы. Данная территория являлась эндемичной по ККГЛ начиная с 1960 года (Yen et.al., 1985), вспышки заболевания в этой провинции регистрировались фактически ежегодно (Gonzalez-Scarano et aL, 1996). В данной работе для изолирования вируса использовались новорожденные мыши. Полная нуклеотидная последовательность М-сегмента РНК указанных штаммов была получена секвенированием ампли конов 5 фрагментов анализируемого гена. Определена длина М-сегмента: у 5 вирусов она равна 5356 нуклеотидам, а для двух (7001 и 79121) - 5377, Длина, кодируемого М-сегментом белка равна 1689 и 1697 аминокислот, соответственно. Установлено, что 29 нуклеотидов 5 - и 39 -3-концевой последовательности вирусной РНК являются консервативными среди изолятов. Показано, что З -конпевой участок S- и М-сегментов имеют полную гомологию по 11 нуклеотидам и частичную - по 21 основанию. Для 5-концевых областей эти участки - 12 и 23 нуклеотида, соответственно Результаты продемонстрировали, что N-концевой регион открытой рамки трансляции (ОРТ) является гипервариабельным и включает в себя 250 аминокислот. Минимальный процент гомологии аминокислотных последовательностей этого гипервариабельного участка белка равен 22,4, в то время как для консервативного региона (с 251по 1683 аминокислоту) эта величина- 81,7%.
Проведя сравнение полученных аминокислотных последовательностей белка предшественника поверхностных гликопротеинов вируса ККГЛ и вируса Dugbe по данным Марриотта (Marriott А.С. etal., 1992), авторы предполагают, что N-концевая аминокислота белка G] расположена в позиции 1054 для штаммов 7001 и 79121, а для остальных -1046. При правильности приведенного выше предположения этот белок будет состоять из 664 аминокислот с предсказанной молекулярной массой приблизительно 72кД и содержать 3 или 4 сайта гликозилирования. Предполагаемая авторами масса белка близка 75 кД, полученным ранее для белка Gi вируса ККГЛ (Clerx J.P. etal., 1981), В качестве подтверждения своего предположения авторы приводят следующий факт: N-конец гликопротеина Gi вируса Dugbe расположен не в непосредственной близости к ближайшему гидрофобному региону, а на расстоянии приблизительно 50 аминокислот, что и будет иметь место для вируса ККГЛ, если высказанное предположение не является ошибочным.
Секвенирование и филогенетический анализ
Для определения нуклеотидной последовательности ТТЦР-фрагментов проводили очистку ДНК следующим образом: полоски геля, содержащие фрагменты ДНК ожидаемого размера, вырезали и извлекали ДНК, используя набор для очистки QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Германия). Очищенные ПЦР-продукты секвенировали используя набор BigDye TCSK (Qiagen GmbH, Германия) на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (РЕ Applied Biosystems, США) в соответствии с указаниями фирмы-производителя. Нуклеотидная последовательность всех фрагментов была определена по обеим цепям. Нуклеотидные последовательности фрагментов S- и М-сегментов генома вируса ККГЛ, определенные в настоящей работе, сравнивали с соответствующими последовательностями других штаммов вируса ККГЛ, полученными из базы данных GenBank, при использовании компьютерной программы CLUSTALW (Thomson et al., 1994). При построении филогенетических деревьев сравнение последовательностей осуществляли методом обьединения соседних последовательностей с использованием программы MEGA, версия 1.02 (Kumar S-, 1993). Использовали алгоритм Kimura, основанный на оценке частот встречаемости различных нуклеотидов в анализируемых последовательностях и различиях в скоростях транзиций и трансверсий. Вычисления проводили для 1000 итераций. Все секвенированные нами последовательности зарегистрированы в базе данных GenBank, они приведены ниже в таблице 7. С целью изучения циркулирующего на юге России вируса ККГЛ нами было проанализировано 7167 клещей (в основном Н. marginatum, лишь 450 из них - H.scupense ) в 668 пулах, собранных в 2000 году в 5 административных регионах России, на наличие антигена вируса ККГЛ методом АгИФА. Анализировали пулы клещей по 10-12 особей в каждом. Всего было получено 57 антигенположительных пулов.
Средняя зараженность клещей (% положительных клещей, если положительный пул принимать за 1 клеща) по регионам следующая: Ставропольский край - 1,01; Астраханская область -0,95, Волгоградская область -0.83; Ростовская область - 0,66; Калмыкия -0, Все вируссодержащие образцы пассировались на культуре клеток SW-13 для выделения вируса. В результате выделено 10 изолятов вируса ККГЛ. Некоторые (10) из положительных по АгИФА проб клещей были взяты для дальнейших исследований методом ОТ-ПЦР. Необходимо отметить, что все исследованные методом ОТ-ПЦР пробы дали положительный результат (получены ампликоны расчетного размера), хотя в трех случаях (28017,28019 и 29323) изолировать вирус не удалось. Это говорит о большей чувствительности методов АгИФА и ОТ-ПЦР по сравнению с изоляцией вируса ККГЛ на культуре клеток при анализе клещей на вирусофорность. В таблице 7 представлены результаты исследования клещей из различных регионов России на наличие антигена вируса ККГЛ. В 8 районах Калмыкии было собрано и проанализировано 950 клещей (500 - H.marginatum, 450 - H.scupense) в 71 пуле. Все образцы по результату ИФА -отрицательные (эти данные не внесены в таблицу). В Ставропольском крае сбор клещей осуществлялся в 14 районах, максимальное количество зараженных клещей было отмечено в Андроповском (5.8%), Советском (3,8%), Апанасенковском (2.4%), Александровском (2.0%), Курском (1.9%) и Буденовском (1.9%) при среднем значении по краю - 1.0%. Образцы клещей из 8 районов были свободны от антигена (Минсралводский, Туркменский, Труновский, Изобильненский, Арзгирский, Георгиевский, Грачевский и Шпаковский). В литературе по данному региону приведены следующие данные по зараженности клещей H.marginatum: 16% (Онищенко Г.Г. и др., 2001), 0.03% (Аристова В.А. и др., 2001) и 1.6% (Евченко М.Ю. и др., 2002). В 2 районах Астраханской области (Володирский и Приволжский) зараженных клещей обнаружено не было, а в Хабаралинском, Наримановском, Красноярском и Икрянинском процент положительных клещей составлял 2.3, 1,4, 0.7 и 0,7, соответственно, при среднем значении по области - 0.95%, В литературе имеются данные по обследованию клещей в области только за период с 1982 по 1987 гг. (Смирнова Е.С. и др., 1991), когда был отмечен постепенный рост зараженности клещей H.marginatum с 0,3% до 1.0%, В Волгоградской области обследование клещей проводилось в 4 районах. Процент положительных клещей в них следующий: Октябрьский - 1.7; Котельниковский - 0.8, Чернышковский - 0,6; Суровикинский - 03.
В среднем по области вирусофорность клещей H,marginatum составила 0.83%. Обследование клещей в Ростовской области показало, что только в двух из 10 обследованных районах обнаружены антигенположительные клещи, а именно в Волгодонском (1.7%) и Цимлянском (0.8%). Среднее значение зараженности клещей по области значительно меньше и составляло 0.7%. Приведенные результаты показывают, что уровень вирусофорности клещей H-marginatum, основного переносчика вируса ККГЛ, в весенне-летний период 2000 года в Ставропольском крае, Астраханской, Волгоградской и Ростовской областях по данным ИФА на антиген вируса ККГЛ достаточно высок: 1.01 -0.66 %, что говорит об активном состоянии природного очага. Полученные нами результаты по Волгоградской области (средняя зараженность клещей H.marginatum составила 0.83%) можно сравнить с результатами обследования клещей в области в 2002 году (Платонов А.Е. и др. 2002) , Авторами были проанализированы пробы от 863 клещей (124 пула) H.marginatum и 220 (21 пул) H.scupense, РНК вируса ККГЛ была обнаружена в 11 и 2 пулах, соответственно. Таким образом, зараженность клещей H.marginatum - 1.3% и H.scupense - 0.9%. Результаты исследований этой группы авторов еще не опубликованы в научных изданиях, а только в виде тезисов. Нет указаний на районы, в которых собирались клещи, и поэтому трудно делать какие-либо выводы об изменении уровня вирусофорности клещей в области за 2 года. Полученные нами результаты по Ростовской области можно сравнить с опубликованными (Мазрухо Т.В. и др., 2001) по зараженности клещей H.marginatum в области в том же году. Из 699 клещей, лишь 6 были антигенположительными, то есть средняя зараженность по области - 0,9%. По Цимлянскому району (все положительные пробы собраны в нем) этот показатель выше и равнялся 1.5%. Упомянутые выше исследования не захватывали Волгодонский район. Группа авторов недавно опубликовала результаты своих исследований в Ростовской области (Москвитина А.Э. и др.,
Структура З -концевого участка М-сегмента генома вируса ККГЛ
Подобные исследования были проведены нами и для Зг-концевого участка М-сегмента (4641-5072), Анализировались те же вирусные образцы, за исключением VLG/TI29414, вместо которого был взят VLG/HU29664. Сравнение вновь полученных нами структур исследуемого участка генома российских вирусов между собой показало, что они различаются по последовательностям нуклеотидов на 0.2-6.0%, а аминокислот - 0,7-6-9%. Образцов с одинаковыми структурами не установлено, что говорит о большей вариабельности этого участка для вирусов из южных областей России по сравнению с 5 -концевым участком М-сегмента. В таблице 20 приведены результаты сравнения вновь полученных структур с таковыми из других регионов. Из таблицы видно, что различия между структурами российских вирусов и структурами, взятыми из GenBank по нуклеотидным последовательностям исследуемого участка составляют 16.2-25.2% и по аминокислотным - 9.7-24.3%. Как и для других участков М-сегмента максимальное отличие приходится на китайские штаммы 79121 и 7001, неразличимые по структуре 4641-5072 фрагмента М-сегмента генома вируса ККГЛ, Среди китайских штаммов выделяются три пары генетически близких вирусов: 1) 79121 и 7001, 2) 8402 и 88166, 3) 7803 и 75024. Различия внутри этих групп не превышают 0,5% по нуклеотидным последовательностям и 1.4 % - по аминокислотным. Отличие штаммов первой группы от вирусов двух других групп (2 и 3) по нуклеотидной последовательности составляет 22.5- 22.7% и 25.7-25.9% , а 20.1-20.8% и 20.1% - по аминокислотной, соответственно. Если сравнить эти цифры с аналогичными по 5 -концевому участку (56-4-56.7% и 53.6-53.8%, 74.5% и 70.8%, соответственно) при сохраняющихся низкими различиях внутри групп (не выше 0.9% по нуклеотидным последовательностям и не 1.9% - аминокислотным), то делать вывод о том, что для китайских штаммов 5 -концевой участок более вариабельный, чем З -концевой - нельзя. Аналогичным образом соотносятся различия между штаммом 79121 и, к примеру, российскими вирусами или штаммом 10200 из Нигерии, установленные по структурам 5 -концевого и 3 -концевого участков М-сегмента генома.
Это лишь лишний раз подтверждает, что штаммы из Китая относятся к трем различным генетическим ірушіам. Выравнивание аминокислот, кодируемых исследуемым участком генома, представлено в таблице 21. По приведенному ниже аминокислотному выравниванию видно, что данный участок белка довольно консервативен: гомология для всех указанных вирусов ККГЛ равна 69,2% . Для вариантов вируса из России гомология по данному участку аминокислотной последовательности - 90.9%, а для китайских - 74.8%. Восемь аминокислот, которые выделены серыми блоками, являются уникальными для российских вирусов. Причем три из них в виде триплета (GSV) расположены в позиции 71-73 данного участка. У всех остальных штаммов в этом положении находится аминокислотный триплет SGI. Для выяснения филогенетических отношений вирусов на основе структур участка 4641-5072 М-сегмента нами было построено филогенетическое дерево (рисунок 8), Па рисунке видно, что российские вирусы образуют на дереве отдельную ветвь, что имело место и на деревьях, построенных на основании структур 2 других участков М-сегмента генома вируса ККГЛ. На этом дереве видно четкое деление вирусов, изолированных в южных регионах России, на 2 подгруппы. Уровни поддержки такого ветвления 100- В первую подгруппу «Астрахань-Ставрополь» входят: STV/HU29223, STV/TI28985 и ASTR/TI28870, во вторую «Волгоград» - VLG/HU29662, VLG/HU29664 и VLG/T129453. Различия по нуклеотидной и аминокислотной последовательностям среди вирусов первой подгруппы не превышает 1.9 и.2.8%, между вирусами второй -0,7 и 2.1%, соответственно. Аналогичные различия между подгруппами выше более чем в 2 раза и составляют 6.0 и 6,9%. Все остальные вирусы образовали 3 группы. Самая удаленная группа - это два китайских вируса 7001 и 79121 Во вторую группу входят китайские вирусы 7803 и 75024 вместе с нигерийским штаммом 10200 : к ним примыкает штамм из Китая 66019 Штамм Matin вместе с вирусами 8402 и 88166 образуют третью группу. Хотя короткие геномные последовательности часто используются для популяционного изучения арбовирусов (Rodriquez L.L. et aL, 1997; Powers A.M. et ah, 1997; Ebel G.Q. et aL, 1999), мы решили исследовать более протяженный фрагмент З -концевого участка геномной М-РНК. Были выбраны 2 вируса из южных регионов России (STV/HU29223, VLG/TI29414), относящихся к разным подгруппам по результатам наших исследований, и коллекционный штамм из Таджикистана (HU8966). Были получены ампликоны участка М-РНК (4185-5340 по штамму 66019) для трех вирусов. Этот участок включает в себя открытую рамку трансляции (4185-5145) и З -концевую некодирующую область. Был проведен сравнительный анализ вновь полученных структур между собой и взятыми из базы данных GenBank по нуклеотидным последовательностям ОРТ и последовательностям выведенных аминокислот. Результаты этого сравнения приведены в таблице 22. Из таблицы видно, что по структуре данного участка М-сегмента 2 российских вируса различаются на 4.5% по нуклеотиднои последовательности и на 4.1% - ио аминокислотной. От друїих вирусов эти различия составляют 14.4-22.4 и 7.5-19.1%, соответственно, Ьсли сравнить эти цифры с аналогичными, полученными по более короткому З -концевому участку (16.2-25.2% и 9.7-24.3%), входящему в исследуемый, то видно, что уровень гомологии по более протяженному участку выше. Таджикский штамм HU8966 наименее отличен по структуре от китайских вирусов 7803 и 75025: 4.7-5.0% различий по нуклеотиднои последовательности и 3.1% - по аминокислотной.
