Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Молекулярная биология ВГВ 10
2.1.1. Структураи организация генома 10
2.1.2. Вирусные белки 14
2.1.3. Жизненный цикл ВГВ 18
2.1.4. Репликация ВГВ 23
2.1.5. Серологические маркеры инфекции ВГВ 24
2.2. Молекулярные варианты ВГВ 25
2.2.1. Генотипы ВГВ 26
2.2.2. Сочетанное инфицирование различными генотипами ВГВ 30
2.2.3. HBeAg варианты и HBeAg-серонегативность 31
2.2.4. HBsAg варианты и уход от иммунного ответа 32
2.2.5. Мутанты рге-соге и core гена 36
2.2.6. Мутации устойчивости к ламивудину и другим нуклеозидным аналогам 38
3. Материалы и методы 42
4. Результаты собственных исследований
4.1. Генотипирование ВГВ в популяциях больных гепатитом В в Санкт-Петербурге, Петрозаводске и Якутии 50
4.2. Выявление мутантных форм вируса гепатита В 58
4.3. Выявление мутаций в YMDD-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В 66
4.4. Анализ аминокислотных замен 69
5. Обсуждение результатов 77
Выводы 85
Список литературы 87
- Структураи организация генома
- Сочетанное инфицирование различными генотипами ВГВ
- Генотипирование ВГВ в популяциях больных гепатитом В в Санкт-Петербурге, Петрозаводске и Якутии
- Выявление мутаций в YMDD-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирус гепатита В (ВГВ) является одним из самых распространенных гепатотропных вирусов, вызывающих хроническое поражение печени (Балаян М.С. и Михайлов М.И., 1999; Львов Д.К., 2000; Шахгильдян И.В., 2001; Ивашкин В.Т., 2002). Несмотря на программу вакцинации против ВГВ в России распространенность ВГВ-инфекции продолжает неуклонно возрастать. Клинические проявления хронического вирусного гепатита (ХВГ) многообразны и зависят в основном от биологических свойств вируса и особенностей его взаимодействия с иммунной системой хозяина (Oldstone S.etal., 1991).
Антигенная специфичность белковых структур ВГВ определяется генотипической принадлежностью вирусов и возникающими мутациями, которые меняют фенотип вируса и влияют на течение ХВГ (Brunetto M.R. et al., 1999; Chan H.L. et al, 2002; Sumi H. et al, 2003; Norder H, 2004; Hunt CM. et al., 2004; Baumert T.F. et al., 2005). Вирус гепатита В считается наиболее изученным среди остальных вирусов гепатита. Однако в последнее десятилетие возрос интерес к влиянию генетической вариабельности ВГВ на течение и исход болезни. Генетическая вариабельность проявляется как в возникновении мутаций в вирусном геноме у каждого инфицированного субъекта, так и в существовании различных генотипов ВГВ, свойственных определенным популяциям носителей.
Современная классификация ВГВ включает восемь генетических групп, обозначенных латинскими буквами от А до Н (Schaefer S., 2007). В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что генотип ВГВ может влиять на скорость сероконверсии е-антигена, тяжесть течения болезни, частоту хронизации и вероятность развития гепатокарциномы (Buti М. et al., 2005). Кроме того, ответ на антивирусную
терапию среди пациентов с хроническим гепатитом, по крайней мере, частично связан с генотипом ВГВ. Распределение генотипов варьирует в зависимости от географических регионов мира, а информация по молекулярной эпидемиологии вирусов гепатита в Российской Федерации по сравнению с другими странами весьма скудная. Следует отметить, что к настоящему времени отсутствуют диагностические тест-системы для генотипирования вируса гепатита В.
Вопросы распространения мутантных форм ВГВ, генотипов ВГВ, особенности течения ХВГ при разных формах ВГВ-инфекции требуют дальнейшего изучения. Серологическая диагностика не охватывает всего разнообразия форм хронического гепатита В вследствие снижения образования или секреции ВГВ-антигенов из-за появления мутаций в precore/core и pres/s-области генома (Santantonio Т. et al, 1992; Baumert T.F., 1995; Branetto M.R. et al, 1999; Khan N., 2004).
Противовирусная терапия (ПВТ) при ХВГ имеет малую эффективность, высокую стоимость, вызывает тяжелые побочные эффекты и недостаточно активно внедряется в практическое здравоохранение (Ивашкин В. Т. с соавт., 2003; Радченко В. Г. с соав., 2004; Hadzyannis S. J. et al., 2004; Zeuzeum S. et al., 2005). Как правило, лечение аналогами нуклеозидов и нуклеотидов продолжается неопределенно долго, что может привести к развитию лекарственной устойчивости вируса гепатита В. В настоящее время очень мало известно о том, какие мутации ВГВ приводят к возникновению лекарственной устойчивости в российской популяции пациентов.
Целью работы явилось изучение молекулярно-биологических особенностей вируса гепатита В диких и мутантных форм в трех регионах Российской Федерации.
Задачи исследования
Определить распределение различных генотипов ВГВ в Санкт-Петербурге, Карелии и Якутии, выявить зависимость тяжести течения заболевания от генотипа вируса.
Определить степень распространенности precore/core и pres/s-мутантных форм ВГВ среди обследованных больных. Выявить изменения в геноме вируса гепатита В, приводящие к возникновению мутантной формы.
Выявить мутации ВГВ, приводящие к появлению устойчивости к ламивудину у обследованных больных.
Научная новизна исследования
Впервые был применен новый алгоритм генотипирования вируса гепатита В, разработанный в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ГУ НИИ гриппа РАМН, для определения генотипа вируса у пациентов с ХГВ.
Впервые установлена широкая распространенность среди больных хроническим гепатитом В HBeAg-негативной и HBsAg-негативной форм заболевания, обусловленных precore/core и pres/s-мутантными типами вируса.
Впервые обнаружено преимущественное инфицирование больных ХГВ вирусом гепатита В генотипа D и редкое инфицирование ВГВ генотипа А в Санкт-Петербурге и Карелии. Выявлены особенности клинического течения хронического гепатита в зависимости от генотипа вируса гепатита В.
Практическая значимость
В связи с отсутствием диагностических тест-систем для генотипирования вируса гепатита В, исследование распространения различных генотипов вируса в различных регионах РФ и апробация алгоритма генодиагностики и генотипирования вируса имеет важное
практическое значение для предсказания тяжести течения заболевания и результатов противовирусной терапии. Выявление особенностей распространения и роль эндемичности в циркуляции определенных генотипов возможны при изучении этих процессов в географически близких и отдаленных регионах страны.
Положения, выносимые на защиту
В трех регионах РФ (Санкт-Петербург, Карелия и Якутия) встречаются генотипы A, D и С вируса гепатита В. Распределение генотипов различается в зависимости от исследованного региона РФ. Генотипическая принадлежность ВГВ оказывает влияние на выраженность клинических проявлений и тяжесть течения хронического гепатита В.
В настоящее время HBeAg-негативная и HBsAg-негативная формы гепатита В, обусловленные precore/core- и pres/s-мутантными типами вируса, часто встречаются среди больных ХГВ и характеризуются тяжелым прогрессирующим течением заболевания и низкой репликативной активностью ВГВ, что затрудняет его молекулярно-генетическую характеристику.
Развитие устойчивости к терапии ламивудином у обследованных больных определяется двумя различными мутациями в так называемом YMDD-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В, приводящими к замене метионина на валин или изолейцин в 204 положении.
Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором выполнены ГШР-диагностика, генотипирование вируса гепатита В и секвенирование различных фрагментов генома вируса. Автором проведен сравнительный анализ полученных данных с клиническими и серологическими показателями, а также статистическая обработка
результатов. На основании полученных данных разработан и применен алгоритм генотипирования, позволяющий предсказывать течение заболевания и эффективность противовирусной терапии.
Внедрение в практику
Методы генотипирования вируса гепатита В и секвенирования различных участков генома вируса используются для предсказания исхода заболевания и результатов терапии у больных ХГВ в Специализированной клинике ГУ НИИ гриппа РАМН Санкт-Петербурга, отделении ОКБ, поликлиниках г. Петрозаводска, поликлинике КНМЦ СЗО РАМН.
Апробация диссертации
По данным работы опубликовано 15 научных работ, из них - 6 статей.
Материалы диссертации были представлены на 2-ой Международной
конференции, посвященной 75-летию С.-Петербургского института им.
Пастера, "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями", 2-4 сентября 1998 г., ;
конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии,
эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций», 2001,
Санкт-Петербург; Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с
инфекциями», 4-5 сентября 2003 г., Санкт-Петербург; конференции,
посвященной 150-летию со дня рождения П.М.Альбицкого, 9-10 октября
2003 г., С-Петербург; V съезде Научного Общества Гастроэнтерологов
России, XXXII сессии ЦНИИ Гастро-энтерологии 3-6 февраля 2005, Москва;
Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции -
теоретические и практические аспекты»; Международном
мультидисциплинарном семинаре «Микробиоциды для здоровья и репродукции человека. Медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» 2-5 ноября 2004 г.; 6-м Международном СлавяноБалтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2005».
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ПО страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4-х глав результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 11 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 238 источников, в том числе 7 на русском и 231 на английском языках.
2. Обзор литературы
Структураи организация генома
Геном ВГВ представлен кольцевой частично двухцепочечной ДНК размером около 3200 нуклеотидов (рисунок 2). Молекула ДНК состоит из полной, терминально-избыточной минус-цепи, которая на 5 -конце ковалентно связана с вирусной полимеразой, и неполной плюс-цепи. 5 -конец плюс-цепи фиксирован в Рисунок 1. Схема строения ВГВ (по Nassal М, 1999). Оболочка вируса содержит три белка L, М и S. Причем preS-домен белка L может быть обрасчен как наружу так и внутрь оболочки. Геном ВГВ внутри капсида представлен частично двуцепочечной кольцевой ДНК. 5 -конец (-)цепи ДНК ковалентно связан с ТР-доменом белка Р.
Рисунок 2. Схема организации генома ВГВ. Геномная ДНК и четыре ОРС показаны в центре рисунка. "1" и "2" обозначают прямые повторы DR1 и DR2. Внешними линиями показаны геномная и субгеномные РНК. Стрелками обозначены сайты начала транскрипции, є - энкапсидационный сигнал. PREa и PREp - посттранскрипционный регуляторный сигнал. постоянной позиции, приблизительно в 200 нуклеотидах от 5 -конца минус-цепи, тогда как положение З -конца плюс-цепи может варьировать. Таким образом, размер плюс-цепи составляет от 1700 до 2800 нуклеотидов [Molnar-Kimber К. et al., 1984].
Геном ВГВ содержит четыре перекрывающиеся открытые рамки считывания (ОРС), которые кодируют семь вирусных белков: (Р) вирусную полимеразу; (С) коровый белок HBcAg и е-антиген HBeAg; (S) три поверхностных белка (малый, средний и большой); и (X) белок X. Наибольшая из ОРС, Р, перекрывает около 80% генома. Полимераза транслируется с прегеномной РНК, размер которой составляет 3.5 т.п.о., с нее же транслируется еще один белок - HBcAg. Прекоровый белок, являющийся предшественником HBeAg, экспрессируется с другой мРНК размером 3.5 т.п.о., точка инициации которой расположена в 29-35 п.о. против хода транскрипции от точки инициации прегеномной РНК. Белки оболочки транслируются с двух мРНК: большой транслируется с preS 1 мРНК размером 2.4 т.п.о., а средний и малый - с preS2/S мРНК размером 2.1 т.п.о. Синтез белка X происходит с мРНК размером 0.9 т.п.о. [Ganem D. and VarmusH, 1987].
Экспрессия генов ВГВ регулируется четырьмя промоторами и двумя энхансерами. Коровый промотор расположен вверх от С гена. Он регулирует транскрипцию 2-х мРНК: 1) прегеномной РНК, которая служит матрицей в процессе репликации генома ВГВ, кроме того, с нее синтезируются белки С и Р; 2) ргеС РНК, с которой транслируется HBeAg. Этот промотор является гепатоспецифичным, и его активность зависит от присутствия печеночных активаторов транскрипции, таких как HNF3, HNF4 и С/ЕВР [Lopez-Cabrera М. et al., 1991; Guo W. et al., 1993; Raney A. et al., 1997]. В состав корового промотора входят минимальный или основной коровый промотор (ВСР), его активность является достаточной для инициации транскрипции, и регуляторная последовательность CURS. Важным активирующим элементом в CURS является а-бокс, который связывается с гепатоспецифичными транскрипционными факторами [Yuh С.Н. et al., 1992]. PreS J промотор также является высоко тканеспецифичным, он содержит сайты связывания HNF1 и HNF3 [Zhou D.-X. and Yen Т., 1991; Raney A. et al., 1995]. Этот промотор единственный среди промоторов ВГВ содержит характерный ТАТА мотив. PreS2/S промотор расположен внутри preSl области и содержит сайты посадки для ряда убиквитиновых транскрипционных факторов, таких как NF1, Spl и NF-Y.
Энхансер ENI занимает область между 970 и 1240 нуклеотидами и частично перекрывается с промотором гена X. ЕМ регулирует транскрипцию прегеномной РНК, гена S и гена X [Zhang P. et al, 1992; Su Н. and Yee J.-K., 1992]. EM состоит из трех доменов: 1) в 5 -конце расположен модуляторный элемент, содержащий сайты связывания как убиквитиновых, так и гепатоспецифичных транскрипционных факторов; 2) в центральной области расположен коровый домен, он связывает, по крайней мере, четыре ядерных белка: №1, RFX1, HNF3 и НМЗ; 3) З -концевой домен, перекрывающийся с промотором гена X [Garcia A.D. et al., 1993; Ori A. and Shaul Y., 1995]. EMI занимает участок, расположенный выше по течению от корового промотора и перекрывается с ним в дистальной области. ЕМІ состоит из трех главных элементов: а- и (3-бокс выполняют активаторную функцию, тогда как негативный регуляторный элемент (М Е) действует как репрессор активности энхансера. ЕМІ регулирует транскрипцию прегеномной РНК и прекоровой РНК [Yuh С.Н. and Ting L.P., 1990; Wu X. et al., 1992; Park G.T. et al., 1997].
Возле 5 -конца каждой из двух цепей ДНК расположены короткие повторы длиной 11 п.о., DR1 и DR2, которые действуют как сайты инициации синтеза полноразмерной минус-цепи и короткой плюс-цепи, соответственно.
Только минус-ДНК-цепь ВГВ является кодирующей, поэтому все гены вируса транскрибируются в одном направлении. Терминация транскрипции происходит в одном и том же поли(А)-сайте для всех РНК ВГВ. Будет ли поли(А)-последовательность воспринята как сигнал полиаденилирования или нет, зависит от расстояния между поли(А)-сайтом и промотором. Например, коровый промотор расположен менее чем в 200 п.о. от поли(А)-сайта, поэтому при транскрипции прегеномной РНК и preC-РНК сигнал полиаденилирования в первый раз игнорируется и узнается лишь после того, как транскрипт, описав круг вдоль генома, достигает поли(А) последовательности во второй раз. С другой стороны, промотор гена S расположен приблизительно в 2 т.п.о. от поли(А)-сайта, и поэтому транскрипт гена S эффективно полиаденилируется когда достигает сигнала в первый pa3[Guo W.T. et al., 1991].
Сочетанное инфицирование различными генотипами ВГВ
До сих пор микст-инфекции рассматривалась как относительно редкое событие [Heijtink R. et al., 1982; Као J. et al., 2001]. Так Kao с соавторами исследовал связь между обострением хронического гепатита В и суперинфекцией ВГВ. Суперинфекция была обнаружена у 0.8% больных с хроническим гепатитом В и у 1.9% больных с обострением. Таким образом, хотя суперинфекция действительно встречается среди хронических больных ВГВ и может приводить к обострению болезни, частота таких событий, по-видимому, довольно низка даже в областях, где инфекция ВГВ является высоко эндемичной [Као J. et al., 2001]. Значительно более высокая частота смешанной инфекции наблюдалась в Индии, где инфицированность пациентов с хроническим гепатитом В двумя генотипами А и D одновременно составляла 6% [Thakur V. et al., 2002]. Интересную особенность протекания ВГВ инфекции, вызванной генотипом G, обнаружили Като и соавторы. Несмотря на то, что ВГВ/G содержит два стоп-код она в pre-С области и не может синтезировать HBeAg, в сыворотке всех обследованных пациентов содержался этот антиген. Оказалось, что все пациенты были коинфицированы ВГВ/А, который, по видимому, и был ответственен за экспрессию HBeAg [Kato Н. et al., 2002а]. Следует отметить, что НВе-сероконверсия сопровождалась преимущественной репликацией ВГВ/G и вытеснением ВГВ/А, а также рекомбинацией между геномами ВГВ/G и ВГВ/А [Kato Н. et al., 2002b] Возможно, что микст-инфекции встречаются значительно чаще, чем принято считать, однако, их редко удается обнаружить, поскольку высокая репликативная активность одного штамма может подавлять репликацию другого. В этом случае смешанная инфекция обнаруживается только после исчезновения первого штамма. Такой сдвиг генотипов, как от А к D, так и от D к А, был действительно найден при НВе-сероконверсии у детей в Европе [Gerner P. et al, 1998; Friedt М. et al., 1999].
Одной из первых клинически выявленных и функционально охарактеризованных мутаций генома ВГВ стала мутация, приводящая к появлению стоп-кодона в precore-области, в результате чего прекращается продукция HBeAg. Не у всех пациентов с ХГВ в крови отсутствует ДНК ВГВ, несмотря на произошедшую сероконверсию HBeAg на АЬНВе. Исследования показали, что данные пациенты инфицированы ВГВ с мутациями в precore/core области генома [Brunetto M.R. et al., 1990, Akahane et al., 1990]. Данная мутация приводила к возникновению стоп-кодона в конце precore-гена и, таким образом, precore/core фьюжн-белок предшественник HBeAg не синтезировался. У таких пациентов вирусная репликация не прекращалась. Потеря HBeAg не оказывает влияния на биологию вируса, однако может иметь большое значение для взаимодействия вируса и иммунной системы хозяина. Было высказано предположение, что секретируемый HBeAg обладает внутриутробно иммунорегуляторной функцией, приводя к Т-клеточной толерантности к и HBeAg, что может предопределять развитие персистентной инфекции у новорожденных от матерей, инфицированных ВГВ [Milich D.R. et al., 1990]. В дальнейшем был продемонстрирована иммуномодуляторная роль HBeAg в презентации антигена и распознавании Т-клетками CD4+ [Milich D.R. et al., 1998]. Селекция HBeAg-мутантов в хозяине может происходить отчасти за счет иммуномодуляторных свойств HBeAg. Влияет ли и каким образом данная мутация на клиническое течение инфекции ВГВ до сих пор остается не выясненным [Baumert T.F. et al., 2007].
Мутанты играют важнейшую роль в существовании ВГВ, поддерживая инфекцию и катализируя переход к хронической форме заболевания. В ходе острой инфекции специфические антитела, индуцированные HBsAg, быстро образуют комплексы с вирусными частицами, выводят их из циркуляции и предотвращают прикрепление и проникновение вируса в клетки-мишени. Как было показано, варианты ВГВ, возникшие в результате мутаций в pre-S/S регионе, способны избежать атаки антител. Кроме того, точечные мутации, удаленные от известных антигенных детерминант, могут вызывать конформационные изменения специфических эпитопов, что делает невозможным распознавание их антителами. «Иммунологическое бегство» не ограничивается бегством от антител. ВГВ, вызывающий хроническую инфекцию, должен уклоняться от Т-клеточного ответа. Быстро эволюционирующий вирус «прощупывает» пределы нормальных адаптационных свойств иммунной системы хозяина, предоставляя мутантам возможность неограниченного размножения. Данный феномен может существенно сказываться на эффективности антивирусных вакцин, особенно если они содержат один иммунодоминантный эпитоп, и должен учитываться при создании новых вакцинных препаратов.
Мутанты ВГВ, имеющие протяженные делеции в pre-Sl регионе, были обнаружены у больных ХГВ. У данных больных HBsAg практически не синтезировался в результате потери сайтов связывания фактора транскрипции. Мутанты сосуществовали с диким типом вируса. Делеции не повлияли на функцию гена полимеразы, таким образом, мутантный вирус сохранял способность к репликации. In vitro, однако, секреция инкапсидированного мутантного генома блокировалась и была восстановлена путем ко-трансфекции плазмид, экспрессирующих только пре-Sl, npe-S2 и S белки. Было высказано предположение, что in vivo также произошла транс-комплементация [Melegari М. et al., 1994]. Позднее новый HBsAg мутант был описан у пациентов с хроническим активным гепатитом В при наличии анти-HBs. У большей части вирусов в популяции была обнаружена делеция 31 нуклеотида, приводящая к сдвигу ОРС и появлению стоп-кодона после 21 аминокислоты HBsAg. В результате поверхностный протеин лишался основных нейтрализационных эпитопов, что позволяло вирусу размножаться в присутствии анти-HBs. Полимеразная ОРС была серьезно повреждена делецией и для того, чтобы обеспечить непрерывное образования вирусных частиц, требовалась транс-активация меньшинством интактных геномов [Weinberger К.М. et al., 1999]. Очевидно, что подобные механизмы способствуют продлению существования таких мутантов. Новые вакцин-ассоциированные HBsAg мутанты с missense мутациями в регионах вне а детерминанты были обнаружены у иммунизированных детей, рожденных HBV-вирусоносительницами [Chong-Jin О. et al., 1999]. Мутации состояли в замене аминокислот в позициях 116, 118, 120, 159, 183 и 184. Для некоторых из них было показано снижение связывания с «-специфическими моноклональными антителами. Что это значит, в смысле приспособительной стратегии вируса, еще предстоит выяснить.
Генотипирование ВГВ в популяциях больных гепатитом В в Санкт-Петербурге, Петрозаводске и Якутии
В последнее десятилетие ведутся интенсивные исследования генотипов и вариантов ВГВ циркулирующих в различных регионах мира. К настоящему времени накоплено значительное количество данных, указывающих на то, что вирусная гетерогенность является важным фактором, влияющим на течение заболевания и антивирусную терапию.
Хотя в последние годы анализу геномных последовательностей значительно способствовало появление и развитие автоматических секвенаторов, тем не менее, секвенирование до сих пор остается дорогостоящим, трудоемким и недоступным для многих исследовательских лабораторий. По этой причине неоднократно предпринимались попытки использовать различные методы, основанные на ПЦР, такие как использование типоспецифичных праймеров (Norder Н. et al., 1990; Repp R. et al., 1993) и RFLP (Shih J. et al., 1991; Lindh M. et al, 1997; Lindh M. et al, 1998), для генотипирования ВГВ. Однако, только в последних двух упомянутых работах были идентифицированы все известные генотипы, и корректность результатов была продемонстрирована на большом количестве образцов.
Генотипирование ВГВ по участку pre-S проводили по методу, предложенному Линдом (Lindh et al., 1998). Метод основан на амплификации сегмента, расположенного между 2823 и 80 нуклеотидами генома ВГВ с последующей инкубацией амплификата с рестриктазами Eco47I (Avail) и Mbol (DpnII). Размеры образующихся рестрикционных фрагментов представлены в таблице 6. Метод позволяет идентифицировать все известные генотипы.
Для генотипирования ВГВ по участку гена S использовали метод аналогичный методу Линда (Lindh et al, 1997), однако, отличающийся от него в некоторых деталях. ПЦР проводили с праймерами S1 и S2, которые используются нами для рутинной диагностики ВГВ.
Для генотипирования ВГВ использовался выше представленный алгоритм. За период с 2002 по 2006 гг. проведено генотипирование ВГВ в плазме крови от 418 больных с хронической формой гепатита В из разных регионов РФ.
В результате проведенных исследований установлено, что в Санкт-Петербурге у 173 (96%) больных был обнаружен генотип D, генотип А был выявлен у 7 (4%) больных, генотип С не определялся (рис.1). В Петрозаводске встречаемость генотипа А была выше и составила 20,3% (36 больных), а генотип D встречался у 128 (71,6%) больных.
Были изучены клинические показатели больных ХГВ из Петрозаводска и установлена их связь с генотипом ВГВ. Существовала зависимость тяжести течения гепатита от генотипа ВГВ. Хронический гепатит, обусловленный генотипом А, характеризовался более тяжелым течением, проявлявшимся в более частом развитии ХГ высокой активности - у 46,7% больных и более частом формировании ЦП - у 20,0% больных на более ранних сроках - к концу I декады течения гепатита. При D генотипе высокая активность ХГ диагностирована лишь у 15,1% (р 0,05) больных, а ЦП выявлялся у 7,5% (р 0,05) больных к концу II декады заболевания. Клиническая симптоматика была наиболее ярко выражена у больных с генотипом А. Проявления иммуновоспалительного синдрома также были значительнее при А генотипе: концентрация у-глобулинов составила 23,1±2,3% против 18,2 ± 1,6 % (р 0,05) при D генотипе, IgG - 15,9±1,9 г/л против 13,5±0,3 г/л (р 0,05) при D генотипе. Виремия при генотипе А встречалась реже - у 26,7% больных, а при D генотипе несколько чаще - у 39,6% больных (р 0,05), что было связано с HBsAg-негативным статусом всех больных с А генотипом. В то же время частота обнаружения вируса в печени была несколько выше при А генотипе - 100%, чем при D генотипе - 92,5% (р 0,05), и вирусная нагрузка в печени при А генотипе была выше, чем при D генотипе - 2,6±0,3 и 2,0±0,2 (р 0,05), соответственно. О большей иммуногенности генотипа А свидетельствовала более тесная связь тканевой вирусной нагрузки с уровнем у-глобулинов (r=0,46; р 0,05), IgG (г=0,5; р 0,05) и ИГА (г=0,58; р 0,05), чем при генотипе D - г=0,1; г= 0,35 и г=0,39 (р 0,05). Генотип А вызывал более значительный НВС и более частое формирование ЦП. Генотип D встречался среди больных в 3,5 раза чаще и вызывал более мягкое течение гепатита с умеренно выраженным некротически-воспалительным синдромом и более редким формированием ЦП. HBsAg-фенотип при генотипе D также оказывал влияние на клиническую картину заболевания - более высокая активность гепатита отмечалась при отсутствии HBsAg.
Несмотря на то, что ДНК ВГВ выявляли не только в плазме крови, но и в биоптатах печени, у 14 (8%) больных с ХГВ из Петрозаводска генотип определить не удалось, что может быть связано с низкими показателями вирусной нагрузки в исследуемых образцах. Следует отметить, что для данной выборки больных по результатам серологических исследований характерна высокая частота встречаемости мутантных форм ВГВ.
В отличие от распределения генотипов в Северо-Западном регионе, исследование 59 образцов, полученных из разных улусов (районов) Якутии, показало, что на территории республики отмечается циркуляция ВГВ трех генотипов: D, А и С. При этом генотип D составил 42,4%, А - 25,4%, С -25,4% случаев. В двух образцах сыворотки крови была обнаружена коинфекция генотипами А и D, а в двух других - генотипами А и С (6,8%).
Образцы плазмы крови были собраны у больных ХГВ трех национальностей из 7 различных поселков и городов Вилюйского, Верхоянского и Жиганского улусов Якутии. Результаты определения генотипов представлены в таблице 7. Различный объем выборок не позволил выявить статистически достоверные отличия в распределении генотипов в зависимости от населенного пункта, также как и в зависимости от национальности.
Выявление мутаций в YMDD-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В
Современные способы лечения хронического гепатита В не дают устойчивого эффекта. Как правило, лечение аналогами нуклеозидов продолжается неопределенно долго, что может привести к развитию устойчивости возбудителя и отдаленным побочным эффектам. Полимераза ВГВ, как и все РНК-зависимые полимеразы, содержит характерный мотив YMDD (тирозин-метионин-аспарагиновая кислота- аспарагиновая кислота) сайта каталитического расщепления, локализованного внутри субдомена С. Мутации, вызывающие замену метионина на валин или изолейцин в 204 положении, приводят к нарушению способности дНТФ-связывающего кармана полимеразы взаимодействовать с нуклеотидами, в том числе и с их аналогами, служащими для терминации синтеза вирусной ДНК и прекращения работы полимеразы.
Выявление мутаций в YMDD-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В проводили у 11 больных, длительно получавших терапию ламивудином (более 48 недель). Прямое секвенирование фрагментов генома вируса гепатита В выявило 2 типа мутаций (рис. 16). Мутации в YMDD-участке вируса гепатита В были обнаружены у 8 из 11 больных с ХГВ, длительно получавших терапию ламивудином (табл.10). При этом в 5 случаях наблюдалась замена M204V (45,5%), а в трех случаях- M204I (27,3%). Одной из наиболее эффективных стратегий, используемой вирусом для того, чтобы избежать элиминирующего воздействия иммунной системы хозяина и поддержать персистенцию, является высокая аминокислотная изменчивость вирусных белков. Различные аминокислотные замены возникают у ВГВ в результате иммунного отбора в ходе естественного течения инфекции, в связи с иммуномоделирующей и медикаментозной терапией, а также в ответ на вакцинацию [Ngui S. et al., 1999]. Поэтому анализ биологической и патогенетической роли различных мутаций крайне важен для прогнозирования течения и исходов болезни, а также для разработки методов специфической терапии и профилактики.
Для того чтобы проанализировать аминокислотные замены, нуклеотидные последовательности, полученные в данном исследовании, были транслированы в белковые и выровнены с последовательностями, полученными из GenBank/EMBL, с помощью программы GeneRunner (рисунки 17 и 18). Предсказание серотипа. Серологическая гетерогенность ВГВ определяется несколькими аминокислотными заменами в белке S. Замена Lys на Arg в позициях 122 и 160 определяет антигенные детерминанты d/y и w/r, соответственно. Остатки 127 и 134 определяют различия между детерминантами w. Детерминанты wl и w2 характеризуются наличием в 127 позиции Pro, w3 - Thr, w4 - Leu; w2 отличается от wl аминокислотной заменой Phe— Tyr в позиции 134, кроме того, wl-специфичность также зависит от присутствия Arg122 (Norder Н. et al., 1992а).
Три штамма sAlYak, sA2Yak и s A3 Yak содержали Lys122, Lys160 и Pro , и, таким образом, должны быть отнесены к серотипу adw2. Штамм sClYak содержал Arg122 и Lys160 и, следовательно, принадлежал серотипу adr. У четырех штаммов была определена ay-специфичность (Arg ), причем один из них - sDlYak - имел в позиции 127 Thr, который определяет детерминанту w3; тогда как три штамма - sD2Yak, sD3Yak sD4Yak - имели Pro1 и Туг , что характерно для детерминанты w2.
Все предыдущие изоляты, относящиеся к генотипу D и описанные в литературе, принадлежали к субтипу ayw (ayw2, ayw3 и, редко, ayw4). В связи с этим интересно отметить, что штамм sD5SPt имел необычные для генотипа D аминокислотные замены Lys и Arg , что в соответствии со схемой Нордер [Norder Н. et al., 1992а] характеризует его как субтип adr. Однако, все описанные до сих пор варианты ВГВ, принадлежащие к субтипу adr в позиции 134 несли Phe, тогда как у sD5SPt в этой позиции находится Туг. Кроме того, дополнительные аминокислотные замены расположены в позициях ПО, 113 и 126. Очевидно, молекулярный подход, основывающийся на предсказании субтипа HBs по нескольким критическим остаткам, предложенный Нордер [Norder Н. et al., 1992а], в определенных случаях может не согласовываться с серологическим типированием оригинальной антисывороткой.
В девяти последовательностях было обнаружено 16 аминокислотных замен, при этом 9 замен (6 из них уникальные) были расположены в узкой области, перекрывающейся с В-клеточным эпитопом, между 115 и 138 аминокислотами белка S (рисунок 18). Все три якутских изолята, принадлежащих к генотипу А, несли замену 115 Thr— А1а; эта мутация была обнаружена у HBs-негативных пациентов, хотя всегда сопровождалась дополнительными аминокислотными заменами в MHL (Hou J. et al., 2001). Изолят sDlYak нес замены 118 Thr—»Val и 128 Ala— Val, встречающиеся у пациентов, получавших интерфероновую терапию [Gunther S. et al, 1998] и у HBs-негативных пациентов с ХГВ [Banerjee К. et al., 1999]. Эти мутации вызывали изменение реактивности связывания моноклональных антител [SwensonP. et al., 2001].
Изолят sD3Yak нес замену 138 Cys Arg. Как показано в экспериментах по направленному мутагенезу, замена Cys-138 не влияет на сборку и секрецию субвирусных частиц, однако значительно изменяет структуру субтиповой детерминанты у [Mangold С. et al., 1995].
Изолят sClYak нес замену 126 Thr—»Asn. Эта мутация была обнаружена у детей, получавших иммунопрофилактику для предотвращения переноса ВГВ от матери [Miyake Y. et al., 1996]; у взрослых, инфицированных ВГВ несмотря на вакцинацию [Не С. et al., 2001]; а также среди анти-НВБ-положительных носителей ВГВ [Yamamoto К. et al., 1994].
Таким образом, большая часть аминокислотных замен в белке S, обнаруженных в нашем исследовании, была расположена внутри или в непосредственной близости от В-клеточного эпитопа, что в той или иной степени может влиять на экспрессию группоспецифичных детерминант и, возможно, позволяет вирусу ускользать от иммунного ответа.
