Введение к работе
Актуальность работы. Актуальность проведенного исследования определяется важной ролью, которую респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) играет в структуре инфекционной патологии дыхательного тракта. РСВ является одной из основных причин госпитализации детей первых двух лет жизни (Greenough А., 2009). Смертность от РСВ-инфекции (РСВИ), регистрируемая среди госпитализированных пациентов в возрасте до 18 лет, варьирует в различных странах в пределах 0-33%, достигая 37% при осложненном анамнезе (Welliver R., et al., 2010). Несмотря на то, что РСВИ представляет наибольшую опасность в раннем возрасте, РСВ является важным патогенетическим фактором в структуре респираторных заболеваний всех возрастных групп (Walsh Е., 2011). Факторами риска для осложненного течения РСВИ являются ранний и престарелый возраст, наличие кардио-пульмонологических заболеваний, иммунодефицитных состояний. Среди взрослых реципиентов трансплантатов различных органов РСВИ принимает тяжелые формы и может являться причиной смерти 30-100% пациентов (Whimbey E.and Ghosh S., 2000). Адаптивный иммунитет, формирующийся в результате перенесенной РСВИ как у детей (с еще незрелой иммунной системой), так и у взрослых, является краткосрочным и не обеспечивает полную противовирусную защиту, что является одной из причин реинфекций, наблюдаемых на протяжении всей жизни (Murry A. and Dowell S., 1997). Материнские анти-РСВ антитела, содержащиеся в крови новорожденных, также не гарантируют полную защиту от инфицирования (Vangeel I. et al., 2007). Долгосрочные наблюдения показывают, что поражение нижних дыхательных путей в результате этой инфекции может повлечь за собой функциональную дыхательную недостаточность, регистрируемую в течение последующих 3-4 лет (Ogra Р., 2004). До 70% маленьких детей, госпитализированных с РСВ- бронхиолитами, подвержены рецидивирующим эпизодам бронхообструкции в течение последующих 6-12 лет (Hyvarinen М. et al., 2007), что связано с риском развития в дальнейшем бронхиальной астмы. РСВИ способствует развитию хронических легочных заболеваний у взрослых - хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), а также бронхиальной астмы (Чучалин А., и др., 2007; Traves S. and Proud D., 2007).
В большинстве случаев РСВИ протекает в виде обычного ОРЗ. Причины и механизмы осложненного течения РСВИ (бронхиолита, бронхита или пневмонии) и ее отдаленных последствий до конца не ясны и являются в настоящее время предметом интенсивного изучения. В последние годы было показано, что ключевую роль при этом играет нарушение баланса Thl/Th2-зависимых регуляторных механизмов со сдвигом в сторону активации Тп2-опосредованных реакций, оказывающих патогенное действие (Becker Y., 2006). РСВ обладает мощным иммуномодулирующим потенциалом. Индуцируемая им патология может быть обусловлена как супрессией, так и гиперактивацией различных типов иммуно-компетентных клеток. Баланс между протективными и патологическими иммунными реакциями весьма подвижен. В зависимости от конкретных условий (состава локальной ци-токинной среды, генетической предрасположенности, наличия сопутствующих заболева-
ний) одни и те же иммуннологические механизмы могут индуцировать как противовирусную защитную, так и патологические реакции (Oshansky С. et al., 2009). Такая двойственность присуща также гуморальному противовирусному иммунитету. В модельных опытах было показано, что наряду с противовирусным протективным действием РСВ-специфические антитела могут принимать участие в иммунопатологических механизмах, обуславливающих тяжелое течение экспериментальной РСВИ у лабораторных животных.
Большинство исследований, изучающих патогенез РСВИ, выполнено в модельных экспериментах на животных, которые не всегда адекватно отражают процессы, протекающие в организме человека. До сих пор при изучении закономерностей противовирусного иммунитета преобладают исследования, посвященные Т-клеточным реакциям. Механизмы В-клеточного иммунитета изучены в значительно меньшей степени. О характере гуморального анти-РСВ иммунитета у инфицированных больных до сих пор можно судить главным образом на основании работ, выполненных 20-30 лет назад, что свидетельствует о недостаточной изученности проблемы на современном уровне. При этом некоторые недавно обнаруженные особенности патогенеза РСВИ указывают на необходимость изучения закономерностей именно В-клеточного иммунного ответа. Так, из двух основных поверхностных гликопротеинов (F и G) образование анти-РСВ протективных цитотоксических CD8+ Т-клеток вызывает только F-белок. При этом вируснейтрализующие антитела формируются в ответ на воздействие обоих гликопротеинов (de Waal L. et al., 2006). Для защиты от РСВ необходимы высокоаффинные AT к G-белку, что обусловлено патогенным действием на иммунную систему определенных антигенных детерминант этого гликопротеина. Кроме того РСВ обладает уникальной для респираторных вирусов особенностью - наличием секреторной формы G-белка (sG), играющей в организме роль «антигенной ловушки» для нейтрализующих AT (Bukreyev A. et al., 2008). Эти особенности структуры РСВ должны быть учтены при создании вакцинных препаратов.
Объектом клинических исследований являются преимущественно дети до двух лет жизни с первичными РСВИ. Однако модельные эксперименты свидетельствуют о том, что механизмы противовирусной гуморальной защиты, так же как и иммунопатологии, в том числе обусловленные действием AT, различны при первичном и повторном инфицировании. Недостаточное понимание этого аспекта патогенеза РСВИ привело к трагическим последствиях при введении детям инактивированной формалином РСВ-вакцины. Этот тип вакцин без патогенных последствий был применен при вакцинации против гриппа и некоторых других ОРВИ. Однако в случае РСВ введение препарата привело к осложненному течению первичной РСВИ (с несколькими летальными исходами) по сравнению с непривитыми детьми грудного возраста (Kim Н. et al.,1969). Такого негативного эффекта не было показано в группах старших детей, уже перенесших РСВИ до вакцинации (Waris М. et al., 1997). Этот пример ясно показал необходимость расширения возрастных рамок при изучении закономерностей формирования гуморального РСВ-специфического иммунного ответа у пациентов.
Изучению РСВ-специфического гуморального ответа у пациентов с точки зрения соотношения активности иммуноглобулинов различных изотипов посвящены лишь единичные работы. Тем не менее, результаты модельных экспериментов показывают значимость изучения этого вопроса. Например, показана патогенная роль анти-РСВ IgE, связь этих AT с развитием аллергических реакций, характерных для тяжелого течения РСВИ: легочной эозинофилии и повышенной гиперреактивности дыхательных путей (Dakhama A. et al., 2009).
Изотипическая структура противовирусного гуморального ответа дает определенное представление об особенностях регуляторных механизмов и характере патогенеза заболевания. Соотношение активности антиген-специфических IgG2a/ IgGl традиционно рассматривается как показатель баланса между протективным Thl и патогенным Th2 -типом иммунного ответа у мышей (Nurieva R., and Chung Y., 2010), в том числе при характеристике гриппозной инфекции и свойств гриппозных вакцин. Отсутствие соответствующей информации затрудняет понимание механизмов патогенеза РСВИ, и той роли, которую играют при этом РСВ-специфические AT.
Решение этих вопросов может быть осуществлено с использованием иммунофер-ментного анализа. Иммуноферментные тест-системы (ИФТС) для серодиагностики РСВИ производятся целым рядом зарубежных фирм, однако спектр РСВ-специфических иммуноглобулинов (Ig), которые можно детектировать с их помощью, ограничен тремя изотопами - G, М и А. Нет коммерческих ИФТС для выявления анти-РСВ IgE и субклассов IgG. Все вышеизложенное определяет необходимость создания отечественных иммунофер-ментных тест-систем, позволяющих проводить углубленный анализ изотипической и сайт-специфической структуры анти-РСВ гуморального ответа у больных. Создание чувствительных серологических тест-систем имеет также важное практическое значение. Поскольку симптомы РСВИ и гриппа сходны клинически, РСВИ в период эпидемии гриппа остаются во многих случаях нераспознанными. Необходимость дифференциальной диагностики РСВИ и назначения своевременного лечения диктуется тем, что РСВ значительно чаще, чем другие респираторные вирусы, вызывает развитие иммунопатологических проявлений в легких (Walsh Е. et al., 2007).
Цель работы состояла в сравнительной оценке структуры и особенностей РСВ-специфического гуморального иммунного ответа в зависимости от формы бронхолегочной патологии и возраста пациентов с использованием разработанных иммуноферментных тест-систем моноклонального типа.
Задачи исследования
1. Сконструировать иммуноферментные тест-системы (ИФТС) для детекции в сыворотках крови РСВ-специфических антител различных классов и подклассов (IgG, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE), а также выявления IgG, взаимодействующих с функционально значимыми консервативными эпитопами F- и G- белков РСВ.
-
С применением сконструированных ИФТС охарактеризовать особенности реагирования РСВ-специфических иммуноглобулинов различных изотипов в зависимости от возраста пациентов и характера заболевания.
-
Охарактеризовать вируснейтрализующую активность антител в сыворотках крови пациентов с различными клиническими формами РСВИ.
-
Оценить влияние перенесенной ранее РСВИ на течение последующих респираторных заболеваний.
-
Провести сравнительную оценку иммунного ответа, направленного к консервативным эпитопам F- и G- белков РСВ, у пациентов с РСВИ.
6.Проанализировать влияние материнских антител на характер РСВ-специфического гуморального ответа, формирующегося у детей при первичном заболевании.
7. Провести сравнительную оценку формирования аутореактивных антител при
респираторных вирусных заболеваниях различной этиологии.
8. Оценить in vitro и in vivo иммуногенные и протективные свойства препаратов,
созданных на основе синтетического пептида, имитирующего структуру части главного
нейтрализующего домена F- белка РСВ.
Научная новизна работы. Впервые в России сконструированы ИФТС для детекции РСВ - специфических Ig семи изотипов (М, А, Е, Gl, G2, G3, G4), а также ИФТС на основе синтетических пептидов (СП), представляющих структуру иммунодоминантных эпитопов F- и G- белков РСВ, для выявления эпитоп-специфичных IgG. Разработанные ИФТС позволяют проводить углубленный анализ структуры анти-РСВ гуморального иммунного ответа.
С использованием разработанных ИФТС впервые проведена комплексная сравнительная оценка ответа со стороны РСВ-специфических AT различных классов и субклассов в зависимости от возраста и формы заболевания пациентов. В соответствии с соотношением активности ответа Thl- и Тп2-регулируемых AT определен тип РСВ-специфического гуморального иммунного ответа в различных группах пациентов. Впервые проведена сравнительная оценка ответа со стороны Th2-зависимых анти-РСВ IgE и IgG4 при РСВИ у детей и взрослых, осложненной аллергическим компонентом. Полученные данные дополняют существующие представления о патогенезе РСВИ.
Впервые показано, что характерной особенностью осложненного течения повторных РСВИ как у детей, так и у взрослых, является активность РСВ-специфических IgM, значительно более высокая, чем при неосложненном течении заболевания.
Впервые показаны изменения иммунодоминирования при ответе на В-клеточные эпитопы поверхностных гликопротеинов РСВ у пациентов с РСВ-реинфекциями в зависимости от характера заболевания. Полученные результаты дополняют данные литературы о механизмах иммунодоминирования среди Т-клеточных детерминант РСВ.
Впервые показано негативное влияние материнских IgG, специфичных к консервативным антигенным детерминантам поверхностных гликопротеинов РСВ, на характер РСВ-специфического иммунного ответа, формирующегося у детей в возрасте до 10 месяцев при первичном заболевании.
Впервые выявлен синтез аутореактивных IgM и IgG у пациентов с осложненными формами РСВИ.
Впервые синтезированы препараты с использованием синтетического пептида, имитирующего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка РСВ, и оценены его иммуноген-ные и протективные свойства.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Сконструированные ИФТС для детекции РСВ-специфических иммуноглобулинов различных изотипов рекомендуется использовать как при серодиагностике РСВИ, так и при оценке роли РСВИ в структуре инфекционной респираторной патологии среди различных групп пациентов.
-
Изотипическая структура РСВ-специфического ответа, оцененная с использованием разработанных ИФТС, отражает особенности гуморального иммунитета, характерные для определенного возраста и присущие различным формам бронхолегочной патологии при РСВИ.
3. Осложненное течение РСВИ ассоциировано со сниженной вирус-
нейтрализующей активностью антител, а также повышенным уровнем синтеза "Не
регулируемых РСВ-специфических иммуноглобулинов.
-
Перенесенная ранее РСВИ, осложненная аллергическим компонентов, показателем чего является высокое содержание в крови предсуществующих анти-РСВ IgE, оказывает негативное влияние на течение последующих респираторных заболеваний.
-
Характер иммунодоминирования при ответе на В-клеточные эпитопы поверхностных гликопротеинов РСВ меняется у РСВ-инфицированных лиц в зависимости от клинической формы заболевания.
-
Пассивно приобретенные материнские IgG, специфичные к консервативным детерминантам F-белка (аминокислотная последовательность 221-232) и G- белка (последовательности 152-164 и 184-198) РСВ, оказывают негативное влияние на формирование адаптивного РСВ-специфического гуморального иммунного ответа при первичном инфицировании детей.
-
При осложненном течении РСВИ наблюдается интенсивный синтез аутореактивных IgM и IgG.
-
Препараты, сконструированные с использованием синтетического пептида, представляющего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка РСВ (аминокислотная последовательность 221-232), оказывают иммунопатогенное действие на лабораторных животных.
Практическая значимость результатов работы. Сконструированные ИФТС для детекции анти-РСВ Ig различных изотипов рекомендуется использовать для подтверждения диагноза РСВИ, а также для оценки протективной и потенциально патогенной составляющих РСВ-специфического иммунитета.
Выявление РСВ-специфических IgE на ранних сроках заболевания позволит снизить риск отдаленных последствий перенесенной инфекции, в том числе рецидивирующей брон-хообструкции и формирования хронической бронхолегочной патологии в более зрелом воз-
расте. Высокое содержание в крови анти-РСВ IgE является прогностическим показателем повышенного риска осложненного течения последующих респираторных заболеваний.
Для оценки вируснейтрализующей активности РСВ-специфических AT был предложен новый вариант постановки реакции нейтрализации (РН) с оценкой результатов в мик-рокультуральном ИФА при использовании вирусспецифических МКА. Этот метод может быть применен в эпидемиологических исследованиях для определения уровня защищенности населения от РСВИ.
Детекция анти-РСВ IgA в сыворотках крови непрямым ИФА предложена в качестве диагностического теста, показавшего высокую эффективнось при выявлении заболевания у детей первых лет жизни. Простота исполнения позволяет применять этот метод в практических лабораториях.
Низкое содержание в крови предсуществующих IgG, взаимодействующих с синтетическими пептидами, имитирующими структуру антигенных детерминант, функционально значимых для репродукции РСВ, может служить прогностическим показателем для выявления контингентов с повышенным риском РСВ-инфицирования. Этот подход может быть использован при изучении группового гуморального РСВ-специфического иммунитета.
Внедрение результатов работы. По результатам Госиспытаний получен Сертификат производства (СП № 002907, июнь 2010) на производство медицинского иммунобиологического препарата «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к респираторно-синцитиальному вирусу (ИФТС-PC-IgG)». ИФТС внедрена в практику и используется для диагностики РСВИ в клиниках и ФГУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии» на территории России.
Опытные образцы сконструированных ИФТС для детекции анти-РСВ Ig различных изотипов прошли первичную апробацию в стационарах С.-Петербурга.
Методические рекомендации по детекции специфических иммуноглобулинов различных изотипов к вирусам гриппа и ОРЗ иммуноферментным методом приведены в «Практических рекомендациях по лабораторной диагностике вирусных инфекций» (С.Петербург, 2005).
Работа выполнялась в рамках плана НИР ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразви-тия РФ, начиная с 1995г, а также по темам, выполненным в 2002 - 2003гг в рамках Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", Генеральным Заказчиком которой являлось Министерство промышленности, науки и технологий Российской Федерации.
Личный вклад автора в проведенные исследования состоял в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, разработке методологии, выборе моделей, статистической обработке, анализе полученных результатов и формулировке научных положений. Вклад соавторов выражается в предоставлении клинических материалов (Суховецкая В.Ф., Головачева Е.Г., Львов Н.И., Войцеховская Е.М.), результатов лабораторной диагностики РСВИ, проведенной в РСК и изоляции вирусов в культуре клеток (Голованова А.К.), иммунофлуоресценции (Милькинт К.К.), ИФА-выявления антигенов
РСВ в клинических материалах (Амосова И.В.), предоставлении противовирусных моно-клональных AT (Сорокин Е.В., Царева Т.Р.). Автор выражает благодарность Зарубаеву В.В. за патоморфологический анализ, Васильевой И.А. и Головачевой Е.Г. за предоставление данных об интерфероновом статусе обследованных нами пациентов, Смирновой Т.Д. за предоставление клеточных культур, Власову Г.П. за синтез пептидных препаратов, Н.Н. Хромову-Борисову за предоставление авторской статистической программы SANCT.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту д.м.н. А.А. Сомининой за помощь в организации исследований, консультации при обработке материала и оформлении диссертации.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были отражены в тезисах, представленных в сборниках трудов национальных, Всероссийских и международных конференций и конгрессах, в том числе: Пятом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1995), Шестом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996), Юбилейной международной научной конференции «Грипп -XXI век» (С.-Петербург, 1997), Всероссийской научной конференции «От Materia Medica к современным медицинским технологиям» (С.-Петербург, 1998), Eropean Respiratory Society Annual Congress (Geneva, 1998), Восьмом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1998), Девятом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва 1999), World Congress on Lung Health and 10 E.R.S. Annual Congress, (Florence, 2000), 11 European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases, (Istanbul, 2001), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2001), Девятом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2002), Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004), Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (С.-Петербург, 2011).
Материалы исследования были доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.А.Смородинцева «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2001), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 35-летию НИИ гриппа РАМН «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2002), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (С.-Петербург, ноябрь 2004), Четырнадцатом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), заседании Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (С.-Петербург, 2003 и 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 статей (из них 16 - в журналах, рекомендованных ВАК), и 23 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав изложения результатов собственных исследова-
