Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вирус герпеса 8 типа (ВГ-8), или вирус, ассоциированный с саркомой Капоши, был открыт в 1994 году Яном Чангом (Chang et al., 1994). В большинстве развитых стран ВГ-8 не является убиквитарной инфекцией и вероятность его обнаружения в крови здоровых людей для Европы и США составляет 1-3%, а для Японии 0,2% . Исключением среди европейских стран является Италия, где ВГ-8 выявляется в 28% случаев. Более, чем у 50% людей ВГ-8 выявляется в странах центральной Африки, включая Кению и Уганду (Verma et al., 2003). Статистические данные о распространении вируса герпеса 8 типа в Российской Федерации разрозненны и малочисленны (Кадырова, 1999, 2003).
Наиболее распространенной патологией, ассоциированной с ВГ-8, является саркома Капоши (СК), идиопатическая форма которой была впервые описана в 1872 году М. Капоши (Kaposi., 1872). В диагностике СК часто возникают затруднения, так как многие сосудистые новообразования способны симулировать кожные элементы СК. Начальные периоды СК отличаются неясной гистологической картиной и создают трудности в постановке диагноза (Молочков, 2002). Поэтому необходимо оптимизировать диагностику данной инфекции, используя различные подходы и их комбинации. Совершенствование диагностики также целесообразно при оценке рисков трансплантации органов и тканей. Представляется важным тщательно исследовать состояние иммунной системы и, в частности, системы цитокинов у пациентов с СК, так как дефекты иммунной системы у данных пациентов способствуют развитию вирусной инфекции.
Целесообразно также определение особенностей иммунитета, сочетающихся с обнаружением в крови маркеров герпесвируса 8 типа. Это поможет в понимании условий, при которых осуществляется жизнедеятельность ВГ-8, и механизмов его активации.
Исследование новых лекарственных препаратов, в частности их антивирусной активности в отношении герпесвирусной инфекции, позволит расширить арсенал применяемых терапевтических средств. Применение пептидов, в качестве лекарственных препаратов, позволит минимизировать побочные эффекты лечения.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящего исследования заключалась в определении характерных особенностей иммунитета у пациентов с кожными заболеваниями, ассоциированными с герпесвирусной инфекцией и совершенствование критериев подбора лекарственных средств для терапии больных с этой инфекцией.
Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:
-
Провести клинико-иммунологическое обследование здоровых добровольцев и пациентов с кожной патологией, включая идиопатическую саркому Капоши (СК).
-
Провести диагностику семи представителей семейства Herpesviridae – вируса простого герпеса 1, 2 типов (ВПГ1,2), ВГ-6 и ВГ-8, цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), вируса Varicella Zoster (ВЗ) у пациентов с СК, кожной патологией и у здоровых лиц и оценить частоту их распространения, используя различные методы, а также определить наличие ДНК ВГ-8 в биоптатах пациентов с СК и здоровых лиц.
-
Провести сравнительный анализ показателей иммунитета и особенностей их изменений при герпетической патологии, вызываемой ВПГ1,2, ЦМВ, ВЭБ, ВГ-6, ВГ-8, ВЗ.
-
Определить изменения в синтезе цитокинов, продуцируемых основными иммунокомпетентными клетками, на уровне транскрипции и продукции у пациентов с саркомой Капоши, другой кожной патологией и у здоровых лиц.
-
Исследовать маркеры апоптоза Fas, Fas Ligand, NF-kB, каспазы 3 и 8 на уровне транскрипции у больных СК, кожной патологией и у здоровых лиц.
-
Провести скрининг in vitro препаратов пептидной природы в отношении ВПГ-инфекции и определить потенциальную возможность их применения.
Научная новизна и практическая значимость.
-
Установлено, что для оптимальной диагностики инфекции, вызванной ВГ-8, необходима комбинация методов ИФА и ПЦР. Наиболее эффективной является диагностика ДНК ВГ-8 в биоптате из очага саркомы Капоши.
-
Впервые проведено комплексное обследование больных с классической саркомой Капоши, включающее определение семи представителей семейства Herpesviridae и широкого спектра цитокинов методами ИФА и ПЦР с обратной транскрипцией.
-
Впервые определены наиболее характерные особенности синтеза цитокинов у больных с классической саркомой Капоши, ассоциированной с ВГ-8, указывающие на активацию моноцитов/макрофагов, Th-2, Treg, и B-лимфоцитов и угнетении Th-1.
-
Впервые показано, что у больных с классической саркомой Капоши наличие IgG к малому капсидному протеину ВГ-8 коррелирует с пониженными значениями ИФН- (р=0,01), а наличие ДНК ВГ-8 коррелирует с повышением продукции рецепторного антогониста к ИЛ-1 (р=0,0015).
-
Впервые проведен скрининг 15 новых веществ полипептидной природы, обладющих противовирусной активностью в отношении ВПГ-2, и выработаны новые критерии оценки их эффективности.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Подтверждена выраженная ассоциация между маркерами ВГ-8 и диагнозом саркома Капоши и показано, что использование двух методов определения маркеров ВГ-8 (ПЦР и ИФА) повышает вероятность диагностики данной инфекции в 1,7 раза по сравнению с использованием одного из методов. Применение метода ПЦР для определения ДНК ВГ-8 в биоптатах СК повышает вероятность обнаружения ВГ-8 до 100%.
-
Определена частота обнаружения вирусов семейства Herpesviridae у пациентов с саркомой Капоши: выявлена повышенная частота обнаружения ДНК ВЗ и ВГ-6 в МПК в 1,5 раза по сравнению со здоровыми и в 2-3 раза по сравнению с пациентами с кожной патологией. Показано снижение в 2,5 раза частоты выявления ДНК ВПГ-1,2 в МПК пациентов с саркомой Капоши и кожной патологией по сравнению со здоровыми лицами.
-
У пациентов с КП снижена вероятность обнаружения IgG к ВГ-6 в 1,5 раза по сравнению с другими осбледуемыми, наиболее выраженная у больных с псориазом.
-
Не обнаружено достоверных различий в частоте выявления ДНК ВЭБ и ЦМВ в группах СК, КП и здоровых лиц.
-
Определено основное направление иммунного ответа по гуморальному типу у пациентов с саркомой Капоши, ассоциированной с ВГ-8: по сравнению со здоровыми лицами отмечено повышенние уровней ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, снижение уровня ИЛ-2, продукции ИФН-, ИФН- и чувствительности к препаратам интерферонов I и II типа.
-
Обнаружена корреляция между наличием IgG к малому капсидному протеину ВГ-8 и снижением количества ИФН-, а также между выявлением ДНК ВГ-8 в мононуклеарах периферической крови (МПК) и повышенным уровнем рецепторного антогониста к ИЛ-1.
-
В группе пациентов с кожной патологией было обнаружено статистически значимое снижение значений ИЛ-4 и ИЛ-10 по сравнению с больными саркомой Капоши и здоровыми лицами.
-
Усовершенствованы критерии оценки иммуномодулирующего эффекта пептидных препаратов, обладающих антивирусной активностью.
Апробация работы.
Основные положения работы были представлены на I Международной конференции «Проблемы диагностики, лечения и профилактики герпесвирусных инфекций» (Москва, 2008 г.), на IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (С-Петербург, 2008 г.) и IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009 г.). Материалы были доложены на конференции «Молодых ученых» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России в апреле 2009 г., на конференции отдела медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России в ноябре 2009 г. и на совместном заседании Отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России 16 ноября 2010 г.
Структура и объем диссертации.
